Descifrar Caminos axonal de los grupos definidos genéticamente las neuronas en el tubo neural del polluelo Utilizando In ovo La electroporación

Hola, soy Ham del laboratorio del Dr. Review Klar en el departamento de neurobiología médica de la Universidad Hebrea de Jerusalén. Hola, soy Sophie Esman y también soy de un laboratorio de Lars. Hoy te vamos a mostrar un procedimiento para Innovo, electroporación y preparación de libro abierto de médula espinal.

Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar las trayectorias axonales de poblaciones neuronales genéticamente definidas en la médula espinal embrionaria. Así que comencemos. Para comenzar este procedimiento, transfiera los huevos de gallina leghorn blancos fertilizados a temperatura ambiente a una incubadora humidificada, preferiblemente con bandejas mecedoras a 37 a 38 grados centígrados.

Es importante controlar la temperatura y la humedad del incubador para obtener embriones viables y sincronizados. Los embriones de pollo se electroporan cuando han alcanzado la etapa 18 a 20 de hamburguesa y Hamilton o HH, que es una etapa óptima para la expresión específica de la dependencia del potenciador. En esta etapa, la cabeza se encuentra en ángulo recto con el tronco.

También en la etapa de HH 18 a 20, también se debe observar un vasto conjunto de vasos sanguíneos embrionarios adicionales, como los vasos de la línea vital anterior, posterior derecha e izquierda. Los embriones de pollo alcanzan la etapa HH 19 a 20 después de 66 horas de incubación, y en ese momento retiran los huevos de la incubadora Después de retirar los huevos, colóquelos horizontalmente y espere de cinco a 10 minutos. El embrión se encuentra ahora en el polo superior del óvulo.

Antes de la electroestimulación, los embriones preparan la solución de Hank con 100 unidades por mililitro de penicilina y 0,1 miligramos por mililitro de estreptomicina. Prepare una mezcla deseada de ADN de dos a cinco microgramos por microlitro y agregue unos pocos granos del tinte verde rápido para una fácil visualización del ADN inyectado. Tenga a mano una pipeta bucal, una aguja de jeringa estéril, unas tijeras pequeñas y una cinta adhesiva.

Prepare los microcapilares tirando de capilares de vidrio de 0,5 milímetros de diámetro con un extractor de pipetas. Coloque los electrodos de tungsteno en los micromanipuladores y conecte los electrodos al generador de pulsos. Ajuste el voltaje del generador de pulsos a menos 30 voltios, la longitud de cada pulso a 50 milisegundos y el número de pulsos a tres.

Proceda a la electroporación antes de exponer y manipular los embriones. Inserte una jeringa en el polo estrecho del huevo y retire de cinco a seis mililitros de albúmina de cada huevo. Se retira la albúmina para evitar que se derrame.

Al cortar el en el siguiente paso, use las tijeras pequeñas para cortar. Abra una ventana ovalada en la parte superior del huevo después de revelar el embrión de pollo, humedézcalo con 0,5 a un mililitro de madejas y solución de estreptomicina de penicilina. A continuación, utilice un perpeto bucal para cargar el microcapilar de vidrio.

Con una mezcla de colorante de ADN, un microcapilar del diámetro correcto debería cargarse fácilmente con ADN. Bajo una posición binocular el embrión para inyectar el ADN en el tubo neural. Coloca el embrión con la cola hacia ti.

En esta etapa de desarrollo, la médula espinal es claramente visible y, por lo tanto, no se requieren técnicas de contraste. La médula espinal está sellada tanto en la cabeza como en el extremo de la cola. Sin embargo, con las perforaciones microcapilares más agujeros en el tubo neural y penetran en un ángulo poco profundo, un microcapilar que sea lo suficientemente delgado y del diámetro correcto debería penetrar en el tubo sin dañarlo.

Inyecte el ADN usando un perpeto bucal. Un microcapilar del diámetro correcto debería liberar el ADN con una exhalación regular. El tinte verde debe extenderse desde la punta de la cola hasta las vesículas del cerebro en desarrollo.

Inyecte hasta que el tubo neural se llene de ADN, primero se requiere electroporación para que el ADN inyectado ingrese a las células. Coloque los electrodos en paralelo al tubo neural y lo más cerca posible de él sin tocar el tubo en sí. Asegúrese de que los electrodos estén cubiertos con líquido para permitir la conductividad eléctrica durante el pulso.

Por lo general, la solución de Hank añadida inmediatamente después de exponer el embrión es suficiente. Pero si no hay una gota de la solución de Hank justo antes del pulso con los electrodos colocados y sumergidos en el pulso líquido para funcionar eléctricamente, entonces retire con cuidado los electrodos y selle la ventana y el huevo con cinta adhesiva. Es importante sellar el óvulo por completo para evitar que el embrión se seque durante el siguiente período de incubación.

Vuelva a colocar el huevo en la incubadora e incube hasta que el embrión de pollito alcance el desarrollo embrionario. Día seis o E seis, cuando es el momento de la toma de imágenes cuando el embrión electroporado ha alcanzado el desarrollo embrionario. Día seis, E seis tres días después de la electroporación, retírelo del huevo y colóquelo en una placa de Petri recubierta de silicona que contenga PBS con unas tijeras finas.

Corta las membranas y estira el embrión en su lado ventral usando alfileres empujados en la silicona para mantenerlo en su lugar. Usando un micro capilar de tungsteno afilado. Haz una incisión longitudinal a lo largo de la placa del techo desde el cerebro posterior hasta la cola.

Realice dos incisiones longitudinales adicionales en ambos lados de la médula espinal, separando los ganglios de la raíz dorsal o DRG de la médula espinal. Separe la placa del piso del tejido desde la cola hasta el cerebro posterior, dejando la médula espinal intacta. Finalmente, use unas tijeras finas para cortar la médula espinal en una sección transversal en el cerebro posterior y separe la médula espinal del cuerpo.

Ahora que se ha aislado la médula espinal, extiéndala en una nueva placa de Petri recubierta de silicona que contenga PBS usando alfileres para sostenerla desde el cerebro posterior hasta la cola, produciendo una preparación de montaje plano. Fijar la médula espinal en paraldehído al 4% en PBS durante una hora a temperatura ambiente con tinción inmunológica siguiendo el procedimiento de inmunohistoquímica, protocolo escrito detallado y adjunto para montar la médula espinal abierta. Preparación de libros para imagenología.

Extienda grasa o silicona en forma de rectángulo en un portaobjetos y gotee PBS dentro del rectángulo. Use pinzas para colocar la médula espinal, estire la mitad del rectángulo y extraiga el líquido a su alrededor. Con una pasta por mascota, coloque una o dos gotas de medios de montaje en la médula espinal y cúbrala con un cubreobjetos.

Aplique presión sobre el cubreobjetos. Para evitar burbujas de aire. Mantenga las diapositivas a oscuras a cuatro grados centígrados.

Inspeccione la médula espinal con microscopía confocal. Aquí hay algunos resultados representativos de los rechazos axonales de las interneuronas espinales de pollo en experimentos de control donde RFP se expresa en todas las neuronas utilizando un elemento potenciador ubicuo de CMV, la mayoría de las neuronas y sus axones están marcados. Es imposible descifrar el trayecto axonal de las subpoblaciones neuronales.

Sin embargo, cuando se aplican elementos de mejora específicos, se revela una vía axonal definida de una subpoblación específica DI dos neuronas en este ejemplo. Así que acabamos de mostrarte cómo electrooperar un tubo neural de la mejilla con un potenciador neuronal específico en E tres y cómo preparar una médula espinal de libro abierto en E seis. Cuando realice este procedimiento, debe recordar ser cuidadoso y paciente.

Así que esto es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos. Buena suerte.