El aislamiento de lábil Multi-complejos de proteínas por In vivo Control Celular entrecruzamiento y Inmuno-cromatografía de afinidad magnética

Para la reticulación, seguida de inmunoprecipitación. Las células de procedimiento a una densidad de 80 a 90% se incuban con un milimolar helado. DSP en PBS, calcio, magnesio o DMSO solamente.

Control de vehículos. DSP es un reticulante homo bifuncional permeable y reducible que se retiñe libre y significa dentro de 12 angstroms entre sí. Las siguientes células reticuladas se lisan y las inmunoprecipitaciones se realizan utilizando controles estándar.

A continuación, los complejos proteicos se resuelven reduciendo la página de SDS, reduciendo el DSP escindido de los agentes, lo que permite la identificación de proteínas individuales mediante inmunotransferencia. Hola, soy Stephanie Ick del laboratorio del Dr. Victor Fonde en el Departamento de Biología Celular de la Universidad de Emory. Y yo soy Pearl Ryder, también del laboratorio Fonde.

Hoy vamos a mostrar un procedimiento para el aislamiento de complejos de myprotein mediante reticulación controlada seguida de cromatografía de afinidad inmunomagnética. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar las interacciones transitorias de las proteínas lábiles. Así que comencemos.

Comience etiquetando la parte inferior de las placas celulares para indicar el tipo de célula y la condición experimental específica. Un símbolo positivo aquí indica que el DSP tratado incluye un control de vehículo solo DMSO negativo. Agregue medios a las placas para prepararlas para la placa de siembra de células.

Células HEK sembradas en una dilución de uno a cinco para permitir el aislamiento de 500 microgramos de proteína por reacción de tubo estándar. Un solo tubo puede ser suficiente para identificar los supuestos socios de unión de una proteína de interés mediante inmunotransferencia a partir de un análisis de espectrometría de masas. Aumente el número de reacciones estándar al menos 10 veces.

También prepare tallos de la mayoría de las soluciones utilizadas en el experimento de reticulación. Estos incluyen PBS suplementado con cloruro de calcio 0,1 milimolar y cloruro de magnesio un milimolar denominado PBS calcio magnesio. La adición de iones de calcio y magnesio es fundamental para la adhesión de las células a la placa de cultivo.

Durante el transcurso del experimento, almacene la solución a cuatro grados centígrados. Otras existencias incluyen el cóctel completo de inhibidores de proteasa 50 X de solución de enfriamiento de reticulación, que es un vórtice cada 20 minutos hasta que se disuelve el pellet. 20%Tritan X 100, que se almacena a cuatro grados centígrados y debe usarse dentro de un mes y 10 x y una x soluciones tampón.

Prepare y almacene todas las soluciones como se detalla en el protocolo escrito adjunto. Finalmente, prepare el tampón de lisis compuesto por un tampón X. Un 0,5% más TRITTON X 100 y un tampón de precipitación inmunomagnética o tampón IP compuesto por un tampón X.

Un más 0,1%TRITTON X 101 a dos días después de la siembra, las células tienen una fluidez del 80 al 90%, lo que es óptimo para la reticulación. En condiciones de alta fluidez, las células tienden a apilarse unas sobre otras, lo que provoca una disminución de la accesibilidad del reticulante permeable de la célula a todas las células. Vuelva a colocar las placas en la incubadora hasta que estén listas para la reticulación.

Prepare la solución de reticulante DSP inmediatamente antes de aplicarla a las celdas. El DSP es altamente hidrofóbico y, por lo tanto, se disuelve en DMSO a una concentración de 100 milimolares antes de diluirse en el tampón de calcio y magnesio PBS. Para mejorar aún más la dilución de DSP en el tampón de calcio y magnesio PBS, caliente y con el volumen adecuado, agregue 10 microlitros de la solución madre de DSP y DMSO.

Por cada mililitro de magnesio cálcico PBS tibio, agregue la solución madre D-S-P-D-M-S-O gota a gota con mezclas repetidas hasta que todo el DSP se haya disuelto. Además, prepare una solución de control del vehículo de 10 microlitros de DMSO por cada mililitro de calcio y magnesio PBS. Después de diluir el DSP, mantenga todas las soluciones de calcio y magnesio de PBS en un baño de agua helada durante no más de 10 minutos.

A continuación, prepare un baño de agua helada que contendrá todas las placas utilizadas en el experimento. Proceda a tomar las placas de cultivo que contienen las células de la incubadora a 37 grados centígrados y colóquelas inmediatamente en el baño de agua helada. Lavar las celdas dos veces con PBS calcio magnesio helado, utilizando los mismos volúmenes preparados previamente para la incubación con el reticulante para seis, placa de pocillo calcular dos mililitros por pocillo y así sucesivamente.

Después del segundo lavado. Agregue el control del vehículo, que es el DMSO disuelto en tampón o la solución tampón de reticulación DSP a las celdas incube en hielo durante dos horas y verifique aproximadamente cada 20 minutos para asegurarse de que todas las celdas estén cubiertas por la solución. Si algunas células quedan expuestas, incline y gire el plato para cubrirlas uniformemente nuevamente, es normal que precipite una pequeña cantidad de DSP.

Durante las dos horas de incubación con las células antes de que termine la incubación de dos horas, prepare una solución de enfriamiento XDSP diluyendo el tallo en PBS calcio y magnesio. Mantenga la solución en hielo hasta que se use para detener la reacción de reticulación inactivando el DSP que no ha reaccionado. Cuando pasen las dos horas, retire las soluciones de control del vehículo y reticulación de las celdas.

Agregue la solución de enfriamiento DSP helada e incube en hielo durante 15 minutos. Mientras tanto, diluya el cóctel completo de inhibidores de proteasa de uno a 50 en el tampón de lisis celular. Una vez transcurridos los 15 minutos, lave las células dos veces con PBS calcio y magnesio.

A continuación, añada el tampón de lisis que contiene los inhibidores de la proteasa a las células y mece a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Después de 30 minutos de lisis celular, use un raspador de células para recolectar las células de la placa. Asegúrese de mantener los lisados en hielo para minimizar la actividad de la proteasa.

Haga girar la célula lisada durante 15 minutos a cuatro grados centígrados en una mini centrífuga de sobremesa a una velocidad máxima de 15.000 Gs. Pipetee el sobrenadante en un tubo nuevo y deseche el pellet. Analice los niveles de proteínas utilizando el ensayo de Bradford y proceda con la inmunoprecipitación. Comience a prepararse para la inmunoprecipitación inmediatamente después de iniciar la reacción de reticulación de dos horas en tubos de microcentrífuga con tapa de rosca.

Combine 30 microlitros de perlas inmunomagnéticas anti IgG con 500 microlitros de tampón IP. Agregue el anticuerpo contra el objetivo de interés. Se debe determinar la cantidad apropiada de anticuerpo para cada antígeno individual.

En experimentos preliminares, los posibles controles negativos para las perlas incluyen la ausencia de anticuerpos, las perlas y las perlas de anticuerpos de control de isotipos para unir el anticuerpo IP a las perlas magnéticas. Incubar en un balancín final durante dos horas a temperatura ambiente Al final de la incubación, gire rápidamente los tubos y deslícelos en el soporte magnético. Las cuentas se concentrarán en el lado del imán.

Retire la solución que contiene anticuerpos no unidos y lave inmediatamente las perlas para evitar que se sequen. Después de dos lavados, agregue 500 microlitros de un microgramo por mililitro de lisado celular DSP negativo o DSP positivo a los tubos apropiados. En esta etapa se puede preparar un control negativo de competencia peptídica agregando el péptido inmunogénico a una concentración determinada en experimentos preliminares a la mezcla de perlas de lisado.

Otro posible control negativo preparado en esta etapa es una reacción de solo tampón o sin lisado preparada agregando 500 microlitros de tampón de lisis solo a las perlas. Vuelva a suspender suavemente las perlas para las reacciones experimentales y de control. No haga vórtices, ya que esto hará que las cuentas se rompan, incube a cuatro grados con rotación de extremo a extremo durante dos horas.

Al cabo de dos horas, retire el lisado con el soporte magnético. Gire y lave rápidamente las cuentas un total de seis veces con un mililitro de tampón IP. Incubar cada lavado a cuatro grados centígrados durante cinco minutos.

Para eludir los complejos unidos, agregue un tampón de muestra de gel x al tubo IP justo encima de la bolita de perla. Para agrupar las perlas en la parte inferior del tubo, golpee suavemente la parte inferior del tubo para resuspender todas las perlas en el tampón de muestra de gel. Alternativamente, para el aislamiento de inmunoafinidad a 30 microlitros de tampón a suplementado con el péptido inmunogénico a las perlas.

La concentración requerida del péptido inmunogénico se determina empíricamente. Después de probar un rango de 10 a 200 micromolares, incube las perlas a cuatro grados durante dos horas, golpee los tubos cada 30 minutos. Utilice el soporte magnético para eliminar los 30 microlitros que contienen los complejos eludidos y guarde en un lavado de tubo limpio con tampón IP y guarde las perlas.

Agregue un tampón de muestra de gel x a las perlas para ambos métodos de elución. Calentar las perlas inmunomagnéticas resuspendidas en tampón de muestra de gel a 75 grados centígrados durante cinco minutos, además de desnaturalizar las proteínas. Este paso también permitirá la solución de la molécula DSP, lo que permitirá resolver las proteínas individuales en la ejecución compleja.

Las muestras en un gel de página SDS para Western blot. Las perlas inmunomagnéticas vaciadas pueden ser repelidas por centrifugación y retiradas de la muestra con un soporte magnético antes de la carga. Si la EUA de inmunoafinidad está libre de IgG tanto por tinción de proteínas de la página SDS como por inmunotransferencias, es adecuado para espectrometría de masas.

A continuación, se muestra un ejemplo de un Western blot de material procedente de lisado celular reticulado y no reticulado, seguido de precipitación inmunomagnética utilizando un anticuerpo monoclonal contra la subunidad AP tres. La reticulación delta permite la detección de proteínas interactuantes que no se ven en muestras no reticuladas durante los aislamientos inmunomagnéticos. Los controles negativos no mostraron un tirón de proteínas específicas utilizando un control sin anticuerpos y con un control emparejado con el isotipo de anticuerpos utilizando una IgG dirigida contra el receptor de transferrina tanto para las muestras reticuladas como para las no reticuladas.

En este ejemplo, se utilizó la elución del péptido de afinidad para recuperar las proteínas unidas al anticuerpo IP. Observe que el anticuerpo inmunológico está ausente en la fracción supernata y permanece en la fracción de batido durante la elución del péptido. Acabamos de mostrarle cómo aislar complejos MultiPro lábiles utilizando el reticulante químico DSP, seguido de la purificación por afinidad inmunomagnética.

Al realizar este procedimiento, es importante mantener las soluciones celulares y los lisados refrigerados para mantener las interacciones lábiles durante la reticulación y minimizar la actividad de la proteasa. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.