El análisis de grandes complejos de proteínas por espectrometría de masas estructurales

El objetivo general del siguiente experimento es caracterizar grandes ensamblajes de proteínas utilizando espectrometría de masas estructural. Esto se logra mediante la preparación de capilares chapados en oro para la ionización por electropulverización de nano flujo. Como segundo paso, se prepara la muestra y se calibra el espectrómetro de masas para mediciones de alta masa.

A continuación, se optimizan las condiciones experimentales para mantener intactos los complejos proteicos en la fase gaseosa. A continuación, se adquieren MS y Ms.Spectra en tándem. Los espectros de MS mostraron estados de carga correspondientes en masa al complejo intacto, mientras que los experimentos de MS en tándem arrojaron un patrón de asociación de monómeros y complejos despojados.

Hola, soy Naam Kiba del Laboratorio de Miron en el Instituto de Ciencia Whiteman, y soy Isaac Ky. También soy del laboratorio de michelon. Hoy nos gustaría mostrarle el procedimiento básico para analizar grandes complejos de proteínas mediante la aplicación de espectrometría estructural, y utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para caracterizar complejos de proteínas para definir su geometría, composición y redes de interacción. Así que comencemos.

El análisis de los complejos de proteínas unidos a la corriente se realiza mediante la técnica de inmunización por pulverización de aire utilizando capilares como emme plus o a qua. Este C capilar se puede tirar hasta una punta fina de aproximadamente una micra de diámetro y luego recubrirse con material conductor como el oro. Estos capilares están disponibles comercialmente como se puede ver aquí.

Sin embargo, es mucho más rentable de usar. Los capilares de vidrio, eh, que pueden enfriarse y recubrirse hasta el estado de enfriamiento listo para usar, se realizan en este dispositivo de agrupación de agujas y el recubrimiento en este dispositivo de recubrimiento eh. Para comenzar este procedimiento, coloque dos tiras de una almohadilla adhesiva de doble cara en el fondo de una placa de Petri, manteniendo las tiras a dos centímetros de distancia.

Coloca una varilla de vidrio en el centro de una de las almohadillas. La almohadilla adhesiva mantiene los capilares en su lugar y la varilla de vidrio soporta los capilares preparados y evita que las puntas se rompan para los capilares. Capilares de vidrio de silicato Boris usados con un milímetro de diámetro exterior y 0,78 milímetros de diámetro.

Inserte un capilar en la aguja, agrupe el capilar suavemente en su lugar y ajuste su posición para que quede en el centro del filamento calefactor. Apriete las abrazaderas suavemente hasta que los capilares se mantengan firmes en ambos extremos. Tire del capilar utilizando el programa predefinido que se muestra aquí.

Sin embargo, recuerde que el proceso de programación del extractor es de prueba y error. Hasta que se obtiene una forma de punta aceptable, cada capilar tirado da lugar a dos capilares de forma final. Retire los capilares extraídos del instrumento e inspeccione las puntas, desechando las que estén deformadas o rotas.

Use pinzas de posicionamiento romas para colocar los capilares en la placa de Petri. La base de los capilares unidos a la almohadilla adhesiva y la parte superior se apoya en la varilla de vidrio con una punta apuntando hacia arriba. Continúe tirando de los capilares hasta que la placa de Petri esté llena.

Alrededor de 80 capilares caben en un plato de 10 centímetros de diámetro. A continuación, cubre los capilares con oro. Inserte la placa en el coter de pulverización catódica de oro.

Asegúrese de que el suministro de gas se elija de acuerdo con las instrucciones del fabricante y active un ciclo de recubrimiento predefinido. El recubrimiento se repite de tres a seis veces hasta que los capilares estén uniformemente dorados. Una vez que los capilares estén listos, proceda a calibrar el espectrómetro de masas.

La mayoría de los experimentos realizados en complejos MultiPro se realizan con un espectrómetro de masas de tiempo cuádruple de vuelo de Electrospray como este. Inupt de aguas, que se modifica para grandes masas. Antes de cargar la muestra de proteína, calibre el espectrómetro de masas con yoduro de cesio.

Primero, prepare una solución de 100 miligramos por mililitro de cesio en agua purificada, el cesio se utiliza para la calibración de alta masa. A medida que los grupos de sal cargados individualmente se extienden por un amplio rango de masas, desde 393 mástiles por relación de carga hasta más de 10.000. Con unas pinzas romas, tome un capilar recubierto de la placa de Petri y cargue dos microlitros de la solución de cesio en el capilar.

Usando una punta cargada de gel einor. Deslice la solución hacia la punta del capilar, ya sea manualmente o use un adaptador giratorio. Inserte el capilar en el soporte capilar y ajuste el capilar de tal manera que la punta esté aproximadamente a 10 milímetros del borde del soporte.

Coloque el capilar bajo un microscopio óptico y use pinzas afiladas tipo AA para recortar la punta. Es importante validar que no haya burbujas de aire dentro del capilar que puedan bloquear el flujo y que el capilar no esté obstruido. Además, asegúrese de que el recubrimiento de oro no se desprenda del capilar.

Si es así, reemplace el capilar o recorte la punta y retire la sección sin recubrimiento. A continuación, conecte el soporte capilar a la interfaz ESI de nano flujo. Gire la platina XY, Z hacia atrás para evitar dañar el capilar y empujar la platina a su posición activada.

El capilar debe colocarse a una distancia de uno a 10 milímetros del orificio del cono. Aplique voltaje capilar y baja presión de flujo nano hasta que se inicie la pulverización. A continuación, intente reducir la presión de flujo nano a un valor mínimo.

Optimice la intensidad de la señal ajustando la ubicación de la etapa XYZ, el voltaje capilar, la presión de flujo nano y el flujo de gas de disolución. Para detectar un amplio rango de masa de series de picos estacionales, se deben optimizar los voltajes de aceleración. Los parámetros utilizados aquí son capilar de 1,3 a 1,7 kilovoltios, cono de muestra de 80 a 150 voltios, un cono de extracción, de uno a tres voltios para optimizar la transmisión de iones de alta masa, que requieren condiciones de desalinización suaves.

La presión de respaldo se eleva de cinco a seis milibares en la etapa inicial de vacío entre la fuente y el analizador. Para aumentar la presión de respaldo, reduzca cuidadosamente la conductancia de la línea de vacío de la fuente a la bomba scroll cerrando parcialmente la válvula de aislamiento mientras monitorea el efecto sobre la intensidad de la señal. Al configurar los espectrómetros de masas completos, recopile alrededor de 30 escaneos a un escaneo por segundo en un rango de relación de carga maestra de entre 1000 y 15, 000 después de la adquisición calibre el tiempo de vuelo utilizando la tabla de calibración adecuada.

Ahora que se ha completado la calibración, se puede cargar la muestra de proteína. La muestra se prepara antes de calibrar el espectrómetro de masas, se requieren concentraciones micromolares bajas. Si es necesario, concentre la muestra utilizando dispositivos centrífugos de ultrafiltración.

Verifique que el complejo proteico no sea absorbido por la membrana del dispositivo antes de su uso. Al verificar el volumen y la absorbancia UV, solo se pueden usar soluciones volátiles para NESI, lo que a menudo hace necesario el intercambio de tampón. Se puede utilizar una columna de filtración de gel de microcentrífuga para eliminar todos los rastros de sales, moléculas tampón o cualquier otro aducto no volátil.

En su lugar, suspenda la muestra. Una solución acuosa de acetato de amonio. Este paso crítico determina la calidad de los espectros.

Repita el intercambio de tampón hasta tres veces con una dilución mínima, menos de un factor de 1,3 por dispositivo hasta que se logre el intercambio máximo. Si se requiere tanto la concentración como el intercambio de tampones, estos se pueden hacer juntos utilizando ultrafiltración centrífuga como se muestra al comienzo de esta sección. A continuación, cargue la muestra como se muestra para la calibración del yoduro de cesio e inicie la pulverización.

Comience por la optimización inicial de la pulverización hasta que se detecte la señal. Utilice la ecuación para el estado de carga promedio que se muestra en el que M es la masa del complejo. En Daltons, sin embargo, la posición exacta de los estados de carga depende de la proteína.

Para evitar la disociación compleja, no caliente la fuente de hierro. Apague el calentador o mantenga la temperatura por debajo de los 40 grados centígrados. Varíe la posición capilar, el cono de muestra y los voltajes del extractor.

Para maximizar la transmisión de hierro, un posible punto de partida es el voltaje del cono, el cono extractor de 100 voltios, un voltio y el voltaje capilar de 1,5 kilovoltios. Compruebe el cambio resultante en los espectros. Optimice estos parámetros en combinación con una presión de flujo nano para mejorar la deificación y eliminar el agua residual y los componentes del tampón.

Aumente el voltaje de polarización en la presión del gas en la celda de colisión. Los voltajes de polarización típicos están dentro del rango de 10 a 100 voltios con un flujo de gas trampa de uno a 10 mililitros por minuto. Realice esto con cuidado para evitar la asociación del complejo, ajuste la trampa y transfiera las energías de colisión.

A menudo, se requieren voltajes más altos, generalmente dentro del rango de 10 a 30 voltios, para la transmisión de iones de alta masa. En este punto, es importante evitar la disociación del complejo inducida por colisión, como se muestra aquí. Una vez alcanzada una señal estable, se ha recomendado que la presión de flujo nanométrico y el voltaje capilar se reduzcan a valores mínimos mientras se mantiene una pulverización estable.

Después de recoger varias exploraciones, se procede a identificar los componentes del complejo mediante espectrometría de masas en tándem. Una vez que se ha obtenido una señal óptima y estable para el complejo proteico, seleccione un ion precursor y establezca el centro de masa en un ancho de aislamiento. Generalmente, una resolución de masa baja de 12 y una resolución de masa alta de entre 13 y 15 utilizan un amplio rango de masa para detectar los productos de disociación de baja carga y alta masa y luego reducirlos a los valores deseados para realizar ms.

MS disocia el hierro precursor Al aumentar la energía de colisión abreviada CE y la presión en la celda de colisión, aumente la trampa o transfiera CE gradualmente en pasos de 10 a 20 voltios y eleve la presión del gas de colisión a cero a cinco mililitros por minuto. Supervise los cambios en los espectros hasta que se alcancen las condiciones óptimas de activación. La alta energía de activación puede inducir la disociación de una o más subunidades del complejo intacto y aclarar las afinidades de interacción de diferentes subunidades.

Seleccione más de un cargo para el análisis de MS MS. En el caso de componentes superpuestos, la adquisición de un conjunto de espectros MS en tándem ayuda a resolver las series de carga de las diferentes poblaciones. Además, los estados de carga más altos se disocian más fácilmente en comparación con los estados de carga más bajos superponen el MS y el ms.

Ms para validar el aislamiento del ion precursor elegido. Además de la caracterización del complejo intacto por MS y MS, MS genera subcomplejos más pequeños y soluciones en condiciones de desnaturalización leves y también los caracteriza.

El análisis MS y MS MS de subcomplejos forma la base para definir la arquitectura de subunidades del complejo para la interrupción parcial de las interacciones de subunidades subunidades agregar gradualmente solventes orgánicos hasta una concentración del 50% o cambiar el pH de la solución agregando amoníaco o ácido fórmico hasta una concentración de 4%. Para determinar las masas de las subunidades individuales que componen el complejo, es importante adquirir espectro en condiciones de desnaturalización. Esto se puede llevar a cabo utilizando la punta zip C cuatro con una proporción de acetonitrilo de 25 a 75 agua, con ácido fórmico al 1% como disolvente eluciano, con todos los datos recopilados, procese y analice los resultados como se detalla en el protocolo escrito adjunto. Antes de cargar la muestra del complejo proteico, los espectrómetros de masas se calibraron con yoduro de cesio.

La serie de picos igualmente espaciados marcados en rojo se extiende en un amplio rango desde una relación de carga maestra de 393 hasta más de 10.000. Se les asigna la tarea de cargar individualmente grupos de sal de la composición general del complejo cesio plus. Las señales adicionales entre los picos principales marcados en negro son causadas por especies de carga doble y triple de la serie cesio dos más complejo y cesio tres más complejo.

El aumento de la presión en la etapa inicial de vacío es esencial para detectar los grupos de alta masa. El efecto de la presión en los picos de masa alta se demuestra aquí con lecturas de presión de 1,2 y 5,3 milibares. El espectro de masas para la presión más alta se muestra expandido aquí.

Aquí hay un ejemplo de espectrometría de masas de un complejo variante de lectina que da lugar a una distribución de estado de carga entre 3000 y 5, 000 relación de carga maestra. Sin embargo, debido a una adecuada desalinización de los iones, los picos son amplios. El aumento del voltaje de polarización de cuatro voltios a 15 voltios, lo que provoca un aumento en las condiciones de aceleración, provoca la extracción del agua residual y los componentes del tampón que producen un espectro altamente resuelto, la masa medida corresponde a un complejo pentámero.

A continuación, se seleccionó el estado de carga más 15 para el análisis de MS en tándem. El aumento de la energía de colisión provoca la liberación de un monómero altamente cargado centrado en una relación de carga maestra de 1.664 y un complejo tetrámero despojado en el rango de 5.000 a 8.000 relaciones de carga másica. El complejo variante de lectina también se examinó en condiciones de desnaturalización que condujeron a la asociación compleja.

De esta manera, se puede determinar la masa exacta de las subunidades individuales que componen el complejo. Acabamos de mostrarle cómo adquirir espectros MS y Ms en tándem de iones de alta masa. Al realizar este procedimiento, es importante preparar adecuadamente la muestra y utilizar únicamente tampones de volatilidad compatibles con la espectrometría de masas.

Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.