Name: Ensayo experimental de metástasis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-24T17:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Aprende a evaluar el potencial metastásico de líneas celulares de cáncer humano mediante inyecciones en la vena de la cola en ratones inmunodeficientes. Este ensayo permite cuantificar y cultivar metástasis pulmonares.

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Este protocolo fue inicialmente probado y optimizado en el laboratorio del Dr. Richard Hynes (MIT). El financiamiento es provisto por el premio IDEA NYSTEM (a LX) y Ruth L. Kirschstein Premio Nacional de Servicio de Investigación (para LX).

1. Preparación de la muestra <ol><li> Se cultivan las células confluentes a ~ 70% en sus medios de comunicación específicos con factores de crecimiento o FBS (por ejemplo, DMEM con FBS al 10% de MC-1 en las células). Aspirar los medios de comunicación de la placa y lavar suavemente varias veces con 1 x PBS (8 g / l de NaCl, 0,2 g / L de KCl, 1,15 g / L de Na 2 HPO 4 .7 H 2 O, 0,2 g / L de KH 2 PO 4, pH 7,3). </li><li> Aspirar PBS y añadir 2 ml de tripsina 0,05% en versene (0,014 g / L de rojo de fenol y 0,2 g / l de EDTA-Na en 1 x PBS, pH 7,2). Agite suavemente la placa para facilitar el desprendimiento de células de la placa. Observar las células bajo un microscopio. Por lo general tarda 2-5 minutos para que las células se despeguen. </li><li> Añadir un amplio volumen de los medios de comunicación que contiene FBS (o un inhibidor de tripsina de soja) para apagar la actividad de la tripsina y recoger las células en un tubo de 50 ml halcón. Recuento de células con un hemocitómetro. Carga 10μL de suspensión celular en un hemocitómetro limpio. El número de células por ml es igual a la media de # de células en cada una de las cinco plazas, multiplicado por 10 4. </li><li> Centrifugar las células a 1000 rpm (o ~ 200 xg) en una centrífuga de mesa durante 3 minutos. </li><li> Retire con cuidado los medios de comunicación sin perturbar el sedimento celular. Resuspender las células en un volumen adecuado de solución de Hanks equilibrada Buffer (HBSS) para llegar a una concentración final de ~ 5 x 10 6 células / ml. </li><li> Las células del filtro a través de un Falcon 70 m de células colador para excluir a los agregados de células grandes. Coloque la punta de la pipeta directamente sobre el filtro en un tubo de 5 ml etiquetados cultura Falcon. Rápida expulsión de la suspensión a través del filtro en el tubo de la cultura. </li><li> Contar las células de nuevo con un hemocitómetro y se diluye a una concentración final de 2,5 x 10 6 / ml. Mantener las células en hielo. </li><li> Determinar la viabilidad de las células. Mezclar un poco de las células con azul tripán y medir el porcentaje de muertos (azul), las células en el total de células con un hemocitómetro. La viabilidad de las células debe ser ≥ 90% antes de la inyección. </li></ol> 2. Inyección intravenosa <ol><li> Cambiar los guantes. Suavemente agarrar la cola de un ratón inmunodeficiente (desnudo, NOD-SCID, o sin garantía soberana, de laboratorio de Jackson) y tire de ella en la inmovilización del ratón, con la espalda contra la ranura y la cola que sobresale de la pequeña abertura en la parte posterior de la inmovilización . </li><li> Deslice lentamente el anillo hacia adentro a lo largo de la ranura y bloqueo en su lugar una vez que el anillo de las capturas de la boca del ratón. El ratón no debe ser capaz de moverse libremente, pero debe tener ritmo normal de respiración. </li><li> Encuentra las grandes venas de la cola. Cuatro principales vasos sanguíneos están presentes en una cola de ratón. Los vasos sanguíneos en los lados dorsal y ventral de la cola son las arterias. Las venas están en los lados laterales de la cola. </li><li> Atraer a más de 200 l de las células preparado en una jeringa de 1 ml. Coloque la aguja 30 G1 / 2 pulgadas y empuje las burbujas de aire que puedan existir. El volumen final de células en la jeringa debe ser de 200 l (es decir, 5 x 10 5 células en total). </li><li> Inyectar las células en la vena de la cola. <ol class="lalpha"><li> Empezar desde el extremo distal de la cola, así que si la primera prueba falla, una región más proximal de la cola podría ser utilizado para un segundo intento. </li><li> Limpiar la cola con un 70% de etanol. Tirar de la cola recta. Sostenga la punta de la cola con el pulgar y apoyar el punto de inyección con el dedo índice. </li><li> Insertar la aguja en la vena y se inyecta las células. Asegúrese de que la aguja y la jeringa son paralelas a la vena durante la inyección, de lo contrario la aguja se asoman a través de la pared del vaso e inyectar las células en los tejidos adyacentes cola. </li><li> Retire la aguja después de la inyección. La sangre debe abundante del lugar de inyección si la inyección se fue con éxito. Pulse una hoja limpia de papel toalla o paño de algodón en el sitio de la inyección para facilitar la coagulación, y palpar la cola hacia arriba para empujar cualquier muestra residual en la vena en circulación. </li><li> Suelte el ratón de la inmovilización y el retorno a la jaula. Registrar el proceso de inyección (por ejemplo, cuántas pruebas se llevaron a inyectar las células y la cantidad de células fueron inyectadas) en un cuaderno de prácticas. </li><li> Determinar la viabilidad de las células después de la inyección, como se describe en la Sección de Preparación de la muestra, el paso 9. Este paso ofrece la seguridad de que las células de mantenerse con vida durante todo el proceso de inyección. Al final de un experimento de inyección, la viabilidad de las células se reducirá, pero debe estar por encima del 80%. </li><li> (Opcional) Decantar las células sobrantes y aclarar las pastillas una vez con PBS. Congelar los pellets a -80 º C para análisis futuros (por ejemplo, transferencias Western para confirmar la expresión de genes o caídas). </li></ol></li><li> Normalmente, después de uno o dos meses, los ratones se diseca y la ubicación de las metástasis se determinan groseramente. De pulmón es el principal sitio de metástasis, ya que contiene el primer lecho capilar que encuentran las células después de queentrar en la circulación. </li><li> Después de lavar con PBS, cada lóbulo del pulmón (u otros tejidos que contienen metástasis) se observa bajo un microscopio de disección (Figura 1). El número de metástasis detectable en ambos lados de los pulmones se cuenta y el número de metástasis pulmonares en los cuatro lóbulos se suman como el número total de metástasis pulmonares. 1 metástasis pulmonares son más fáciles de detectar si los pulmones están fijadas en formol durante la noche , ya que las metástasis Entonces aparecerá como manchas blancas en contraste con los tejidos adyacentes de pulmón marrón oscuro. </li></ol> 3. El cultivo de células de metástasis pulmonares <ol><li> Las metástasis pulmonares son aislados de los ratones inyectados. Cada uno debe cultivar por separado. </li><li> Cada metástasis es picada por el final de una tapa de la aguja (estéril) en un filtro de 70 micras de células. </li><li> Enjuague el filtro celular con varios ml de medio y las células recogidas que pasan por el filtro en una placa de cultivo. </li><li> Se incuban las células a 37 ° C durante al menos cuatro días sin interrupción. </li><li> Lavar la sangre o restos de tejido en el plato con PBS. </li><li> Añadir un nuevo medio. En un principio, tanto las células cancerosas y las células de fibroblastos crecen en las placas, pero poco a poco, las células de fibroblastos se extinguirá y será reemplazado por las células cancerosas. Si las células de cáncer de llevar a cualquier genes resistentes a los medicamentos, seleccione las celdas con los antibióticos correspondientes. </li><li> La pureza de las células derivadas es evaluada por tinción con anticuerpos contra el virus de proteínas específicas. Utilizamos un anticuerpo anti-humano vimentina (VIM-NCL-V9, Novocastra). Las células que contienen por lo general deriva más del 99% de las células humanas, incluso en ausencia de la selección de medicamentos. Las nuevas células derivadas podrían ser inyectados de nuevo en ratones inmunodeficientes para poner a prueba sus habilidades metastásico, como se describió anteriormente. </li></ol> 4. Resultados representante <ol><li> Al final de este ensayo, una línea celular de cáncer altamente metastásico normalmente da lugar a metástasis pulmonares muchos (Figura 1), mientras que una metástasis pulmonares muy pocos provienen de una línea de cáncer de células poco metastásicas. </li><li> Las células derivadas usando este método suele dar lugar a metástasis más que la línea de los padres, cuando ellos se ponen a prueba una vez más utilizando este ensayo. 3.1 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1942/1942fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Imágenes representativas de los pulmones del ratón después de las inyecciones vena de la cola de las células cancerosas. 5 x 10 5 de la metastásico línea celular humana de melanoma, las células de SM, 4 fueron inyectados en la vena de la cola de ratones inmunodeficientes. Dos meses más tarde, los pulmones fueron aislados y las metástasis se encuentran dispersos entre el tejido pulmonar normal.

<ol><li>Xu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+changes+in+an+animal+melanoma+model+correlate+with+aggressiveness+of+human+melanoma+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Gene expression changes in an animal melanoma model correlate with aggressiveness of human melanoma metastases.</a> Mol Cancer Res. 6 (5), 760-760 (2008).</li>
<li>Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+metastasis+reveals+an+essential+role+for+RhoC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC.</a> Nature. 406 (6795), 532-532 (2000).</li>
<li>Xu, L., Begum, S., Hearn, J. D., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPR56%2C+an+atypical+G+protein-coupled+receptor%2C+binds+tissue+transglutaminase%2C+TG2%2C+and+inhibits+melanoma+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">GPR56, an atypical G protein-coupled receptor, binds tissue transglutaminase, TG2, and inhibits melanoma tumor growth and metastasis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (24), 9023-9023 (2006).</li>
<li>Kozlowski, J. M., Hart, I. R., Fidler, I. J., Hanna, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+melanoma+line+heterogeneous+with+respect+to+metastatic+capacity+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">A human melanoma line heterogeneous with respect to metastatic capacity in athymic nude mice.</a> J Natl Cancer Inst. 72 (4), 913-913 (1984).</li>
<li>Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multigenic+program+mediating+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone.</a> Cancer Cell. 3 (6), 537-537 (2003).</li>
</ol>

La metástasis es la causa principal de muerte en pacientes con cáncer. Se trata de cuatro pasos principales: el desprendimiento de las células cancerosas de sus lugares principales, su entrada en circulación (intravasation), su salida de la circulación (extravasación), y la supervivencia y el crecimiento en un órgano distante. Metástasis en humanos se considera un proceso lento y muchas veces se manifiesta después de varios años de latencia. Para el estudio de su progresión en el momento oportuno, el ensayo anterior exp...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10313-021</td><td></td></tr><tr><td>SFB</td><td>Hyclone</td><td>SH30088.03</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>6838-04</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7896-04</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7100-12</td><td></td></tr><tr><td>Rojo fenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-Na</td><td>EMD Millipore</td><td>4010</td><td></td></tr><tr><td>Azul de tripano</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina al 2,5 %</td><td>Invitrogen</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Ultrapuro</td><td>200-CSGP</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Falcon de 50 ml</td><td>VWR international</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>Tubos microcéntrifugos</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Filtro celular Falcon de 70&amp;mu;m</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de cultivo Falcon de 5 ml</td><td>VWR international</td><td>60818-576</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Hausser Scientific</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 1 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>329650</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de calibre 30 &amp;frac12;</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Restricción para ratón</td><td>Plas Labs Inc.</td><td>551-BSRR</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-902</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de banco</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>75003491</td><td></td></tr></tbody></table>

ensayo experimental de metástasis

Experimental Metastasis Assay

La metástasis es la causa principal de muerte en pacientes con cáncer. Para entender el mecanismo de la metástasis, un ensayo de metástasis experimental se estableció el uso de ratones inmunodeficientes. Este artículo delinea los procedimientos involucrados en este ensayo, incluyendo la preparación de muestras, la inyección intravenosa, y el cultivo de células de metástasis pulmonares. En pocas palabras, un número determinado de células de cáncer humano se prepararon<em&gt; In vitro</em&gt; Y se inyecta directamente en la circulación de ratones inmunodeficientes por las venas de la cola. Un pequeño número de células sobrevivir a la turbulencia en la circulación y crecen como las metástasis en los órganos internos, como el pulmón. Los ratones inyectados se diseccionan después de un período determinado. La distribución en los tejidos de las metástasis se determina bajo un microscopio de disección. El número de metástasis en un tejido específico se cuenta y se correlaciona directamente con la capacidad metastásica de las células cancerosas inyectadas. La metástasis surgido son aisladas y cultivadas<em&gt; In vitro</em&gt; Como líneas celulares, que a menudo muestran una mayor capacidad metastásica de la línea de los padres cuando se inyecta de nuevo en ratones inmunodeficientes. Estos derivados altamente metastásico convertirse en herramientas útiles para la identificación de genes o de las vías moleculares que regulan la progresión metastásica.

En este artículo se describen los procedimientos de ensayo de metástasis experimental que se utiliza para determinar el potencial metastásico de líneas celulares de cáncer humano.

Ensayo experimental de metástasis

La metástasis es la principal causa de muerte en pacientes con cáncer. Para comprender el mecanismo de la metástasis, se estableció un ensayo de metástasis experimental...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en evaluar las capacidades metastásicas de células cancerosas humanas mediante inyecciones en la vena caudal. En ratones inmunodeficientes, las células se preparan para la inyección. A continuación, las células se inyectan en ratones inmunodeficientes, los cuales desarrollarán metástasis pulmonares tras uno o dos meses.Se disecan los ratones y se cuantifican y cultivan las metástasis pulmonares. Los resultados de este tipo de ensayo indican el grado de metástasis de un tipo particular de célula cancerosa. Hola, soy Sonali Mohanty del laboratorio del Dr. LE en el Departamento de Genética Biomédica de la Universidad de Rochester.Hoy les mostraremos un procedimiento para realizar un ensayo de metástasis experimental. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la metástasis del cáncer. Así que comencemos.Comience con células cultivadas hasta aproximadamente el 70 % de confluencia. Aspire el medio del pocillo y lave suavemente una vez con un XPBS. A continuación, agregue dos mililitros de tripsina al 0,05 % invirtiendo. Mueva suavemente el pocillo para facilitar la disociación celular.Observe las células bajo un microscopio mientras se desprenden. Añada un volumen abundante de medio que contenga suero bovino fetal (FBS) para detener la actividad de la tripsina. Luego, transfiera a un tubo de 50 mililitros.Cuente las células utilizando un hemocitómetro. Una vez determinada la concentración, centrifugue a aproximadamente 200 veces la gravedad durante tres minutos sin perturbar el pellet celular. Retire cuidadosamente el medio y resuspenda en un volumen adecuado de solución tampón de Hank equilibrada o HBSS para alcanzar una concentración final de aproximadamente cinco por 10 a la seis células por mililitro.A continuación, filtre a través de un filtro celular de 70 micrómetros de Falcon. Para excluir agregados celulares grandes, coloque la punta de la pipeta directamente sobre el filtro, colocado encima de un tubo de cultivo de cinco mililitros. Eyecte rápidamente la suspensión a través del filtro hacia el tubo.Cuente nuevamente las células utilizando azul de tripano para determinar la viabilidad. La viabilidad debe ser mayor al 90 % antes de la inyección. Luego, diluya hasta una concentración final de 2,5 × 10⁶ células por mililitro.Mantenga en hielo. Tome suavemente la cola de un ratón inmunodeficiente y sáquela hacia el sujetador de ratón con su espalda contra la ranura y su cola saliendo por la abertura pequeña en la parte trasera. Deslice lentamente el anillo hacia adentro a lo largo de la ranura.Una vez que el anillo capture la boca del ratón, bloquéelo en su lugar. El ratón no debería poder moverse libremente, pero debe mantener una frecuencia respiratoria normal. Localice las venas principales de la cola.Hay cuatro vasos sanguíneos principales en la cola de un ratón. Las arterias se encuentran en los lados dorsal y ventral de la cola. Las venas se ubican en los lados laterales.Aspire al menos 200 microlitros de las células preparadas en una jeringa de un mililitro. Coloque una aguja de calibre 30 y media y expulse cualquier burbuja de aire. El volumen final en la jeringa debe ser de 200 microlitros.Prepárese para inyectar en el extremo distal de la cola. Así, si el primer intento falla, se puede utilizar una región más proximal de la cola para un segundo intento. Después de limpiar el sitio de inyección con etanol al 70 %, tire suavemente de la cola para enderezarla.Sostenga la punta con el pulgar y apoye la punta para la inyección con el dedo índice. Introduzca la aguja en la vena e inyecte las células. Asegúrese de que la aguja y la jeringa estén paralelas a la vena durante la inyección.De lo contrario, la aguja atravesará la pared del vaso y las células se inyectarán en los tejidos adyacentes de la cola. Retire la aguja si el procedimiento fue exitoso. La sangre debe perfundirse desde el sitio de inyección.Presione una bola de algodón limpia para facilitar el uso del hilo dental y palpe la cola hacia arriba para impulsar cualquier muestra residual hacia la circulación. Suelte al ratón del sujetador y devuélvalo a la jaula. Registre el número de intentos de inyección y el número de células inyectadas en un cuaderno de laboratorio.Determine la viabilidad de las células después de la inyección. Como antes, este paso proporciona la seguridad de que las células permanecen vivas durante todo el proceso de inyección. Al final de un experimento de inyección, la viabilidad de las células disminuirá, pero debe mantenerse por encima del 80 %. Como paso opcional, centrifugue las células sobrantes y lave los sedimentos con PBS una vez.Luego, congele los pellet a menos 80 grados Celsius para análisis futuros, como el inmunotransferencia. Para confirmar la expresión génica tras el silenciamiento, después de uno a dos meses, diseccione los ratones para determinar las ubicaciones de las metástasis. Comience colocando el ratón sacrificado en una estación de disección.Rocíe al ratón abundantemente con etanol. Corte la caja torácica para exponer los pulmones y el corazón. Luego, extirpe con cuidado estos órganos y colóquelos en PBS.El pulm&oacute;n es el sitio primario de met&aacute;stasis ya que contiene la primera cama capilar que encuentran las c&eacute;lulas. Despu&eacute;s de que ingresan a la circulaci&oacute;n, retire el coraz&oacute;n y lave los pulmones en PBS, luego observe cada l&oacute;bulo del pulm&oacute;n bajo un microscopio estereosc&oacute;pico. Cuente el n&uacute;mero de met&aacute;stasis detectables en ambos lados del pulm&oacute;n y luego sume el n&uacute;mero de met&aacute;stasis pulmonares en los cuatro l&oacute;bulos para determinar el n&uacute;mero total de met&aacute;stasis pulmonares.A continuación, aísle metástasis pulmonares individuales mediante escisión usando tijeras. Transfiera cada metástasis a un filtro celular de 70 micrómetros y tritúrelo usando el extremo de una tapa estéril de aguja. Enjuague el filtro celular con varios mililitros de medio y recoja las células que pasan a través del filtro.En un plato de cultivo, cada plato contiene células de una metástasis. Incubar las células a 37 grados Celsius durante al menos cuatro días sin perturbarlas. Inicialmente, tanto las células cancerosas como las células fibroblásticas crecerán en las placas, pero gradualmente las células fibroblásticas morirán y serán reemplazadas por células cancerosas.Si las células cancerosas portan genes resistentes a fármacos, seleccione las células con los antibióticos correspondientes. Después de tres días, lave con PBS cualquier sangre o restos de tejido, restos en el recipiente, y agregue medio fresco. Evalúe la pureza de las células derivadas mediante tinción inmunológica con anticuerpos contra proteínas específicas humanas aquí; se utiliza un anticuerpo anti-humano incluso en ausencia de selección con fármacos. Más del 99 % de las células deben ser humanas.Las células recién obtenidas ahora pueden volver a inyectarse en ratones inmunodeficientes para evaluar sus capacidades metastásicas al final de este ensayo. Una línea celular de cáncer altamente metastásica generalmente produce muchas metástasis pulmonares, mientras que muy pocas metástasis pulmonares provendrán de una línea celular de cáncer pobremente metastásica. Estas imágenes muestran metástasis pulmonares dos meses después de la inyección de la línea celular de melanoma humano.Un 3 7 5 sm. Las células derivadas mediante este método suelen producir más metástasis que la línea parental cuando se prueban. Nuevamente utilizando este ensayo, acabamos de mostrarle el procedimiento para realizar un ensayo de metástasis experimental.Al realizar este procedimiento, es muy importante recordar asegurarse de que las células se inyecten en la vena de la cola, pero no en el tejido de la cola ni en su interior. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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