Desarrollo de la imagen y el análisis automatizado de pantallas de química de pez cebra.
24 de junio de 2010
Se presenta el desarrollo de un sistema automatizado de imágenes y análisis de pez cebra embriones transgénicos en placas de pocillos múltiples. Esto demuestra la capacidad de medir los efectos dependientes de la dosis de una molécula pequeña, BCI, el crecimiento de fibroblastos la expresión del gen del factor periodista y suministrar tecnología para el establecimiento de alto rendimiento de las pantallas de química de pez cebra.
En este video, se realiza un cribado de alto contenido basado en imágenes para evaluar la modulación basada en moléculas pequeñas de la vía de la quinasa del mapa Rasm del factor de crecimiento de fibroblastos En los embriones de pez cebra, el pez cebra macho transgénico y el pez cebra hembra de tipo salvaje se aparean en una jaula de cría. Los óvulos fertilizados caen en el fondo y se recogen y transfieren a una placa de Petri. Los embriones se incuban durante la noche y luego se colocan en pocillos individuales de una placa inferior redonda de 96 pocillos.
La pequeña molécula BCI se añade para hiperactivar la señalización de FGF y la placa se incuba durante seis horas. Las imágenes de cada testamento se capturan con un lector de placas confocales y se analizan utilizando un algoritmo de diseño propio que informa de las intensidades fluorescentes en estructuras embrionarias específicas. Hola, soy Hiba Kado del laboratorio del Dr. Michael Chang en el Departamento de Microbiología y Genética Molecular de la Universidad de Pittsburgh.
Hola, soy Andrea Spock del Instituto de Descubrimiento de Fármacos de la Universidad de Pittsburgh. Hoy te mostraremos el procedimiento para la cría, selección y disposición de embriones de pez cebra para el tratamiento químico. En una placa de 96 pocillos, utilizaremos embriones transgénicos que informan sobre las actividades del factor de crecimiento de fibra de vidrio y tratados con una molécula que hiperactiva este último blanco.
Le mostraremos cómo utilizamos la metodología de cribado de alto contenido para adquirir, analizar y cuantificar automáticamente la actividad del factor de crecimiento de fibroblastos en embriones de pez cebra transgénicos. Este procedimiento pondrá de relieve la tecnología de plataforma para utilizar peces cebra transgénicos y cribas químicas de alto rendimiento. Así que comencemos.
Dos días antes del tratamiento, identifique el pez cebra transgénico macho homocigoto y colóquelo en tanques de apareamiento individuales. Agregue separadores a los tanques, luego agregue un pez hembra de tipo salvaje a cada tanque y deje los peces en las jaulas de apareamiento durante la noche a 28 grados centígrados. A la mañana siguiente, retire el separador Después de una hora, mueva los peces a un nuevo tanque y vierta los embriones en un tamiz de plástico.
Transfiera los embriones a placas de 100 milímetros con solución E tres e incube a 28 grados centígrados durante seis a ocho horas. Después de la incubación, examine los embriones bajo un microscopio estereoscópico. Los embriones aptos para experimentos se someterán a gas.
En este momento, extraiga los embriones no fertilizados, que permanecerán en la etapa de célula única. Además, extraiga los embriones no viables que parezcan opacos o malformados. A continuación, añada la solución fresca de E tres e incube durante la noche a 28 grados centígrados.
Al día siguiente, coloque los embriones bajo un microscopio estereoscópico fluorescente para clasificar los embriones transgénicos por estadio similar y uniforme. Expresión de GFP 24 embriones HPF muestran un límite visible de cerebros traseros medios con una intensa expresión de GFP y ojos bien formados con retinas dorsales GFP positivas. Estos embriones son activos y se moverán y se moverán en su corion usando una pipeta de plástico para pastos.
Transfiera los 24 embriones de HPF uno a la vez a pocillos individuales de una placa de 96 pocillos. Con una micropipeta, retire el exceso de solución de E tres de los pocillos. Luego, usando un pipeteador multicanal, agregue 200 microlitros de solución E tres a cada pocillo.
A continuación, agregue dos microlitros de DMSO a todos los pocillos en las columnas uno y 12. A continuación, añada dos microlitros de BCL preparados en DMSO de la siguiente manera, uno, micromolar a las columnas dos y siete. Cinco micromolares a tres y ocho, 10 micromolares a cuatro y nueve a 20.
Micromolar a las columnas cinco y 10. Y finalmente 25 micromolares a la columna seis y 11. Ahora cubra la placa con papel de aluminio e incube durante seis horas a 28 grados centígrados.
Agregue 10 microlitros de trica a cada pocillo para anestesiar los 30 embriones de HPF. A continuación, cargue la placa en el software Molecular Devices Image Express Ultra Open Meta Express. Elija una configuración con un objetivo de Forex y un diámetro máximo de agujero de alfiler.
Configure el enfoque automático del láser para detectar el fondo de la placa y utilizar un desplazamiento Z óptimo predeterminado. Para detectar las regiones de interés, establezca el área de escaneo como un solo sitio de 2000 por 2000 píxeles sin bendición. Seleccione el tipo de placa apropiado y el láser de argón de 488 nanómetros a excitación sobre longitudes de onda de emisión de 488 sobre 525 nanómetros.
A continuación, seleccione un pocillo que contenga un embrión tratado y haga clic en buscar muestra. El instrumento realizará un escaneo de enfoque automático y adquirirá una sola imagen para confirmar la adquisición adecuada de la imagen. Seleccione al azar un vehículo bien tratado y adquiera una imagen.
Si la imagen está enfocada y muestra la expresión GFP en la cabeza. Coloque el cursor sobre las áreas más brillantes y verifique que la intensidad de fluorescencia esté dentro del rango de la cámara de 16 bits. Menos de 65.000 unidades.
Repita estos pasos con otro control de vehículo y algunos pozos tratados con compuestos. Si es necesario, ajuste la potencia y la ganancia del láser de modo que las regiones más brillantes de las imágenes de control positivo no se saturen. A continuación, en la ventana de adquisición y control de placas, elija adquirir placa para iniciar el escaneo de placas.
El instrumento adquirirá automáticamente una imagen por pocillo para toda la microplaca y las archivará en una base de datos de servidor SQL. Una vez finalizado el escaneo, cargue las imágenes en la definición D. Desarrollador abriendo desarrollador con la opción de hondero habilitada.
Cree un nuevo espacio de trabajo. A continuación, en el menú de archivos, seleccione importación personalizada. A continuación, navegue hasta la carpeta que contiene las imágenes y abra un archivo de muestra.
Elija un filtro de importación que reconozca el formato de imagen y la estructura del archivo generados por la plataforma Image Express Ultra de Molecular Devices. Ahora, para procesar las imágenes, abra una imagen de control y cargue la tecnología de red de cognición deseada o el algoritmo o conjunto de reglas CNT. El algoritmo personalizado utilizado aquí está diseñado para identificar automáticamente el embrión, la yema y la cabeza y para cuantificar el brillo y el área de las estructuras de la cabeza que expresan GFP, ejecutar el conjunto de reglas para la etapa de detección de cabeza y yema.
Para garantizar la asignación adecuada del saco y la cabeza de yema, modifique el conjunto de reglas para ajustar el umbral de detección de yema si la yema es demasiado grande o demasiado pequeña. A continuación, ejecute el conjunto de reglas en la etapa de detección de estructuras de cabeza brillantes. Para garantizar la asignación adecuada de las áreas que expresan GFP en la cabeza, modifique el conjunto de reglas para ajustar el umbral de detección de estructuras de la cabeza como múltiplos de intensidad servil hasta que la detección de estructuras brillantes de la cabeza coincida con la observación visual.
A continuación, ejecute todo el conjunto de reglas manualmente en varias imágenes elegidas al azar generadas a partir de embriones tratados con vehículos e imágenes de control positivo de embriones tratados con PCI. Para ejecutar el algoritmo en todas las imágenes de placas, seleccione las placas que desea analizar y elija. Analice, luego navegue hasta el conjunto de reglas optimizado y analice todos los pozos.
Con el programador de trabajos integrado, los pozos vacíos o las imágenes ambiguas se excluirán automáticamente del análisis durante el escaneo. Se muestra un mapa de mantenimiento que se actualiza continuamente. Tanto los datos como las imágenes son accesibles durante la ejecución para su inspección visual.
Los datos numéricos y las imágenes procesadas se guardan automáticamente. Una vez que se han analizado todas las imágenes, los datos se pueden exportar a software de terceros como Excel, GraphPad o Prism. Esta figura muestra imágenes de escaneo archivadas de un vehículo tratado y un BCI A bien tratado con y sin análisis CNT.
La proteína verde fluorescente aplicada o GFP se detecta en el ojo, el límite medio posterior del cerebro y los ganglios del trigémino de embriones transgénicos. Tenga en cuenta que tanto la intensidad de GFP como los dominios de expresión se expanden. En embriones tratados con BCI, se observa un efecto dependiente de la dosis de BCI sobre la expresión del gen indicador de GFP en embriones transgénicos.
La concentración requerida para provocar una respuesta media máxima o EC 50 fue de aproximadamente 12 micromolares. Acabamos de mostrarle cómo criar, recolectar y agrupar embriones de pez cebra transgénico en placas de 96 pocillos. Hemos añadido una concentración creciente de PCI en el propio activador de la vía de señalización.
También hemos mostrado cómo automatizar la obtención de imágenes de embriones transgénicos y hemos analizado las imágenes con un algoritmo diseñado a medida basado en la tecnología de redes cognitivas. Con este enfoque, pudimos medir cuantitativamente de forma graduada los efectos de una pequeña molécula activadora de la señalización del factor de crecimiento de fibroblastos. Al realizar este procedimiento, es importante recordar elegir cuidadosamente los embriones para minimizar la variabilidad entre las muestras.
Eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.
Descripción general
Este estudio presenta un sistema para la adquisición de imágenes y análisis automatizados de embriones transgénicos de pez cebra en placas de pocillos múltiples. Demuestra la capacidad de medir efectos dependientes de la dosis de la molécula pequeña BCI sobre la expresión del gen reportero del Factor de Crecimiento de Fibroblastos, facilitando ensayos químicos de alto rendimiento en pez cebra.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología del desarrollo
- Selección de alto rendimiento
Antecedentes
- El pez cebra se utiliza comúnmente como organismo modelo en biología del desarrollo.
- Los peces cebra transgénicos pueden expresar proteínas fluorescentes, lo que permite la visualización de la expresión génica.
- El cribado de alto contenido permite el análisis simultáneo de múltiples muestras.
- La señalización del Factor de Crecimiento de Fibroblastos (FGF) es crucial para diversos procesos del desarrollo.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un sistema de imagen de alto rendimiento para embriones de pez cebra.
- Evaluar los efectos de moléculas pequeñas en la señalización de FGF.
- Automatizar el análisis de la expresión génica en peces cebra transgénicos.
Métodos Utilizados
- Crianza de pececillos cebra transgénicos y recolección de embriones.
- Incubación de embriones en placas de múltiples pocillos con concentraciones variables de BCI.
- Imagen automatizada mediante un lector de placas confocal.
- Análisis de intensidades fluorescentes utilizando un algoritmo personalizado.
Resultados principales
- Imágenes y análisis exitosos de embriones de pez cebra en un formato de alto rendimiento.
- Se demostraron efectos dependientes de la dosis de BCI sobre la señalización de FGF.
- El análisis automatizado proporcionó una cuantificación confiable de la expresión génica.
- Se estableció una plataforma para futuros cribados químicos en pez cebra.
Conclusiones
- El sistema desarrollado mejora la eficiencia de los ensayos químicos en pez cebra.
- Proporciona una herramienta valiosa para estudiar la señalización FGF en el desarrollo.
- Esta metodología puede aplicarse a otras moléculas pequeñas y vías de señalización.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El análisis automatizado de imágenes de embriones de pez cebra permite una evaluación escalable y in vivo de la modulación de las vías de señalización, apoyando la validación temprana de objetivos y la reducción de riesgos mecanicistas en las etapas de descubrimiento. Este enfoque proporciona lecturas cuantitativas y dependientes de la dosis que mejoran la confianza predictiva sobre los efectos de los compuestos en la actividad de la vía FGF/RAS/MAPK. Esto sitúa al método como un puente traslacional entre el cribado fenotípico y la identificación de compuestos líderes en I+D de biotecnología y farmacéuticas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la modulación de la señalización de FGF en un sistema vertebrado relevante para la enfermedad.
- Valor operativo: Facilita la desactivación biológica mediante la cuantificación automatizada de la expresión del reportero GFP en estructuras craneales embrionarias.
- Valor predictivo: Genera datos de CE50 (aproximadamente 12 micromolares para BCI) para orientar las relaciones estructura-actividad y la selección de carteras.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayo: Produce lecturas estandarizadas y reproducibles de intensidad fluorescente a partir de formatos de placas de 96 pocillos compatibles con flujos de trabajo de alto rendimiento.
- Escalabilidad: Facilita la distribución de embriones transgénicos a las 24 hpf para tratamiento con compuestos e imagen automatizada en lectores confocales de cribado de alto contenido (HCS).
- Utilidad del algoritmo: El algoritmo personalizado de Tecnología de Red de Cognición detecta y cuantifica la expresión de GFP en regiones embrionarias definidas, permitiendo una evaluación confiable de compuestos.
Investigación Translacional y Preclínica
- Continuidad traslacional: Utiliza embriones de pez cebra a las 24-48 hpf, una etapa de desarrollo con órganos formados y transparencia tisular, lo que favorece la extrapolación de estudios in vivo a fases preclínicas.
- Reducción de riesgos mecanicistas: Mide respuestas específicas de la vía (activación del FGF) para distinguir los efectos del compuesto sobre el blanco terapéutico de aquellos fuera del blanco.
- Alineación de biomarcadores: La expresión del reportero GFP sirve como biomarcador traslacional para la modulación de la vía del FGF, detectable mediante análisis automatizado de imágenes.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano, apoyando la prueba de hipótesis en la validación de dianas y permitiendo el desarrollo de ensayos escalables para campañas de identificación de compuestos activos.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la aclaración de rutas y el fortalecimiento de la confianza en los objetivos mediante análisis de respuesta a la dosis en la modulación de la señalización de FGF.
- Selección: Ofrece listo para ensayo mediante adquisición y análisis automatizados de imágenes, asegurando la reproducibilidad entre diferentes concentraciones del compuesto.
- Análisis: Proporciona mediciones cuantitativas de variables dependientes (intensidad y área de GFP) que permiten comparar la potencia y eficacia de los compuestos.
- Investigación Traductiva: Se conecta con la continuidad preclínica utilizando embriones de vertebrados con rutas de señalización conservadas y organogénesis visible.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para seleccionar múltiples moléculas pequeñas y rutas de señalización mediante reporteros transgénicos intercambiables.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la modulación del blanco y reduce la ambigüedad mecanicista en las fases iniciales de cribado.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y la reproducibilidad mediante imágenes automatizadas y análisis basados en algoritmos.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos cuantitativos y dependientes de la dosis sobre la actividad de la vía.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de compuestos basada en métricas de CE50 y respuesta máxima.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de peces cebra, manipulación de embriones transgénicos y microscopía de fluorescencia.
- Depende de instrumentación para cribado de alto contenido confocal (por ejemplo, Molecular Devices ImageXpress Ultra) y software de análisis de imágenes (Definiens Developer).
- Necesita estandarización entre equipos para la clasificación de embriones, preparación de compuestos y parámetros de adquisición de imágenes.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar el algoritmo a diferentes reporteros transgénicos o estructuras embrionarias.
- Las limitaciones prácticas incluyen la variabilidad entre embriones y la necesidad de una selección cuidadosa de especímenes para minimizar el ruido, como se indica en el protocolo.
