El uso de un contador de células automatizado para simplificar estudios de expresión génica: siRNA Derribo de IL-4 la expresión génica en células dependientes Namalwa

El objetivo general de este procedimiento es utilizar la electroporación para introducir ARNip en células difíciles de transfectar con el fin de estudiar la expresión génica. Esto se logra primero determinando la cantidad de suspensión celular necesaria utilizando el contador automático de células TC 10. Luego, se añade el ARNi a la suspensión celular y las células se electropermean.

Utilizando el sistema de electroforesis MXL, las células se incuban durante 24 horas tras la electroforesis. Luego se añade IL-4 para inducir la transcripción génica en las células experimentales. Finalmente, se extrae el ARN y se utiliza PCR en tiempo real para medir los niveles de expresión génica.

Finalmente, se pueden obtener resultados que muestren el efecto de siRNAs específicos en las vías de expresión génica. Hola, soy Adam McCoy, científico sénior de la división de expresión génica de Bio Rad Laboratories. Hoy les mostraremos el procedimiento para introducir ARNs en líneas celulares difíciles de transfectar mediante electroforesis y luego analizaremos los efectos sobre la expresión génica.

Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para analizar la expresión génica de genes individuales o estudiar vías génicas mediante la eliminación de un gen y la búsqueda de efectos en cascada. Así que comencemos. Trabajando bajo una campana de cultivo celular, retire las células de un frasco de cultivo.

Las células utilizadas en este protocolo son células en suspensión. Si está utilizando células adherentes, deberá tratarlas con tripsina antes de retirarlas. Centrifugue las células para formar el precipitado.

Después de centrifugar las células, elimine el sobrenadante y resuspenda las células en PBS. Para determinar el número de células viables, tome una alícuota de la suspensión celular y agregue el colorante azul de tripano en una proporción de uno a uno para teñir las células muertas. El azul de tripano es necesario para la evaluación de viabilidad celular, pero no para el conteo total de células.

Coloque únicamente la mezcla en la abertura de una lámina desechable para conteo e insértela en el contador automático de células TC 10. El TC 10 primero realizará el enfoque automático para asegurar el conteo más preciso y luego comenzará a contar las células. Se muestra el número de células vivas y el total de células por mililitro en la muestra.

Seleccione la imagen de vista para mostrar las celdas en la pantalla de visualización. Luego, utilizando las flechas hacia arriba o hacia abajo, acerque o aleje según sea necesario para calcular la cantidad de suspensión celular necesaria para los experimentos; seleccione la calculadora de dilución.

Introduzca la concentración deseada y los valores de volumen final para este experimento. Se prepararán 16 muestras en total, incluyendo duplicados para cada tratamiento. Por lo tanto, se necesitarán 3,6 mililitros de una suspensión de cinco veces 10 a la seis células por mililitro.

El contador de células informará entonces el volumen de suspensión celular necesario en función del recuento de células viables y los valores objetivo introducidos. Si se utilizó azul de TRIAM, el contador ajustará automáticamente la dilución uno a uno empleada. Ahora, bajo una campana extractora, transfiera el volumen calculado de suspensión celular a un tubo nuevo.

Luego, centrifugar las mezclas celulares para hacer un pellet de las células mientras estas sedimentan. Preparar tubos de microcentrífuga para la electroforesis añadiendo SIR A a cada tubo. Para este experimento, se prepararán un control de irna, dos controles específicos de stat seis ARNip y controles no tratados. Tras la centrifugación, eliminar el PBS y resuspender las células en 3,6 mililitros de tampón de electroforesis Gene Pulser; transferir alícuotas de 800 microlitros a los tubos que contienen el ARNip adecuado y mezclar suavemente.

Las células ya están listas para la electroforesis, para tratar todas las muestras simultáneamente. Utilizando el sistema de electroforesis MXL, transfiera 150 microlitros de cada suspensión celular a los pozos correspondientes de una placa de electroforesis de 96 pozos. A continuación, coloque la placa en la cámara de la placa del sistema de electroforesis MXL y cierre la tapa.

Seleccione el protocolo de electroforesis deseado y presione pulso para ate las células después de que finalice la electroforesis, retire la placa del instrumento y transfiera las células a una nueva placa de cultivo celular que contenga medio precalentado. A continuación, transfiera 150 microlitros de células control no tratadas para cada muestra a la nueva placa. Luego, coloque las células a 37 grados Celsius, 5 % de dióxido de carbono durante la noche.

Después de 24 horas, utilice IL-4 para inducir la transcripción génica en un conjunto de células y agregue solo medio al segundo conjunto. Se añade una IL-4 a las células. Incube adicionalmente 24 horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono tras un total de 48 horas de crecimiento.

Pueden existir grandes diferencias en la densidad celular si el tratamiento experimental afecta la división celular. Por lo tanto, es recomendable utilizar el contador automático de células TC 10 para volver a contar rápidamente las células según los conteos celulares. Transfiera un alícuota de cada pocillo a un tubo microfuga para la extracción de ARN y congele.

Un segundo alícuota para inmunotransferencia o cualquier otro análisis de proteínas. Hoy solo se mostrará el protocolo para ARN. Centrifugar las muestras para sedimentar las células.

Luego retire y deseche el SUP natin de cada tubo. Continúe con la extracción de ARN utilizando el kit de ARN total orum. Una vez que se haya extraído el ARN, proceda inmediatamente con el análisis, manteniendo las muestras en hielo.

Para verificar la calidad y cantidad de ARN en un solo paso, utilice la estación de electroforesis automatizada Experian para desnaturalizar las muestras con calor y emplee la escalera de ARN Experian; luego coloque en hielo. Añada una mezcla preparada de gel y colorante al pocillo de cebado en un chip de ARN y configure el código de cebado en la estación de cebado.

Coloque el chip en la estación de cebado automatizada y presione inicio. Retire el chip de la estación de cebado y cargue el chip. Vortexee el chip para mezclar las muestras con el tampón de carga.

Coloque el chip en la estación de electroforesis e inicie la corrida. El software Experian mostrará automáticamente los resultados en forma de un electroferograma, una tabla de resultados que muestra la concentración de ARN, la razón ribosomal y el número indicador de calidad de ARN, y un gel virtual, que se parece a un gel de ARN tradicional. Las muestras de ARN total de alta calidad tendrán típicamente un RQI de ocho a 10.

Después de verificar la calidad del ARN, prepare aquí las reacciones de ADNc. Se utiliza la mezcla IS script ONEstep R-T-P-C-R para combinar la síntesis de ADNc y la PCR en tiempo real. En una reacción, prepare una mezcla maestra que contenga todos los componentes de la reacción excepto las plantillas de ARN para cada conjunto de cebadores.

Luego distribuya la mezcla en los pocillos de una placa de PCR. Después de diluir el ARN a una concentración uniforme, agregue las muestras a los pocillos correspondientes y en tres réplicas. Selle la placa, colóquela en la máquina de PCR en tiempo real, seleccione el protocolo adecuado e inicie la corrida; una vez finalizada la corrida, utilice las trazas en tiempo real para determinar los niveles de expresión.

El software calcula la expresión génica normalizada a partir de los datos, basándose en la expresión relativa de genes experimentales y de referencia en células tratadas y controladas. Esta figura muestra una visión general de la vía de señalización de IL-4, en la que la unión de IL-4 a su receptor conduce a la dimerización y activación de STAT6; STAT6 activado transloca al núcleo y activa la transcripción de sus genes diana.

Genes como CCL 17 sin inducción por IL cuatro, la transcripción de CCL 17 permanecerá en niveles constitutivos bajos tras el silenciamiento mediado por irna del gen STAT seis. El tratamiento con IL cuatro debería provocar un aumento escaso o nulo en la expresión de CCL 17. La inducción de CCL 17 por IL cuatro se midió en diferentes condiciones mediante cuantificación en tiempo real.

Las muestras de PCR cultivadas sin IL-4 presentaron un bajo nivel constitutivo de expresión. Independientemente del sir, A, entregado como se muestra en las muestras de control verde y azul, respondió normalmente al tratamiento con IL-4 con una inducción de ocho a diez veces de CCL17. Sin embargo, las células transfectadas con siARN dirigidos contra STAT6, mostradas en rojo y rosa, tuvieron una expresión reducida de CCL17 en respuesta a IL-4, lo que respalda la idea de que STAT6 desempeña un papel en la expresión inducida por IL-4 de CCL17.

Acabamos de mostrarle cómo introducir siARN en una línea celular en suspensión de difícil transfección y cómo seguir la expresión génica en esas células. Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener las condiciones lo más consistentes posible en todas las muestras. Eso es todo.

Gracias por ver el video y buena suerte con sus experimentos.