Name: Desarrollo de la imagen y el análisis automatizado de pantallas de química de pez cebra. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Aprende a realizar cribado de alto rendimiento basado en imágenes para evaluar efectos de moléculas pequeñas sobre la señalización de FGF en embriones de pez cebra transgénico. Este método automatiza la cuantificación de la expresión génica.

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Este trabajo está financiado por el NICHD / NIH (1R01HD053287) para Hukriede, NCI / NIH (P01 CA78039) a Vogt, y el NHLBI / NIH (1R01HL088016) a Tsang.

1) Establecer los apareamientos pez cebra y el tratamiento de la ICC. <ol><li> Dos días antes del tratamiento, identificar los homocigotos masculinos Tg (dusp6: d2eGFP) pt6 pez cebra y el lugar de forma individual en un tanques de apareamiento. Añadir separador y un tipo de peces silvestres AB * mujer y dejar en las jaulas de apareamiento durante la noche. </li><li> A la mañana siguiente quitar el separador, y recoger los embriones después de 1 hora. La transferencia de embriones a los platos de 100 mm con E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4), la solución y se incuba a 28 ° C durante 6 horas. Eliminar embriones muertos y sin fertilizar, agregue la solución E3 fresca, y se incuba durante la noche. </li><li> Ordenar embriones transgénicos para la etapa similar (24hpf) y la expresión de GFP uniforme. Embriones matriz de forma individual en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. </li><li> Retire el exceso de solución E3 con una micropipeta. Agregar 200μl de la solución de E3 con una pipeta de canales múltiples en cada pozo. </li><li> Añadir los siguientes compuestos como se indica: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> A </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1 mM) </td><td> 2μl BCl (2 mM) </td><td> 2μl BCl (2.5mm) </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1 mM) </td><td> 2μl BCl (2 mM) </td><td> 2μl BCl (2.5mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> B </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1 mM) </td><td> 2μl BCl (2 mM) </td><td> 2μl BCl (2.5mm) </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1 mM) </td><td> 2μl BCl (2 mM) </td><td> 2μl BCl (2.5mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> C </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1 mM) </td><td> 2μl BCl (2 mM) </td><td> 2μl BCl (2.5mm) </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1 mM) </td><td> 2μl BCl (2 mM) </td><td> 2μl BCl (2.5mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> D </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1 mM) </td><td> 2μl BCl (2 mM) </td><td> 2μl BCl (2.5mm) </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1 mM) </td><td> 2μl BCl (2 mM) </td><td> 2μl BCl (2.5mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> E </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1 mM) </td><td> 2μl BCl (2 mM) </td><td> 2μl BCl (2.5mm) </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1 mM) </td><td> 2μl BCl (2 mM) </td><td> 2μl BCl (2.5mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> F </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1 mM) </td><td> 2μl BCl (2 mM) </td><td> 2μl BCl (2.5mm) </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1 mM) </td><td> 2μl BCl (2 mM) </td><td> 2μl BCl (2.5mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> G </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1 mM) </td><td> 2μl BCl (2 mM) </td><td> 2μl BCl (2.5mm) </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1 mM) </td><td> 2μl BCl (2 mM) </td><td> 2μl BCl (2,5 millones deM) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> H </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1 mM) </td><td> 2μl BCl (2 mM) </td><td> 2μl BCl (2.5mm) </td><td> 2μl BCl (0,1 mm) </td><td> 2μl BCl (0,5 mm) </td><td> 2μl BCl (1 mM) </td><td> 2μl BCl (2 mM) </td><td> 2μl BCl (2.5mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr></tbody></table> Las concentraciones finales son 1μM, 5μM, 10μM, 20μM, 25μM BCI en DMSO al 1%. Cubrir la placa con papel de aluminio e incubar durante 6 horas a 28 ° C. </li></ol> 2) automática de imágenes de placas de 96 pozos y el análisis. <ol><li> Añadir 10μl de tricaína (0.61mM) a cada pocillo para anestesiar a los embriones 30hpf. </li><li> Plato de carga en dispositivos ultra Imagexpress molecular. </li><li> Abra el software Metaxpress. Elija una configuración con un objetivo de 4x y el diámetro del agujero de alfiler máximo, configurar láser de enfoque automático para detectar la placa inferior, y determinar óptimo plano Z para detectar regiones de interés. Adquirir imágenes en longitudes de onda de excitación / emisión de 488/525 nm (GFP). Establecer como zona de exploración de un sitio único de 2000x2000 pixeles (4 x 4 mm), sin hurgar en la basura. Configure la potencia del láser y la ganancia de tal manera que las regiones brillantes en las imágenes de control positivo no sature. Confirmar la adquisición de una imagen adecuada en varios pocillos de control positivo y negativo. </li><li> Iniciar la exploración de la placa. El instrumento automáticamente obtener imágenes de todos los pozos y los archivan en una base de datos del servidor SQL. </li><li> Cargar las imágenes en Definiens desarrollador utilizando el módulo de la aplicación Cellenger y un filtro de importación, que reconoce el formato de imagen y estructura de los archivos generados por la plataforma de dispositivos moleculares Imagexpress Ultra. </li><li> Procesar imágenes con un algoritmo diseñado a medida Cognition Network Technology (también conocida como un conjunto de reglas). El algoritmo, que a medida desarrollado en base a un conjunto de reglas ha publicado recientemente dos, está diseñado para identificar de forma automática embrión, la yema, y la cabeza, y para cuantificar el brillo y el área de las buenas prácticas agrarias que expresan las estructuras de la cabeza. Pozos en los que se detecta ningún embrión o cuando la cabeza no puede ser claramente asignado (por ejemplo, con la toxicidad de los compuestos de alta o fuera de foco imágenes) se excluyeron del análisis. Configure el algoritmo utilizando varias imágenes de control negativo (tratado con vehículo) y una imagen positiva de control (BCI tratados) de tal manera que la cabeza y la yema estén correctamente identificados en ambos. Establecer una "cabeza de las estructuras" umbral de detección como múltiplos de la intensidad media de la yema hasta la detección de las estructuras de la cabeza brillante coincide con la observación visual. Definir los parámetros para la exportación. En este ejemplo, el parámetro más informativo fue el brillo total integrado de GFP-positivas regiones dentro de la cabeza, en adelante denominado "el brillo total de la cabeza las estructuras" (Figura 1). <img src="/files/ftp_upload/1900/1900fig2.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="la figura 1"> Figura 1 Gráfico depicitng los efectos dependientes de la dosis de BCI en la expresión de GFP en embriones transgénicos. </li><li> Ejecutar el algoritmo en todas las imágenes de placas utilizando el planificador de tareas integrado. El software utiliza Definiens computación distribuida en varios procesadores ("motores"), lo que permite el análisis simultáneo de múltiples imágenes. El algoritmo calcula las medidas numéricas sobre la base de los resultados de los análisis de imágenes, que se guardan en la base de datos junto con una copia de la imagen procesada, con el análisis aplicado. </li></ol> Los resultados representativos: Después de todas las imágenes son analizadas, los datos pueden ser visualizados en Cellenger o exportarse a software de terceros (Excel, GraphPad Prism) para su posterior análisis y representación gráfica. La figura 2 muestra archivar imágenes escaneadas de un tratado con el vehículo y BCI-tratado bien, con y sin el análisis aplicado de la CNT. Figura 1 Los documentos de un efecto dosis-dependiente de BCI en la expresión del gen GFP reportero en Tg (dusp6: d2EGFP) pt6 embriones. La concentración requerida para obtener una respuesta media máxima (EC50) fue de aproximadamente 12 micras. <img src="/files/ftp_upload/1900/1900fig1.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="la figura 2"> Figura 2 Captura automática de imágenes y análisis de los embriones de pez cebra transgénica. (A) del vehículo DMSO tratados Tg (dusp6: d2eGFP) pt6 embrión en 30hpf. (B) los embriones transgénicos tratados con 20μM BCI mostrar aumentos en la expresión de GFP. (C) Imagen de un embrión a partir de (A) después de ejecutar Definiens conjunto de reglas para encontrar la expresión de GFP en la cabeza. Manchas de color naranja denotan que el software mide la intensidad de las buenas prácticas agrarias. (D) Imagen de un embrión a partir de (B) después de ejecutar Definiens conjunto de reglas para encontrar la expresión de GFP en la cabeza. Manchas de color naranja denotan que el software mide la intensidad de las buenas prácticas agrarias. Tenga en cuenta que el conjunto de reglas fue capaz de encontrar un área más amplia de la expresión de GFP en el embrión tratado.

<ol><li>Molina, G. A., Watkins, S. C., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Dev Biol. 7, 62-62 (2007).</li>
<li>Vogt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Dev Dyn. 238, 656-663 (2009).</li>
<li>Molina, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nat Chem Biol. 5, 680-687 (2009).</li>
</ol>

Un factor importante que limita el rendimiento de las pantallas de química pez cebra es la falta de una metodología sistemática para procesar placas de 96 pozos de imágenes y análisis. Como las imágenes de los organismos multicelulares complejos están contraste, baja, y de naturaleza heterogénea, los algoritmos de análisis de imagen no detectar y cuantificar estructuras específicas dentro del organismo. La mayoría de las pantallas de química publicado pez cebra por lo tanto, conlleve el examen visual de los pozos individuales por parte del personal dedicado durante todo el procedimiento. Esto por lo general evita la generación de lecturas numéricas y un completo archivo de imágenes de la pantalla y los datos. Por otra parte, la evaluación manual elimina varias ventajas claves de la imagen basada en detección, es decir, la capacidad de realizar análisis retrospectivos de rendimiento de la pantalla, para examinar los cambios fenotípicos que no eran el foco principal de la campaña de detección (por ejemplo, toxicidad o defectos en el desarrollo) y la cruz de referencia los datos del cribado con pantallas pasado o el futuro uso de la biblioteca de un mismo compuesto. En este informe se destaca la metodología para la imagen automatizada y el análisis de embriones de pez cebra en placas de pocillos múltiples, sin intervención del usuario. Hemos automatizado de captura de imágenes en un láser confocal de barrido ultra ImageXpress lector (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) a la imagen de Tg (dusp6: d2EGFP) pt6 embriones en 96 placas y desarrollado un algoritmo de análisis de imagen basado en la tecnología Definiens &#39;Cognición de red que las buenas prácticas agrarias cuantificados expresión en las cabezas de los embriones transgénicos. El método de entrega respuestas graduadas y cuantificar la actividad in vivo de una pequeña molécula activadora de la señalización de FGF. Se obtuvieron resultados similares con la II epifluorescencia basado ArrayScan (Cellomics Inc., Pittsburgh PA) la documentación que es posible llevar a cabo la captura automática de imágenes de embriones de pez cebra en una variedad de lectores de placas disponibles en el mercado 2. El desarrollo de la metodología para analizar automáticamente las imágenes multicelulares organismo elimina la necesidad de puntuación visual por un observador humano y ha permitido la generación y archivo de los datos numéricos e imágenes para el análisis retrospectivo y comparaciones con las pantallas en el futuro.

<table><tbody><tr><td>Tricaine (MS222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat.# A-5040</td><td></td></tr></tbody></table>

desarrollo de la imagen y el análisis automatizado de pantallas de química de pez cebra.

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. 

Se demuestra la aplicación de la imagen basada en el contenido de alta selección (HCS) metodología para identificar pequeñas moléculas que pueden modular la vía FGF / RAS / MAPK en embriones de pez cebra. El embrión de pez cebra es un sistema ideal para las pantallas en vivo químicos de alto contenido. El embrión de 1 día es de aproximadamente 1 mm de diámetro y puede ser fácilmente dispuestos en placas de 96 pozos, un formato estándar para la detección de alto rendimiento. Durante el primer día de desarrollo, los embriones son transparentes, con la mayor parte de los órganos actuales más importantes, lo que permite la visualización de la formación de tejidos durante la embriogénesis. La automatización completa de las pantallas de química pez cebra sigue siendo un reto, sin embargo, particularmente en el desarrollo de la adquisición automática de imágenes y análisis. Anteriormente hemos generado una línea reportero transgénico que expresa la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control de la actividad de FGF y ha demostrado su utilidad en las pantallas de productos químicos<sup&gt; 1</sup&gt;. Para establecer la metodología para las pantallas de alto rendimiento todo el organismo, hemos desarrollado un sistema automatizado de imágenes y análisis de los embriones de pez cebra a las 24-48 horas posteriores a la fecundación (HPF) en placas de 96 pozos<sup&gt; 2</sup&gt;. En este video podemos destacar los procedimientos para arraying embriones transgénicos en placas multipocillo en 24hpf y la adición de una molécula pequeña (BCI) que hyperactivates FGF señalización<sup&gt; 3</sup&gt;. Las placas se incuban durante 6 horas, seguido por la adición de tricaína para anestesiar a las larvas antes de la imagen automatizada en un Molecular Devices ImageXpress ultra láser confocal de barrido HCS lector. Las imágenes son procesadas por el software de desarrollo Definiens utilizando una red de Cognición algoritmo de la tecnología que hemos desarrollado para detectar y cuantificar la expresión de GFP en las cabezas de los embriones transgénicos. En este ejemplo podemos destacar la capacidad del algoritmo para medir efectos dosis-dependientes de BCI en la expresión del gen GFP reportero en los embriones tratados.

Se presenta el desarrollo de un sistema automatizado de imágenes y análisis de pez cebra embriones transgénicos en placas de pocillos múltiples. Esto demuestra la capacidad de medir los efectos dependientes de la dosis de una molécula pequeña, BCI, el crecimiento de fibroblastos la expresión del gen del factor periodista y suministrar tecnología para el establecimiento de alto rendimiento de las pantallas de química de pez cebra.

Desarrollo de la imagen y el análisis automatizado de pantallas de química de pez cebra.

Demostramos la aplicación de la metodología de cribado de alto contenido (HCS) basado en imágenes para identificar pequeñas moléculas capaces de modular la vía FGF/RAS/MAPK...

En este video, se realiza un cribado de alto contenido basado en imágenes para evaluar la modulación mediante moléculas pequeñas de la vía de la quinasa MAP del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos en embriones de pez cebra. Se cruzan peces cebra transgénicos macho y hembras silvestres en una jaula de apareamiento. Los huevos fertilizados caen al fondo y se recogen y transfieren a una placa de Petri. Los embriones se incuban durante la noche y luego se colocan en pozos individuales de una placa de fondo redondo de 96 pozos.Se añade la molécula pequeña BCI para hiperactivar la señalización de FGF y la placa se incuba durante seis horas. Se capturan imágenes de cada pocillo con un lector de placas confocal y se analizan mediante un algoritmo diseñado por nosotros que informa las intensidades de fluorescencia en estructuras embrionarias específicas. Hola, soy Hiba Kado del laboratorio del Dr. Michael Chang en el Departamento de Microbiología y Genética Molecular de la Universidad de Pittsburgh.Hola, soy Andrea Spock del Instituto de Descubrimiento de Fármacos de la Universidad de Pittsburgh. Hoy les mostraremos el procedimiento para criar, seleccionar y disponer embriones de pez cebra para su tratamiento químico. En una placa de 96 pocillos, utilizaremos embriones transgénicos que informan sobre las actividades del factor de crecimiento de fibroblastos y que serán tratados con una molécula que hiperactiva esta vía.Le mostraremos cómo utilizamos la metodología de cribado de alto contenido para adquirir, analizar y cuantificar automáticamente la actividad del factor de crecimiento de fibroblastos en embriones transgénicos de pez cebra. Este procedimiento destacará la tecnología de plataforma para utilizar peces cebra transgénicos y cribados químicos de alto rendimiento. Así que comencemos.Dos días antes del tratamiento, identifique los peces cebra transgénicos machos homocigotos y colóquelos en tanques de apareamiento individuales. Añada separadores a los tanques, luego agregue una hembra silvestre a cada tanque y deje a los peces en las jaulas de apareamiento durante la noche a 28 grados Celsius. A la mañana siguiente, retire el separador. Después de una hora, traslade los peces a un nuevo tanque y vierta los embriones en un tamiz de plástico.Transfiera los embriones a placas de 100 milímetros con solución E tres e incube a 28 grados Celsius durante seis a ocho horas. Después de la incubación, examine los embriones bajo un microscopio estereoscópico. Los embriones adecuados para experimentos estarán experimentando gas.En este momento, retire cualquier embrión no fertilizado, que permanecerá en la etapa de célula única. Asimismo, elimine los embriones no viables que presenten opacidad o malformación. A continuación, agregue solución E tres fresca e incube durante la noche a 28 grados Celsius.Al día siguiente, coloque los embriones bajo un microscopio estereoscópico fluorescente para clasificar los embriones transgénicos según una etapa similar y una expresión uniforme de GFP. Los embriones a las 24 HPF muestran un límite visible entre el cerebro medio y el cerebro posterior, con una expresión intensa de GFP y ojos bien formados que presentan retinas dorsales positivas para GFP. Estos embriones son activos y se moverán y retorcerán dentro de su corion utilizando una pipeta Pasteur de plástico.Transfiera los embriones de 24 HPF uno a la vez a pozos individuales de una placa de 96 pozos. Utilizando una micropipeta, retire cualquier exceso de solución E tres de los pozos. Luego, usando una pipeta multicanal, agregue 200 microlitros de solución E tres a cada pozo.A continuación, agregue dos microlitros de DMSO a todos los pocillos de las columnas uno y 12. Luego agregue dos microlitros de BCL preparado en DMSO de la siguiente manera: uno, micromolar a las columnas dos y siete; cinco micromolar a las tres y ocho; 10 micromolar a las cuatro y nueve 20.De micromolar a las columnas cinco y diez. Y finalmente, 25 micromolar a la columna seis y once. Ahora cubra la placa con papel de aluminio e incúbela durante seis horas a 28 grados Celsius.Añada 10 microlitros de trica a cada pocillo para anestesiar los embriones de 30 HPF. Luego cargue la placa en el software molecular devices image express ultra open meta express. Seleccione una configuración con un objetivo Forex y el diámetro máximo del diafragma de alfiler.Configure el enfoque automático del láser para detectar el fondo de la placa y utilice un desplazamiento Z óptimo predeterminado. Para detectar las regiones de interés, establezca el área de escaneo como un único sitio de 2000 por 2000 píxeles sin superposición. Seleccione el tipo de placa adecuado y el láser de argón de 488 nanómetros con longitudes de onda de excitación y emisión de 488 sobre 525 nanómetros.Luego, seleccione un pocillo que contenga un embrión tratado con vehículo y haga clic en encontrar muestra. El instrumento realizará un escaneo de enfoque automático y adquirirá una sola imagen para confirmar la correcta adquisición de la imagen. Seleccione al azar un pocillo tratado con vehículo y adquiera una imagen.Si la imagen está enfocada y muestra expresión de GFP en la cabeza. Coloque el cursor sobre las áreas más brillantes y verifique que la intensidad de fluorescencia esté dentro del rango de la cámara de 16 bits. Menos de 65.000 unidades.Repita estos pasos con otro control de vehículo y algunas pocillos tratados con el compuesto. Si es necesario, ajuste la potencia del láser y la ganancia de modo que las regiones más brillantes en las imágenes del control positivo no se saturen. A continuación, en la ventana de adquisición de placa y control, elija adquirir placa para iniciar el escaneo de la placa.El instrumento adquirirá automáticamente una imagen por pocillo para toda la microplaca y las archivará en una base de datos del servidor SQL. Una vez finalizada la exploración, cargue las imágenes en D definition's. Developer abriendo Developer con la opción slinger habilitada.Cree un área de trabajo nueva. Luego, en el menú de archivo, seleccione importación personalizada. A continuación, navegue hasta la carpeta que contiene las imágenes y abra un archivo de muestra.Seleccione un filtro de importación que reconozca el formato de imagen y la estructura de archivos generados por la plataforma molecular Devices Image Express Ultra. Para procesar las imágenes, abra una imagen de control y cargue la tecnología de red de cognición deseada, o algoritmo CNT, o conjunto de reglas. El algoritmo personalizado utilizado aquí está diseñado para identificar automáticamente el embrión, la yema y la cabeza, y para cuantificar el brillo y el área de las estructuras de la cabeza que expresan GFP; ejecute el conjunto de reglas hasta la etapa de detección de la cabeza y la yema.Para garantizar la asignación correcta de la vesícula vitelina y la cabeza, modifique el conjunto de reglas para ajustar el umbral de detección de la vesícula vitelina si esta es demasiado grande o demasiado pequeña. A continuación, ejecute el conjunto de reglas hasta la etapa de detección de estructuras brillantes de la cabeza. Para asegurar la asignación adecuada de las áreas que expresan GFP en la cabeza, modifique el conjunto de reglas para ajustar el umbral de detección de las estructuras de la cabeza en múltiplos de intensidad mínima hasta que la detección de las estructuras brillantes de la cabeza coincida con la observación visual.A continuación, ejecute manualmente todo el conjunto de reglas en varias imágenes seleccionadas al azar generadas a partir de embriones tratados con vehículo y en imágenes de control positivo provenientes de embriones tratados con PCI. Para ejecutar el algoritmo en todas las imágenes de la placa, seleccione las placas que desea analizar y elija. Analice, luego navegue hasta el conjunto de reglas optimizado y analice todos los pocillos.Mediante el programador de trabajos integrado, los pocillos vacíos o las imágenes ambiguas se excluirán automáticamente del análisis durante el escaneo. Se muestra un mapa de exclusión actualizado continuamente. Tanto los datos como las imágenes están disponibles durante la ejecución para su inspección visual.Los datos numéricos y las imágenes procesadas se guardan automáticamente. Una vez que se han analizado todas las imágenes, los datos pueden exportarse a software de terceros como Excel, GraphPad o Prism. Esta figura muestra imágenes de escaneo archivadas de un pocillo tratado con vehículo y otro tratado con BCI, con y sin análisis de CNT.La proteína verde fluorescente aplicada, o GFP, se detecta en el ojo, en el límite entre el mesencéfalo y el rombencéfalo, y en los ganglios trigéminos de embriones transgénicos. Obsérvese que tanto la intensidad de GFP como los dominios de expresión están ampliados. En embriones tratados con BCI aquí presentados, se observa un efecto dependiente de la dosis de BCI sobre la expresión del gen reportero GFP en embriones transgénicos.La concentración necesaria para provocar una respuesta media máxima o EC50 fue aproximadamente de 12 micromoles. Acabamos de mostrarle cómo criar, recolectar y distribuir embriones transgénicos de pez cebra en placas de 96 pocillos. Hemos añadido concentraciones crecientes de PCI en su activador de la vía de señalización.También hemos mostrado cómo automatizar la obtención de imágenes de embriones transgénicos y analizado dichas imágenes mediante un algoritmo personalizado basado en tecnología de redes cognitivas. Con este enfoque, pudimos medir cuantitativamente, de manera graduada, los efectos de un activador de bajo peso molecular de la señalización del factor de crecimiento de fibroblastos. Al realizar este procedimiento, es importante recordar elegir cuidadosamente los embriones para minimizar la variabilidad entre los especímenes.Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

A gran escala basado en pez cebra En vivo Pantalla de moléculas pequeñas

Aquí se describe una novela de alto contenido de ensayo de la inflamación inducida químicamente con miras a la identificación de moduladores bioactivos inmune. Hemos combinado con éxito con la microscopía automatizada de scripts de software desarrollado que permite la cuantificación automática de la respuesta inflamatoria, así como el procesamiento de datos aún más, el análisis, la minería, y el almacenamiento.

Facilitar el descubrimiento de fármacos: Un sistema automatizado de alta el contenido del ensayo La inflamación en el pez cebra

En este artículo, los embriones de pez cebra se utilizan para el cribado de toxicidad química. La toxicidad química se correlaciona con las lecturas del fenotipo. El protocolo de muestreo muestra un enfoque metodológico para realizar el cribado de toxicidad química.

Cribado de toxicidad química basada en embriones: evaluación de los efectos en el desarrollo de embriones de pez cebra

Se describe el procedimiento y el análisis de datos de un sistema de detección química para la señalización de glucocorticoides hormona del estrés usando larvas de pez cebra: la de respuesta en vivo Pez Cebra actividad luciferasa (DE GRIZLY) ensayo de glucocorticoides. El ensayo sensible y específicamente detecta efectos en la señalización de glucocorticoides por compuestos que requieren metabolización o afectan la producción de glucocorticoides endógena.

Un procedimiento de detección química de glucocorticoides Señalización con un sistema indicador de pez cebra Larva luciferasa

Nuestro laboratorio ha desarrollado un sistema automatizado de imágenes de alto rendimiento novedoso que es útil para la detección de varios comportamientos diferentes en-7 días de edad, las larvas de pez cebra. El sistema se puede utilizar para detectar cambios sutiles en el comportamiento después de las larvas han sido expuestos a sustancias tóxicas ambientales o productos farmacéuticos.

Automatizados análisis de comportamiento de alto rendimiento en larvas de pez cebra

Descrito aquí es un protocolo para la formación de imágenes semiautomático de la fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra.

Imaging semi-automatizado de fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra

El pez cebra es un organismo experimental excelente para estudiar los procesos de desarrollo de vertebrados y la enfermedad humana modelo. A continuación, describimos un protocolo sobre cómo realizar una pantalla manual de alto rendimiento químico en embriones de pez cebra con todo el montaje hibridación in situ (ojalá) de lectura.

Un manual de la pantalla pequeña molécula Acercarse De Alto Rendimiento Utilizando embriones de pez cebra

Aquí, presentamos un protocolo para diseñar y fabricar un embrión de pez cebra colocar plantilla, seguido de un procedimiento detallado sobre el uso de dicha plantilla para alto rendimiento embrión de pez cebra colocar en una placa de 96 pocillos.

3 dimensiones (3D)-impreso la plantilla para alto rendimiento embrión de pez cebra matriz

Los embriones de pez cebra se utilizan para evaluar la toxicidad de los compuestos químicos. Se desarrollan externamente y son sensibles a los productos químicos, lo que permite la detección de cambios fenotípicos sutiles. El experimento sólo requiere una pequeña cantidad de compuesto, que se añade directamente a la placa que contiene embriones, haciendo que el sistema de prueba sea eficiente y rentable.

Evaluación rápida de la toxicidad de compuestos químicos mediante embriones de pez cebra

Los modelos de xenoinjerto de pez cebra permiten la detección de fármacos de alto rendimiento y la toma de imágenes fluorescentes de células cancerosas humanas en un microambiente in vivo. Desarrollamos un flujo de trabajo para la detección automatizada de fármacos a gran escala en muestras de leucemia derivadas del paciente en peces cebra utilizando una unidad de imágenes automatizada equipada con microscopio de fluorescencia.

Examen de drogas de xenoinjertos de tumores derivados del paciente primario en peces cebra

Describimos el flujo de trabajo y el análisis de datos de un sistema de cribado para evaluar la toxicidad de compuestos químicos en función de la respuesta de sobresalto por vibración del embrión de pez cebra. El sistema registra los movimientos de los embriones de pez cebra tras la exposición a un estímulo vibratorio y permite una evaluación integrada de la toxicidad/letalidad general y la toxicidad neuromuscular.

Evaluación de la toxicidad de los productos químicos mediante un sistema de detección de la respuesta al sobresalto por vibración del pez cebra

Aprende a realizar cribado de alto rendimiento basado en imágenes para evaluar efectos de moléculas pequeñas sobre la señalización de FGF en embriones de pez cebra transgénico. Este método automatiza la cuantificación de la expresión génica.

Desarrollo de la imagen y el análisis automatizado de pantallas de química de pez cebra.

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