El aislamiento de lábil Multi-complejos de proteínas por In vivo Control Celular entrecruzamiento y Inmuno-cromatografía de afinidad magnética

Para la reticulación, seguida de inmunoprecipitación. Incubar las células en una densidad del 80 al 90 % con un milimolar de DSP frío en hielo en tampón PBS, sin calcio, magnesio ni DMSO.

Control con vehículo. El DSP es un crosslinker homobifuncional permeable a la membrana y reductible que une covalentemente grupos libres situados a menos de 12 angstroms uno del otro. Tras la reticulación, las células se lisan y se realizan inmunoprecipitaciones utilizando controles estándar.

Los complejos proteicos se separan entonces mediante electroforesis SDS-PAGE en condiciones reductoras, en las que los agentes reductores escinden el DSP, permitiendo la identificación de proteínas individuales mediante inmunotransferencia. Hola, soy Stephanie Ick del laboratorio del Dr. Victor Fonde en el Departamento de Biología Celular de la Universidad Emory. Y yo soy Pearl Ryder, también del laboratorio Fonde.

Hoy les mostraremos un procedimiento para el aislamiento de complejos de myprotein mediante la reticulación controlada seguida de cromatografía de afinidad inmuno magnética. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar interacciones proteicas transitorias y lábiles. Así que comencemos.

Comience etiquetando la parte inferior de las placas de células para indicar el tipo celular y la condición experimental específica. Un símbolo positivo aquí indica que el tratamiento con DSP incluye un control negativo con vehículo solo de DMSO. Añada medio a las placas para prepararlas para la siembra celular.

Células HEK sembradas con una dilución de uno a cinco para permitir el aislamiento de 500 microgramos de proteína por reacción estándar en tubo. Un solo tubo puede ser suficiente para identificar los posibles socios de unión de una proteína de interés mediante inmunotransferencia a partir del análisis de espectrometría de masas. Aumente el número de reacciones estándar al menos diez veces.

Prepare también soluciones patrón de la mayoría de las soluciones utilizadas en el experimento de reticulación. Estas incluyen PBS suplementado con cloruro de calcio 0,1 milimolar y cloruro de magnesio 1 milimolar, denominado PBS calcio-magnesio. La adición de iones de calcio y magnesio es fundamental para la adhesión de las células a la placa de cultivo.

Durante el transcurso del experimento, almacene la solución a cuatro grados Celsius. Otros reactivos incluyen la solución de inhibición del entrecruzador, el cóctel de inhibidores de proteasas completo 50 X, que se agita en vórtex cada 20 minutos hasta que el precipitado se disuelve. Tritan X-100 al 20 %, que se almacena a cuatro grados Celsius y debe usarse dentro de un mes, y soluciones tampón A 10 x y 1 x.

Preparar y almacenar todas las soluciones según se detalla en el protocolo escrito adjunto. Finalmente, preparar el tampón de lisis compuesto por tampón 1 X con 0,5 % TRITON X-100 y tampón de precipitación inmunomagnética o tampón IP compuesto por tampón 1 X.

Añada 0,1 % de TRITTON X-101 dos días después de sembrar las células, que deben tener una confluencia del 80 al 90 %, lo cual es óptimo para la reticulación. En condiciones de alta confluencia, las células tienden a acumularse unas sobre otras, lo que reduce la accesibilidad del reticulador permeable a todas las células. Devuelva las placas al incubador hasta que estén listas para la reticulación.

Prepare la solución de entrecruzador DSP inmediatamente antes de aplicarla a las células. El DSP es altamente hidrófobo y, por lo tanto, se disuelve en DMSO hasta una concentración de 100 milimolar antes de diluirlo en el tampón PBS con calcio y magnesio. Para mejorar aún más la dilución del DSP en el tampón PBS con calcio y magnesio, caliente un volumen adecuado y agregue 10 microlitros de la solución stock de DSP en DMSO.

Por cada mililitro de PBS tibio con calcio y magnesio, agregue la solución stock de D-S-P-D-M-S-O gota a gota con mezclado repetido hasta que todo el DSP se haya disuelto. Además, prepare una solución control de vehículo con 10 microlitros de DMSO por cada mililitro de PBS con calcio y magnesio. Después de diluir el DSP, mantenga todas las soluciones de PBS con calcio y magnesio en un baño de hielo y agua durante no más de 10 minutos.

A continuación, prepare un baño de agua con hielo que pueda contener todas las placas utilizadas en el experimento. Saque las placas de cultivo que contienen las células del incubador a 37 grados Celsius y colóquelas inmediatamente en el baño de agua con hielo. Lave las células dos veces con PBS frío con calcio y magnesio, utilizando los mismos volúmenes preparados anteriormente para la incubación con el agente de entrecruzamiento; para una placa de seis pocillos, calcule dos mililitros por pocillo, y así sucesivamente.

Después del segundo lavado, agregue al cultivo celular bien el control vehículo, que es el DMSO disuelto en tampón, o la solución tampón de reticulación con DSP, e incube en hielo durante dos horas. Verifique aproximadamente cada 20 minutos para asegurarse de que todas las células estén cubiertas por la solución. Si algunas células quedan expuestas, incline y gire la placa para volver a cubrirlas uniformemente. Es normal que una pequeña cantidad de DSP precipite.

Durante la incubación de dos horas con las células, antes de que finalice esta incubación, prepare una solución de amortiguación de un XDSP diluyendo el reactivo en PBS con calcio y magnesio. Mantenga la solución en hielo hasta usarla para detener la reacción de reticulación mediante la inactivación del DSP que no ha reaccionado. Cuando se completen las dos horas, retire el control vehicular y las soluciones de reticulación de las células.

Añada la solución de enfriamiento DSP fría con hielo e incube en hielo durante 15 minutos. Mientras tanto, diluya el stock del cóctel completo de inhibidores de proteasas uno a 50 en el tampón de lisis celular. Una vez transcurridos los 15 minutos, lave las células dos veces con PBS con calcio y magnesio.

Luego, agregue el tampón de lisis que contiene los inhibidores de proteasas a las células y agite a cuatro grados Celsius durante 30 minutos. Después de 30 minutos de lisis celular, use un raspador celular para recoger las células de la placa. Asegúrese de mantener los lisados sobre hielo para minimizar la actividad de las proteasas.

Centrifugar los lisados celulares durante 15 minutos a cuatro grados Celsius en una microcentrífuga de banco a velocidad máxima de 15.000 G. Pipetear el sobrenadante a un tubo nuevo y desechar el precipitado. Analizar los niveles de proteína utilizando el ensayo de Bradford y proceder con la inmunoprecipitación. Comenzar a prepararse para la inmunoprecipitación inmediatamente después de iniciar la reacción de reticulación de dos horas en tubos de microcentrífuga con tapa roscada.

Combine 30 microlitros de perlas inmunomagnéticas anti IgG con 500 microlitros de tampón IP. Añada el anticuerpo contra el objetivo de interés. La cantidad adecuada de anticuerpo debe determinarse para cada antígeno individual.

En experimentos preliminares, los posibles controles negativos para las perlas incluyen sin anticuerpo, perlas y perlas con anticuerpo de control isotípico para unir el anticuerpo de IP a las perlas magnéticas. Incubar en un agitador rotatorio durante dos horas a temperatura ambiente. Al final de la incubación, centrifugar brevemente los tubos y colocarlos en el soporte magnético. Las perlas se concentrarán en el lado del imán.

Elimine la solución que contiene anticuerpos no unidos e inmediatamente lave los perlas para evitar que se sequen. Después de dos lavados, agregue 500 microlitros de un microgramo por mililitro de lisado de células DSP negativas o DSP positivas a los tubos correspondientes. En esta etapa, se puede preparar un control negativo de competencia con péptido añadiendo el péptido inmunogénico a una concentración determinada en experimentos preliminares a la mezcla de lisado y perlas.

Otro control negativo posible que se puede preparar en esta etapa es una reacción solo con tampón o sin lisado, preparada mediante la adición de solo 500 microlitros de tampón de lisis a las perlas. Suspender suavemente las perlas para las reacciones experimentales y de control. No vortexar, ya que esto provocaría la ruptura de las perlas; incubar a cuatro grados con rotación de extremo a extremo durante dos horas.

Al final de dos horas, retire el lisado utilizando el soporte magnético. Haga una centrifugación rápida y lave las perlas un total de seis veces con un mililitro de tampón IP. Incube cada lavado a cuatro grados Celsius durante cinco minutos.

Para eluir los complejos retenidos, agregue un volumen de tampón de muestra para geles al tubo de inmunoprecipitación justo encima del pellet de perlas. Para agrupar las perlas en la parte inferior del tubo, golpee suavemente la base del tubo para lograr que todas las perlas se resuspendan en el tampón de muestra para geles. Alternativamente, para el aislamiento por afinidad inmunoquímica, agregue 30 microlitros de tampón suplementado con el péptido inmunogénico a las perlas.

La concentración requerida del péptido inmunogénico se determina empíricamente. Después de probar un rango de 10 a 200 micromolares, incubar las perlas a cuatro grados durante dos horas, agitando los tubos cada 30 minutos. Utilizar el soporte magnético para retirar los 30 microlitros que contienen los complejos eluidos y guardarlos en un tubo limpio, lavar con tampón IP y conservar las perlas.

Añada un tampón de muestra para gel al 1x a las perlas para ambos métodos de elución. Caliente las perlas inmunomagnéticas re-suspendidas en tampón de muestra para gel a 75 grados Celsius durante cinco minutos, además de desnaturalizar las proteínas. Este paso también escindirá la molécula de DSP, lo que permitirá resolver las proteínas individuales en la electroforesis del complejo.

Las muestras en un gel de electroforesis SDS-PAGE para inmunotransferencia. Las perlas inmunomagnéticas vacías pueden ser separadas mediante centrifugación y eliminadas de la muestra con un soporte magnético antes de la carga. Si el ensayo de inmunoadsorción está libre de IgG tanto por tinción proteica en SDS-PAGE como por inmunotransferencia, es adecuado para espectrometría de masas.

Aquí se muestra un ejemplo de un inmunotransferencia de proteínas procedentes de lisados celulares con entrecruzamiento y sin entrecruzamiento, seguido de precipitación inmunomagnética utilizando un anticuerpo monoclonal contra la subunidad tres del AP. El entrecruzamiento con delta permite la detección de proteínas interaccionantes que no se observan en muestras sin entrecruzamiento durante los aislamientos inmunomagnéticos. Los controles negativos no mostraron captura específica de proteínas utilizando un control sin anticuerpo y un control de isotipo de anticuerpo coincidente con IgG dirigida contra el receptor de transferrina, tanto para muestras sin entrecruzamiento como con entrecruzamiento.

En este ejemplo, se utilizó la elución con péptido de afinidad para recuperar las proteínas unidas al anticuerpo de inmunoprecipitación. Observe que el anticuerpo inmuno está ausente en la fracción del sobrenadante y permanece en la fracción del precipitado durante la elución con péptido. Acabamos de mostrarle cómo aislar complejos MultiPro lábiles utilizando el entrecruzador químico DSP, seguido de purificación por afinidad inmuno magnética.

Al realizar este procedimiento, es importante mantener las soluciones celulares y los lisados fríos para conservar las interacciones inestables durante el entrecruzamiento y minimizar la actividad de las proteasas. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.