Ensayo experimental de metástasis

El objetivo general del siguiente experimento es probar las capacidades metastásicas de las células cancerosas humanas mediante inyecciones en las venas de cola. En ratones inmunodeficientes, las células se preparan para la inyección. Luego, las células se inyectan en ratones inmunodeficientes, que generarán metástasis pulmonares después de uno o dos meses.

Los ratones se diseccionan y las metástasis pulmonares se cuantifican y cultivan. Los resultados de este tipo de ensayo indican la extensión de las metástasis de un tipo particular de célula cancerosa. Hola, soy Sonali Mohanty del laboratorio del Dr. LE en el Departamento de Genética Biomédica de la Universidad de Rochester.

Hoy te mostraremos un procedimiento para realizar un ensayo experimental de metástasis. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la metástasis del cáncer. Así que comencemos.

Comience con células cultivadas hasta aproximadamente el 70% de fluidez en los medios de aspiración de la placa y lávese suavemente una vez con un XPBS. A continuación, añade dos mililitros de 0,05%Tripsina invertida. Balancee suavemente la placa para facilitar el desprendimiento de la célula.

Observe las células bajo un microscopio a medida que se desprenden. Agregue un amplio volumen de medios que contengan FBS para apagar los viajes en actividad. Luego transfiéralo a un tubo de 50 mililitros.

Cuente las células con un hemocitómetro. Una vez que se haya determinado la concentración, centrifugar a unas 200 veces la gravedad durante tres minutos sin alterar el pellet de la celda. Retire con cuidado el medio Resus suspendiendo un volumen adecuado de la solución tampón de equilibrio de Hank o HBSS para alcanzar una concentración final de aproximadamente cinco veces 10 a las seis células por mililitro.

A continuación, filtre a través de un filtro de celdas de 70 micrómetros de Falcon. Para excluir agregados de células grandes, coloque la punta de la pipeta directamente sobre el filtro, colocado sobre un tubo de cultivo de cinco mililitros. Expulse rápidamente la suspensión a través del filtro hacia el tubo.

Cuente las celdas nuevamente usando azul trian para determinar la viabilidad. La viabilidad debe ser superior al 90% antes de la inyección. A continuación, diluir hasta una concentración final de 2,5 veces 10 a las seis células por mililitro.

Mantener en hielo. Agarre suavemente la cola de un ratón inmunodeficiente y tire de ella hacia el retenedor del ratón con la espalda contra la hendidura y la cola sobresaliendo por la pequeña abertura en la parte posterior. Deslice lentamente el anillo hacia adentro a lo largo de la ranura.

Una vez que el anillo atrape la boca del ratón, asegúralo en su lugar. El ratón no debe poder moverse libremente, pero debe tener una frecuencia respiratoria normal. Encuentra las venas principales de la cola.

Cuatro vasos sanguíneos principales están presentes en la cola de un ratón. Las arterias se encuentran en los lados dorsal y ventral de la cola. Las venas se localizan en los lados laterales.

Extraiga al menos 200 microlitros de las células preparadas en una jeringa de un mililitro. Coloque una media aguja de calibre 30 y expulse las burbujas de aire. El volumen final de la jeringa debe ser de 200 microlitros.

Prepárese para inyectar en el extremo distal de la cola. Por lo tanto, si el primer intento falla, se podría usar una región más proximal de la cola para un segundo intento. Después de limpiar el lugar de la inyección con etanol al 70%, tire de la cola recta.

Sujete la punta con el pulgar y apoye la punta de inyección con el dedo índice. Inserte la aguja en la vena e inyecte las células. Asegúrese de que la aguja y la jeringa estén paralelas a la vena durante la inyección.

De lo contrario, la aguja atravesará la pared del vaso y las células se inyectarán en los tejidos adyacentes de la cola. Retire la aguja si el procedimiento fue exitoso. La sangre debe filtrarse desde el lugar de la inyección.

Presione una bola de algodón limpia para facilitar el uso del hilo dental y palpe la cola hacia arriba para empujar cualquier muestra residual a la circulación. Suelta al ratón del sujetador y devuélvelo a la jaula. Registre el número de ensayos de inyección y el número de células inyectadas en un cuaderno de laboratorio.

Determinar la viabilidad de las células después de la inyección. Al igual que antes, este paso proporciona la seguridad de que las células permanecen vivas durante todo el proceso de inyección. Al final de un experimento de inyección, la viabilidad de las células disminuirá, pero debe permanecer por encima del 80%Como paso opcional, gire las células sobrantes y enjuague los gránulos con PBS una vez.

A continuación, congele los gránulos a menos 80 grados centígrados para futuros análisis, como el Western blot. Después de uno o dos meses, diseccione los ratones para determinar la ubicación de las metástasis. Comience colocando el ratón sacrificado en una estación de disección.

Rocíe generosamente el ratón con etanol. Corta la caja torácica para exponer los pulmones y el corazón. A continuación, expórtelos con cuidado y colóquelos en PBS.

El pulmón es el sitio principal de la metástasis, ya que contiene el primer lecho capilar con el que se encuentran las células. Después de que ingresan a la circulación, extraiga el corazón y enjuague los pulmones con PBS, luego observe cada lóbulo del pulmón bajo un microscopio de disección. Cuente el número de metástasis detectables en ambos lados del pulmón y, a continuación, el número de metástasis pulmonares en los cuatro lóbulos juntos para determinar el número total de metástasis pulmonares.

A continuación, aislar las metástasis pulmonares individuales mediante escisión con tijeras. Transfiera cada metástasis a un colador de células de 70 micrómetros y píquelo con el extremo de una tapa de aguja estéril. Enjuague el filtro de células con varios mililitros de medio y recoja las células que pasan a través del filtro.

En una placa de cultivo, cada placa contiene las células de una metástasis. Incubar las células a 37 grados centígrados durante al menos cuatro días sin molestias. Inicialmente, tanto las células cancerosas como las células de fibroblastos crecerán en las placas, pero gradualmente las células de fibroblastos morirán y serán reemplazadas por células cancerosas.

Si las células cancerosas portan genes resistentes a los medicamentos, seleccione las células con los antibióticos correspondientes Después de tres días, lave los restos de sangre o tejidos, los desechos en el plato con PBS y agregue un medio fresco. En este caso, se evalúa la pureza de las células derivadas mediante inmunotinción con anticuerpos contra proteínas específicas humanas y se utilizan anticuerpos anti-mentones humanos incluso en ausencia de selección de fármacos. Más del 99% de las células deberían ser humanas.

Las células recién derivadas ahora se pueden inyectar nuevamente en ratones inmunodeficientes para probar sus capacidades metastásicas al final de este ensayo. Una línea celular de cáncer altamente metastásico generalmente da lugar a muchas metástasis pulmonares, mientras que muy pocas metástasis pulmonares provendrán de una línea celular de cáncer poco metastásico. Estas imágenes muestran metástasis pulmonares dos meses después de la inyección de la línea celular de melanoma humano.

A 3 7 5 sm. Las células derivadas mediante este método suelen dar lugar a más metástasis que la línea parental cuando se analizan. De nuevo utilizando este ensayo, acabamos de mostrarle el procedimiento para realizar un ensayo experimental de metástasis.

Al realizar este procedimiento, es muy importante recordar que debe asegurarse de que las células se inyecten en la vena de la cola, pero no en el tejido de la cola. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.