Desarrollo de la imagen y el análisis automatizado de pantallas de química de pez cebra.

En este video, se realiza un cribado de alto contenido basado en imágenes para evaluar la modulación mediante moléculas pequeñas de la vía de la quinasa MAP del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos. En embriones de pez cebra transgénicos, se aparean machos transgénicos y hembras silvestres en una jaula de apareamiento. Los huevos fertilizados caen al fondo y se recogen y transfieren a una placa de Petri. Los embriones se incuban durante la noche y luego se colocan en pozos individuales de una placa de fondo redondo de 96 pozos.

Se añade la molécula pequeña BCI para hiperactivar la señalización de FGF y se incuba la placa durante seis horas. Se capturan imágenes de cada pozo con un lector de placas confocal y se analizan mediante un algoritmo diseñado por nosotros que informa las intensidades fluorescentes en estructuras embrionarias específicas. Hola, soy Hiba Kado del laboratorio del Dr. Michael Chang en el Departamento de Microbiología y Genética Molecular de la Universidad de Pittsburgh.

Hola, soy Andrea Spock del Instituto de Descubrimiento de Fármacos de la Universidad de Pittsburgh. Hoy les mostraremos el procedimiento para criar, seleccionar y disponer embriones de pez cebra para su tratamiento químico. En una placa de 96 pocillos, utilizaremos embriones transgénicos que informan sobre las actividades del factor de crecimiento de fibroblastos y que serán tratados con una molécula que hiperactiva esta vía.

Le mostraremos cómo utilizamos la metodología de cribado de alto contenido para adquirir, analizar y cuantificar automáticamente la actividad del factor de crecimiento de fibroblastos en embriones transgénicos de pez cebra. Este procedimiento destacará la tecnología de plataforma para utilizar peces cebra transgénicos y cribados químicos de alto rendimiento. Así que comencemos.

Dos días antes del tratamiento, identifique los peces cebra transgénicos macho homocigotos y colóquelos en tanques de apareamiento individuales. Añada separadores a los tanques, luego agregue un pez hembra de tipo silvestre a cada tanque y deje los peces en las jaulas de apareamiento durante la noche a 28 grados Celsius. A la mañana siguiente, retire el separador. Después de una hora, traslade los peces a un nuevo tanque y vierta los embriones en un tamiz de plástico.

Transfiera los embriones a placas de 100 milímetros con solución E tres e incube a 28 grados Celsius durante seis a ocho horas. Tras la incubación, examine los embriones bajo un microscopio estereoscópico. Los embriones adecuados para experimentos estarán experimentando gas.

En este momento, retire cualquier embrión no fertilizado, que permanecerá en la etapa de célula única. Asimismo, elimine los embriones no viables que presenten opacidad o malformación. A continuación, agregue solución E tres fresca e incube durante la noche a 28 grados Celsius.

Al día siguiente, coloque los embriones bajo un microscopio estereoscópico fluorescente para clasificar los embriones transgénicos según una etapa similar y una expresión uniforme de GFP. Los embriones a las 24 HPF muestran un límite visible entre el cerebro medio y el rombencéfalo, con una intensa expresión de GFP y ojos bien formados que presentan retinas dorsales positivas para GFP. Estos embriones son activos y se moverán y retorcerán dentro de su corión utilizando una pipeta Pasteur de plástico.

Transfiera los embriones de 24 HPF uno por uno a pozos individuales de una placa de 96 pozos. Utilizando una micropipeta, retire cualquier exceso de solución E tres de los pozos. Luego, usando una pipeta multicanal, agregue 200 microlitros de solución E tres a cada pozo.

A continuación, añada dos microlitros de DMSO a todos los pocillos de las columnas uno y 12. Luego añada dos microlitros de BCL preparado en DMSO de la siguiente manera: uno micromolar a las columnas dos y siete, cinco micromolar a las tres y ocho, 10 micromolar a las cuatro y nueve, 20.

De micromolar a las columnas cinco y diez. Y finalmente, 25 micromolar a la columna seis y once. Ahora cubra la placa con papel de aluminio e incúbela durante seis horas a 28 grados Celsius.

Añada 10 microlitros de trica a cada pocillo para anestesiar los embriones de 30 HPF. Luego cargue la placa en el software molecular devices image express ultra open meta express. Elija una configuración con un objetivo Forex y el diámetro máximo de diafragma.

Configure el enfoque automático del láser para detectar la base de la placa y utilice un desplazamiento Z óptimo predeterminado. Para detectar las regiones de interés, establezca el área de escaneo como un único sitio de 2000 por 2000 píxeles sin superposición. Seleccione el tipo de placa adecuado y el láser de argón de 488 nanómetros con longitudes de onda de excitación y emisión de 488 sobre 525 nanómetros.

Luego, seleccione un pocillo que contenga un embrión tratado con vehículo y haga clic en encontrar muestra. El instrumento realizará un escaneo de enfoque automático y adquirirá una única imagen para confirmar la correcta adquisición de la imagen. Seleccione al azar un pocillo tratado con vehículo y adquiera una imagen.

Si la imagen está enfocada y muestra expresión de GFP en la cabeza. Coloque el cursor sobre las áreas más brillantes y verifique que la intensidad de fluorescencia esté dentro del rango de la cámara de 16 bits. Menos de 65,000 unidades.

Repita estos pasos con otro control de vehículo y algunas pocas pocetas tratadas con el compuesto. Si es necesario, ajuste la potencia del láser y la ganancia de modo que las regiones más brillantes en las imágenes del control positivo no se saturen. A continuación, en la ventana de adquisición de placa y control, elija adquirir placa para comenzar el escaneo de la placa.

El instrumento adquirirá automáticamente una imagen por pocillo para toda la microplaca y las archivará en una base de datos de servidor SQL. Una vez finalizada la exploración, cargue las imágenes en D definition's. Developer abriendo Developer con la opción slinger habilitada.

Cree un área de trabajo nueva. Luego, en el menú de archivo, seleccione la importación personalizada. A continuación, navegue hasta la carpeta que contiene las imágenes y abra un archivo de muestra.

Seleccione un filtro de importación que reconozca el formato de imagen y la estructura de archivo generados por la plataforma molecular Devices Image Express Ultra. Para procesar las imágenes, abra ahora una imagen de control y cargue la tecnología de red de cognición deseada, o algoritmo CNT, o conjunto de reglas. El algoritmo personalizado utilizado aquí está diseñado para identificar automáticamente el embrión, la yema y la cabeza, y para cuantificar el brillo y el área de las estructuras de la cabeza que expresan GFP; ejecute el conjunto de reglas hasta la etapa de detección de la cabeza y la yema.

Para garantizar la asignación correcta de la vesícula vitelina y la cabeza, modifique el conjunto de reglas para ajustar el umbral de detección de la vesícula vitelina si esta es demasiado grande o demasiado pequeña. A continuación, ejecute el conjunto de reglas hasta la etapa de detección de estructuras brillantes de la cabeza. Para asegurar la asignación adecuada de las áreas que expresan GFP en la cabeza, modifique el conjunto de reglas para ajustar el umbral de detección de las estructuras de la cabeza en múltiplos de intensidad mínima hasta que la detección de las estructuras brillantes de la cabeza coincida con la observación visual.

A continuación, ejecute manualmente todo el conjunto de reglas en varias imágenes seleccionadas al azar generadas a partir de embriones tratados con vehículo y en imágenes de control positivo provenientes de embriones tratados con PCI. Para ejecutar el algoritmo en todas las imágenes de la placa, seleccione las placas que desea analizar y elija. Analice, luego navegue hasta el conjunto de reglas optimizado y analice todos los pocillos.

Mediante el programador de tareas integrado, los pocillos vacíos o las imágenes ambiguas se excluirán automáticamente del análisis durante el escaneo. Se muestra un mapa de exclusión actualizado continuamente. Tanto los datos como las imágenes están disponibles durante la ejecución para su inspección visual.

Los datos numéricos y las imágenes procesadas se guardan automáticamente. Una vez que se han analizado todas las imágenes, los datos pueden exportarse a software de terceros como Excel, GraphPad o Prism. Esta figura muestra imágenes de escaneo archivadas de un pocillo tratado con vehículo y otro tratado con BCI, con y sin análisis de CNT.

La proteína verde fluorescente aplicada o GFP se detecta en el ojo, en el límite entre el cerebro medio y el cerebro posterior, y en los ganglios trigéminos de embriones transgénicos. Obsérvese que tanto la intensidad de GFP como los dominios de expresión están ampliados. En embriones tratados con BCI aquí presentados, se observa un efecto dependiente de la dosis de BCI sobre la expresión del gen reportero GFP en embriones transgénicos.

La concentración necesaria para provocar una respuesta media máxima o EC50 fue aproximadamente de 12 micromoles. Acabamos de mostrarle cómo criar, recolectar y distribuir embriones transgénicos de pez cebra en placas de 96 pocillos. Hemos añadido concentraciones crecientes de PCI en su activador de la vía de señalización.

También hemos mostrado cómo automatizar la obtención de imágenes de embriones transgénicos y analizado las imágenes mediante un algoritmo diseñado personalizadamente basado en la tecnología de redes cognitivas. Con este enfoque, pudimos medir cuantitativamente, de manera graduada, los efectos de un activador de bajo peso molecular de la señalización del factor de crecimiento de fibroblastos. Al realizar este procedimiento, es importante recordar elegir cuidadosamente los embriones para minimizar la variabilidad entre los especímenes.

Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.