Name: El análisis de grandes complejos de proteínas por espectrometría de masas estructurales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 35 s
Description: Aprende a caracterizar grandes complejos proteicos mediante espectrometría de masas estructural. Este protocolo detallado utiliza capilares dorados y optimización de condiciones para mantener los complejos intactos en fase gaseosa.

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Los autores agradecen a los miembros del grupo a Sharon por su revisión crítica, y por sus contribuciones al manuscrito. Estamos muy agradecidos por el apoyo de los Programas de Morasha y bikura, la Israel Science Foundation (Grant N º 1823 / 07 y 378/08), el Josef Cohn Minerva Centro de Investigación biomembrana, la Familia Chais Programa de Becas para los nuevos científicos, el Abraham y Sonia Rochlin Fundación, el Fideicomiso de la Familia Wolfson caridad; el Centro Helen y Milton A. Kimmelman de Estructura Biomolecular y de la Asamblea, la finca de Shlomo y Beirzwinsky Sabine; Meil ​​de Botton Aynsley, y Karen Siem, Reino Unido. Damos las gracias a Dan Tawfik y Yadid Itamar por darnos la muestra de la variante de lectina.

Parte 1: Preparación de oro recubierto de tubos capilares para la ionización electrospray nanoflujo El análisis de los complejos no covalentes se realiza generalmente por medio de la ionización por electrospray nanoflujo (NESI) 6, el uso de vidrio o cuarzo capilares que se han tirado a una punta fina (diámetro de aproximadamente 1 m interior), y recubiertas con material conductor (generalmente oro) . Tales capilares están disponibles listos para el uso de fuentes comerciales (nuevo objetivo o Proxeon), sin embargo, puede ser más rentable para prepararlos en casa: <ol><li> Palo de dos tiras de una almohadilla adhesiva de doble cara en la parte inferior de una placa de Petri, 2 cm. Coloque una varilla de vidrio (8 cm x 5 mm) en el centro de una de las almohadillas. La almohadilla adhesiva celebrará los capilares en el lugar, y la varilla de vidrio apoyará el preparado capilares, y mantener las puntas de la rotura (Fig. 1). </li><li> El uso de vidrio de borosilicato capilares, 1,0 mm x 0,78 mm de diámetro OD (utilizamos envases de 500 unidades de pared delgada capilares de borosilicato de Warner Instruments, cat.. G100TF-4). Inserte un capilar en el extractor de la aguja (utilizamos el modelo P-97 de la Compañía de Sutter Instrument). Sujete el capilar suavemente en su lugar, y ajustar su posición en la que se encuentra en el centro del filamento de calentamiento de la aguja del extractor. Apriete las abrazaderas con cuidado, hasta que el capilar se mantuvo firme en ambos extremos. </li><li> Tire de la capilaridad, mediante un programa predefinido. Cada capilar sacó dará lugar a dos final, en forma de capilares. El proceso de la programación del extractor es uno de ensayo y error, hasta que una forma de la punta aceptable se obtiene. Nosotros usamos el siguiente programa: <table border="1"><tbody><tr><td> Paso </td><td> Calor </td><td> Jale </td><td> Vell </td><td> Tiempo </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 750 </td><td> - </td><td> 15 </td><td> 80 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 700 </td><td> - </td><td> 15 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 750 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 80 </td></tr></tbody></table></li><li> Retire la tira capilares del instrumento e inspeccione las puntas, descartando las que estén deformadas o rotas. Use unas pinzas romas (que utilizar pinzas de posicionamiento de precisión CK), para colocar los vasos capilares en la placa de Petri. La base del capilar debe atribuirse a la almohadilla adhesiva y la parte superior debe apoyarse en la varilla de vidrio, con la punta hacia arriba. </li><li> Una vez que la placa de Petri está lleno (alrededor de 80 en forma capilar en un 10 cm de diámetro del plato), insertar la placa en el oro lacado por pulverización catódica (utilizamos el modelo no. EMS550, de EMS). Asegúrese de que el suministro de gas se elige de acuerdo a las instrucciones del fabricante, y activar un ciclo de recubrimiento predefinida (que utilizan la presión de argón 4 psi, a una presión de vacío de 5 x 10 -2 mbar, una corriente de 45 mA y un tiempo de recubrimiento de 1 min, por 3-6 ciclos, hasta los capilares son uniformemente de oro). </li></ol> Parte 2: Preparación de la muestra <ol><li> Bajas concentraciones micromolar de la muestra se requiere (1 - 20 M). Si es necesario, concentrar la muestra el uso de dispositivos de ultrafiltración centrífuga (por ejemplo, Vivaspin de Sartorius, o NanoSep de Pall Corporation). Se recomienda que verifique la adsorción del complejo de proteínas de la membrana dispositivo, antes de su uso. </li><li> A menudo, los topes de depuración o las soluciones de almacenamiento del complejo de proteínas no son compatibles con Nesi, para que sólo las soluciones volátiles pueden ser utilizados. Por lo tanto, el buffer de cambio es necesario. Este paso crítico en el que todos los restos de sales, las moléculas de separación o cualquier otro no volátil aductos tales como glicerol, TDT, o EDTA se retiran, determina la calidad de los espectros. Por lo general, una solución acuosa de acetato de amonio se utiliza, a una concentración de entre 5 mm y M-1, y en 6.8 pH. Buffer de cambio se puede realizar utilizando un gel de microcentrífuga columna de filtración (por ejemplo, Micro Bio-Spin seis columnas de cromatografía de Bio-Rad). Este paso puede repetirse 1-3 veces con una dilución mínima (menos de un factor de 1,3 por dispositivo 5), hasta el cambio máximo se alcanza. Si la concentración y el intercambio de buffer es necesario, estas se pueden hacer en conjunto, mediante ultrafiltración centrífuga (e, g., Vivaspin de Sartorius, o NanoSep de Pall Corporation). </li></ol> Parte 3: Calibración del espectrómetro de masas para la medición de masas de alta La mayoría de los experimentos llevados a cabo en los complejos multi-proteína se realizó con un electrospray nano cuadrupolo-tiempo de vuelo (Q-TOF) de instrumentos. Se sugiere que utilice un filtro de masas cuadrupolar ajustarse a las bajas frecuencias, para permitir el análisis y la transmisión de masas de iones de alta m / z valores de 7,8. EsTambién recomendó que las entradas de gas 7,8 o 9 mangas que añadir en el instrumento de la guía de iones de primera, a fin de controlar la presión en la etapa de primera aspiradora. Este último permite la optimización de la transmisión, y desolvatación de iones de gran tamaño 7-9. En la actualidad, comercial ESI-TOF y los instrumentos Q-TOF están disponibles de varios fabricantes (por ejemplo, las aguas, Sciex, Bruker, o Agilent) que pueden ser modificados con relativa facilidad y de forma rentable, para aplicaciones nativas de MS 7,8. Es posible, sin embargo, utilizar configuraciones estándar o TOF QTof en instrumentos tales como la LCT o QToF1 (Waters) para adquirir espectros de masas de los complejos de hasta 1 MDa, sin necesidad de modificaciones de hardware 5. El protocolo se describe a continuación se llevó a cabo en un instrumento SYNAPT (Waters). <ol><li> La preparación de 100 mg / ml de solución de CSI en agua purificada. CSI es utilizada para la calibración de masas de alta en las agrupaciones de sal con una sola carga, (CSI) n Cs + se extienden sobre una amplia variedad de masas, de 393 m / z a más de 10.000 (Fig. 2). </li><li> Con unas pinzas romas, tomar un recubrimiento capilar de la placa de Petri y 2μL carga de la solución de CsI en el capilar, utilizando una punta GeLoader Eppendorf. </li><li> Inserte el capilar en el soporte capilar, y ajustar el tubo capilar, de tal forma que la punta es de aproximadamente 10 mm de distancia del borde del soporte. </li><li> Deslice la solución hacia la punta del capilar, ya sea manualmente o utilizando un adaptador de girar. </li><li> Colocar los capilares bajo un microscopio óptico y el ajuste de la punta, con el fuerte tipo AA pinzas. </li><li> Conecte el soporte capilar para la interfaz ES nanoflujo. Gire la etapa xyz hacia atrás para evitar daños en los capilares, e impulsar la etapa en su posición activa. El capilar se debe colocar 1 - 10 mm desde el orificio del cono. </li><li> Aplicar la tensión capilar (1050-1400 V) y la presión nanoflujo baja (0.00-0.03 bar) hasta el spray se inicia, a continuación, tratar de reducir la presión nanoflujo a un valor mínimo. </li><li> Optimizar la intensidad de la señal mediante el ajuste de la ubicación de la etapa de xyz, la tensión capilar, la presión nanoflujo, y el flujo de gas desolvatación. </li><li> Para detectar una amplia variedad de masas de CSI pico serie, las tensiones de la aceleración debe ser optimizado (se utilizan los siguientes parámetros: capilar 1.3-1.7 kV, el cono de la muestra de 80 150 V, la extracción de cono de 1.3 V). </li><li> Para optimizar la transmisión de los iones de alta masa, que requieren condiciones suaves desolvatación, la presión de apoyo en la fase de vacío inicial, entre la fuente y el analizador, debe ser levantado. Esto se puede lograr mediante una cuidadosa reducción de la conductancia de la línea de vacío de origen a la bomba de desplazamiento, cerrando parcialmente la válvula de aislamiento (SpeediValve). Con el fin de definir el punto óptimo, el último debe hacerse mientras se observa el efecto sobre la intensidad de la señal (por lo general el uso 3,0-6,5 mbar). </li><li> Recoger alrededor de 30 exploraciones a un exploraciones / segundo, en un rango de m / z de entre 1.000 y 15.000 m / z. </li><li> Después de la adquisición, calibrar el TOF utilizando la tabla de calibración adecuada. </li></ol> Parte 4: MS de complejos de proteínas intactas <ol><li> Cargue la muestra, tal como se describe (Parte 3, Secciones 2-5), e iniciar la aspersión. </li><li> Para empezar, la optimización inicial de la espuma (la parte 3, secciones 6-9), hasta que se recibe la señal. La posición exacta de los estados de carga es dependiente de la proteína, sin embargo, se pueden predecir, utilizando la relación entre la masa de iones y el estado de carga media, por lo tanto: (Z av) 10: Z = 0,0778 av √ (m), en la que m es la masa del complejo en Daltons. Para evitar la disociación complejo, no se calientan la fuente de iones: o bien cambiar el calentador, o mantener la temperatura por debajo de 40 ° C. </li><li> Variar la posición capilar, el cono de la muestra y de las tensiones extractor para maximizar la transmisión de iones, y comprobar los cambios que provoca en el espectro. Un posible punto de partida podría ser el cono de tensión de 100 V, extractor de cono: 1 V, la tensión capilar 1,5 kV. Optimizar estos parámetros, en combinación con la presión nanoflujo. </li><li> Para mejorar la desolvatación y tira el agua residual y los componentes del tampón, aumentar la tensión de polarización y la presión del gas en la celda de colisión. Este paso debe ser realizado cuidadosamente, para evitar la disociación del complejo. Voltajes típicos prejuicios están dentro del rango de 10 a 100 V, con un flujo de gas trampa de 10-10 ml / min (Fig. 3). El ajuste manual de la configuración de RF y el perfil de cuadrupolo pueden mejorar la transmisión de iones de alta masa. </li><li> Ajuste la trampa y las energías de transferencia de colisión. A menudo, los voltajes más altos son necesarios para la emisión de iones de alta masa (por lo general dentro del rango de 10-30 V). En este punto, es importante para evitar la colisión inducida por la disociación del complejo. </li><li> Después de una señal estable es reached, se recomienda que la presión y la tensión capilar nanoflujo disminuir a valores mínimos, mientras se mantiene estable spray. </li></ol> Parte 5: espectrometría de masas en tándem: disociar los complejos de proteínas <ol><li> Una vez que una señal óptima y estable que se haya obtenido, seleccione un ión precursor. Establecer el centro de masa y la anchura de aislamiento (por lo general, utilice una resolución de LM, de 12, y una resolución de SM de entre 13 y 15). Use un amplio rango de masas para detectar la masa de alta / baja productos de la disociación de carga. Se recomienda que se establece el rango de m / z en el nivel máximo, y luego reducirlo a los valores deseados. Además, sugerimos la superposición de las MS y MS / MS espectros, para validar el aislamiento del ión precursor seleccionado. </li><li> Para llevar a cabo MS / MS, disociar el ión precursor mediante el aumento de la energía de colisión (CE) y la presión en la celda de colisión. Aumentar o trampa o transferencia CE gradualmente, en pasos de 10-20V, y elevar la presión del gas de colisión a 0-5 ml / min (valores comunes). Seguimiento de los cambios en el espectro hasta que las condiciones de activación óptimo se alcanza. Alta energía de activación puede provocar la disociación de una o más subunidades del complejo intacto, y aclarar las afinidades interacción de diferentes subunidades. Por lo general el uso de argón como gas de colisión en la trampa de las células / transferencia, aunque los beneficios de la utilización de un gas más pesado (por ejemplo, Xe o SF 6) se han reportado, sin embargo, estos gases son sustancialmente más caros 11 (Fig. 3). </li><li> Se recomienda que más de un estado de carga de ser seleccionados para análisis MS / MS. En el caso de componentes que se superponen, la adquisición de un conjunto de tándem MS espectros ayudará a resolver la serie cargo de las diferentes poblaciones. Por otra parte, los estados superiores de carga se disocian con más facilidad, en comparación con estados de carga inferior 12. </li><li> Además de la caracterización del complejo intacto, se sugiere que los pequeños subcomplejos en la solución se genera, en condiciones suaves de desnaturalización. La MS y MS / MS de subcomplejos forman la base para la definición de la arquitectura de la subunidad del complejo 13. Por la interrupción parcial de las interacciones subunidad subunidad, añadir poco a poco solventes orgánicos (por ejemplo, metanol, isopropanol o acetonitrilo) a una concentración de 50%, o cambiar el pH de la solución mediante la adición de amoniaco o ácido fórmico (hasta una concentración de 4 %). </li><li> Para determinar las masas de las subunidades que componen el complejo, es importante para adquirir un espectro bajo condiciones de desnaturalización. Esto puede llevarse a cabo con Zip-Tip C 4 (Millipore) con 25:75 agua / acetonitrilo relación, con 1% de ácido fórmico como solvente de elución. </li></ol> Parte 6: procesamiento y análisis de datos <ol><li> Los datos se analizan en línea, utilizando un análisis espectral de los programas de MS espectros. Generalmente utilizamos el programa MassLynx (Waters). </li><li> Para espectros que abarcan una amplia gama de m / z gama, se recomienda que los planes de diferentes parámetros de suavizado y centro de gravedad se aplicará para la alta y baja m / z regiones, para reflejar la diferencia en la resolución máxima de estas regiones. </li><li> Para identificar las series de carga y cálculo de estados de carga y de las masas, el "manual de encontrar" la función de MassLynx se puede aplicar. En los casos de espectros de masas complejas con componentes que se superponen, el cálculo manual de las masas puede ser más fácil. </li><li> Para facilitar estos procesos de asignación, software adicional se puede utilizar, por ejemplo: MaxEnt para deconvolución espectros 14 SOMMS para el montaje de pico y simulación de 15, y la Cumbre para la asignación de la composición y estequiometría de subcomplejos proteína y la generación de redes de interacción de proteínas 13,16,17 . </li></ol> Parte 7: Resultados de Representante <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Preparación recubierto de oro nano-electrospray capilares. A. Coloque dos de doble cara cinta adhesiva a una placa de Petri, 2 cm. Para apoyar el preparado capilares, coloque una varilla de vidrio (8 cm x 5 mm) en el centro de una de las almohadillas. B. Pegue el extremo romo del preparado capilares de la almohadilla adhesiva, y apoyarse en la punta de la varilla de vidrio. C. Una vez que la placa de Petri se llena con los preparados capilares, escudo de oro hasta que una fina capa de oro es depositado uniformemente sobre la superficie externa de los capilares. <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Calibración de masas de alta con yoduro de iones de cesio. Los grandes grupos y monisotopic de CSI han convertido en el compuesto de elección para la calibración de los espectrómetros de masas para el análisis de masas de alta. La serie de picos equidistantes se extienden sobre una amplia gama, desde m / z 393 a más de 10.000. Son assigNED a grupos con una sola carga de sal de la composición general (CsI) n + Cs. Señales adicionales entre los picos más importantes son causadas por especies de doble y triple carga de la serie, [(CsI) n Cs2] 2 + y [(CsI) n Cs3] 3 +, respectivamente. El aumento de la presión en la fase de vacío inicial es esencial para detectar los grupos de masas de alta. El efecto de la presión en los picos de alta masa se ​​demuestra en los paneles A. y B. con las colaciones de presión de 1,2 y 5,3, respectivamente. C. La expansión del espectro de masas se muestra a la B. <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Nanoflujo electrospray espectros de masas de una lectina pentamérica. A. La espectrometría de masas de un complejo de la variante de lectina (derivado de Lib1-B7 por la evolución dirigida 18) da lugar a una distribución de estado de carga entre 3.000 y 5.000 m / z, sin embargo, debido a la desolvatación inadecuada de los iones, los picos son amplias. Comparativa de panel A. y B. muestran el efecto de aumentar la tensión de polarización de 4V (A). A 15 V (B). Sobre la anchura del pico. Este aumento en las condiciones de acelerar las causas de la extracción de agua residual y los componentes de amortiguación, proporcionando un espectro muy resuelto. La masa medida (60240 ± 38 Da) corresponde a un complejo pentamérica. C. El estado de carga de 15 fue seleccionado para el análisis de MS en tándem (sombreados en gris en el panel B). D. El aumento de la energía de colisión provoca la liberación de un monómero muy cargada, centrada en 1.664 m / z, y una compleja rectificada tetramérica, en el rango de 5.000 - 8.000 m / z. Todos los espectros fueron obtenidos de una muestra que contiene 20 mM de solución de acetato de amonio 0,5 M.

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<li>van Duijn, E., Heck, A. J., Vies, S. M. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inter-ring+communication+allows+the+GroEL+chaperonin+complex+to+distinguish+between+different+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Inter-ring communication allows the GroEL chaperonin complex to distinguish between different substrates.</a> Protein Sci. 16 (5), 956-965 (2007).</li>
<li>van Duijn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+mass+spectrometry+of+intact+GroEL-substrate+complexes+reveals+substrate-specific+conformational+changes+in+the+trans+ring%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Tandem mass spectrometry of intact GroEL-substrate complexes reveals substrate-specific conformational changes in the trans ring.</a> J Am Chem Soc. 128 (14), 4694-4702 (2006).</li>
<li>Synowsky, S. A., van Wijk, M., Raijmakers, R., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+multiplexed+mass+spectrometric+analyses+of+endogenously+expressed+yeast+nuclear+and+cytoplasmic+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative multiplexed mass spectrometric analyses of endogenously expressed yeast nuclear and cytoplasmic exosomes.</a> J Mol Biol. 385 (4), 1300-1313 (2009).</li>
<li>Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+organization+of+the+19S+proteasome+lid%3A+insights+from+MS+of+intact+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural organization of the 19S proteasome lid: insights from MS of intact complexes.</a> PLoS Biol. 4 (8), e267-e267 (2006).</li>
<li>Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+reveals+modularity+and+a+complete+subunit+interaction+map+of+the+eukaryotic+translation+factor+eIF3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry reveals modularity and a complete subunit interaction map of the eukaryotic translation factor eIF3.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18139-18144 (2008).</li>
</ol>

Para adquirir la atención de alta calidad de los espectros se debe dar a los pasos de preparación de muestras, que incluyen la concentración de la muestra y el intercambio de buffer. Más muestras diluidas dará una señal de baja, mientras que las muestras de alta concentración puede ser algo viscoso, y bloquear la aguja electrospray. Por otra parte, los aditivos solución tales como sales, glicerina, detergentes, iones metálicos, y agentes reductores (DTT o β-mercaptoetanol), tienden a adherirse a la superficie exterior de las proteínas, y causar ensanchamiento de los picos. Por lo tanto, con el fin de alcanzar picos bien resueltos, estos componentes deben ser añadidos a las concentraciones más bajas posible. Otro parámetro importante es la posición de la nanoflujo capilar, en relación con el orificio del espectrómetro de masas. Encontrar el &quot;sweet spot&quot; puede ser un reto para los usuarios sin experiencia, sin embargo, que influye significativamente en la calidad de los espectros. También es importante examinar las nanoflujo capilar antes del inicio de la pulverización. El tamaño de la gota es una función del diámetro de la punta, que debe ser ~ 1μm. Pequeñas gotas de plomo a la ionización más eficiente, y por lo tanto sería ventajoso. También es importante comprobar que no hay burbujas de aire dentro de los capilares que podrían bloquear el flujo, y que el recubrimiento de oro no se extrae del capilar durante la adquisición, si es así, más acabado de la punta. Tenga en cuenta que una cantidad excesiva de la muestra se incrementará la posibilidad de optimizar las condiciones de MS, como la tensión capilar, voltajes de aceleración, presión y energía de la colisión. En general, los procedimientos que se explican en el protocolo se han utilizado para determinar la composición, la estequiometría y la arquitectura de numerosos complejos de proteínas (ver comentarios 2,3,4). El análisis de grandes conjuntos MDa como el ribosoma 19 y muy ordenado cápsides virus 20-22, en la definición de la unión del sustrato a las máquinas moleculares 23-25, o la caracterización de redes de interacción de la subunidad 26,17,16,17,27,28 servir como sólo algunos ejemplos del valor de este enfoque.

Requisitos de la muestra: <table border="1"><tr><td> Muestra </td><td> Requisito </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Volumen </td><td> 2.1 l </td><td> Por capilaridad </td></tr><tr><td> Concentración </td><td> 1-20μM </td><td> Por complejos </td></tr><tr><td> Buffer </td><td> Buffer Aquanos volátiles tales como acetato de amonio a pH = 6-8 </td><td> Por lo general 5 mM-1M </td></tr><tr><td> Detergente </td><td> Mínimo </td><td> Los racimos de moléculas de detergente produce picos anchos y sin resolver </td></tr><tr><td> Glicerol </td><td> Mínimo (hasta un 5%) </td><td> Se adhiere a las proteínas de forma no específica y, en consecuencia, se observan picos anchos </td></tr><tr><td> Disolventes orgánicos </td><td> Hasta un 50% </td><td> Pueden desnaturalizar las proteínas complejos </td></tr><tr><td> Ácidos </td><td> Hasta el 4% </td><td> Complejos de desnaturalizar las proteínas </td></tr><tr><td> Sales </td><td> Mínimo </td><td> Aductos de sal de plomo a los picos de ancho y sin resolver </td></tr><tr><td> TDT </td><td> Mínimo </td><td> M 1.2 puede estar presente </td></tr><tr><td> Agentes quelantes </td><td> Mínimo </td><td> Más de 250 M conducir a la formación de aductos amplia </td></tr></table>

el análisis de grandes complejos de proteínas por espectrometría de masas estructurales

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Las células vivas controlar y regular sus procesos biológicos a través de la acción coordinada de un gran número de proteínas que se ensamblan en una serie de dinámicas, múltiples complejos de proteínas 1. Para obtener una comprensión mecanicista de los procesos celulares diferentes, es crucial para determinar la estructura de los complejos de proteínas, y revela cómo su organización estructural dictados de su función. Muchos aspectos de los complejos multi-proteína, sin embargo, difícil de caracterizar, debido a su heterogeneidad, la estructura asimétrica, y la dinámica. Lo tanto, se requieren nuevos enfoques para el estudio de los niveles superiores de la organización de las proteínas. Una de las herramientas de la biología estructural emergentes para el análisis de complejos macromoleculares es la espectrometría de masas (MS) 2-5. Este método proporciona información sobre la composición de proteínas complejas, estequiometría de subunidades, y la topología estructural. El poder de la MS se deriva de su alta sensibilidad y, en consecuencia, el requisito de la muestra bajo, lo que le permite examinar los complejos de proteínas expresadas en los niveles endógenos. Otra ventaja es la velocidad de análisis, que permite la monitorización de las reacciones en tiempo real. Por otra parte, la técnica puede medir simultáneamente las características de las poblaciones separadas que coexisten en una mezcla. Aquí se describe un protocolo detallado para la aplicación de MS estructurales para el análisis de conjuntos de proteínas de gran tamaño. El procedimiento comienza con la preparación de los capilares recubiertas de oro para la ionización electrospray nanoflujo (NESI). Luego continúa con la preparación de muestras, haciendo hincapié en las condiciones de amortiguamiento que debe ser compatible con NESI por un lado, y permiten mantener intactas complejos en el otro. A continuación, explicar, paso a paso, cómo optimizar las condiciones experimentales para la medición de masas de alta y adquirir MS y MS en tándem espectros. Por último, la tabla de procesamiento de datos y análisis que siguen. En lugar de tratar de caracterizar todos los aspectos de las asambleas de proteínas, este protocolo presenta los procedimientos básicos de MS, lo que permite el rendimiento de MS y MS / MS experimentos en los complejos no covalentes. En general, nuestro objetivo es proporcionar a los investigadores no conocen el campo de la MS estructurales, con el conocimiento de las herramientas experimentales principal.

Espectrometría de masas ha demostrado ser una valiosa herramienta para el análisis de grandes complejos de proteínas. Este método permite a los puntos de vista en la arquitectura de la composición, estequiometría y en general de las asambleas de múltiples subunidades. Aquí se describe, paso a paso, cómo realizar un análisis de espectrometría de masas estructurales, y caracterizar estructuras macromoleculares.

El análisis de grandes complejos de proteínas por espectrometría de masas estructurales

Las células vivas controlan y regulan sus procesos biológicos mediante la acción coordinada de un gran número de proteínas que se ensamblan en un ...

El objetivo general del siguiente experimento es caracterizar ensamblajes proteicos grandes mediante espectrometría de masas estructural. Esto se logra preparando capilares plateados con oro para la ionización por electroaspersión de flujo nano. Como segundo paso, se prepara la muestra y se calibra el espectrómetro de masas para mediciones de alta masa. A continuación, se optimizan las condiciones experimentales con el fin de mantener los complejos proteicos intactos en la fase gaseosa. Luego se adquieren espectros de MS y espectros en tándem. Los espectros de MS mostraron estados de carga que correspondían en masa al complejo intacto, mientras que los experimentos de MS en tándem produjeron el patrón de asociación de monómeros y complejos desprovistos.Hola, soy Naam Kiba del Laboratorio de Miron en el Instituto Whiteman de Ciencia, y yo soy Isaac Ky. También soy del laboratorio de Michelon. Hoy queremos mostrarles el procedimiento básico para analizar complejos proteicos grandes mediante espectrometría estructural, y utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para caracterizar complejos proteicos y definir su geometría estequiométrica, composición y redes de interacción. Comencemos.El análisis de complejos de proteínas no corrientes se realiza mediante la técnica de inmunización por pulverización aérea utilizando capilares Emm Plus o Qua. Este capilar C puede estirarse hasta obtener una punta fina de aproximadamente un micrómetro de diámetro y luego recubrirse con un material conductor como oro. Estos capilares están disponibles comercialmente, como se puede ver aquí.Sin embargo, es mucho más rentable su uso. Las capilares de vidrio, eh, que pueden enfriarse y recubrirse hasta alcanzar el estado listo para usar, se someten a enfriamiento en este dispositivo de agrupamiento de agujas y recubrimiento en este dispositivo de recubrimiento, eh. Para comenzar este procedimiento, fije dos tiras de una almohadilla adhesiva de doble cara en la parte inferior de una placa de Petri, manteniendo las tiras separadas por dos centímetros.Coloque una varilla de vidrio en el centro de una de las almohadillas. La almohadilla adhesiva mantiene las capilares en su lugar y la varilla de vidrio sostiene las capilares preparadas y evita que se rompan las puntas de las capilares. Se utilizaron capilares de vidrio de silicato Boris con un diámetro externo de un milímetro y un diámetro interno de 0,78 milímetros.Inserte un capilar en la aguja, sujételo suavemente en su lugar y ajuste su posición para que quede en el centro del filamento de calentamiento. Apriete las abrazaderas suavemente hasta que los capilares queden firmes en ambos extremos. Tire del capilar utilizando el programa predefinido que se muestra aquí.Sin embargo, recuerde que el proceso de programación del extractor es un proceso de prueba y error. Hasta obtener una forma de punta aceptable, cada capilar extraído da lugar a dos capilares con forma final. Retire los capilares extraídos del instrumento e inspeccione las puntas, descartando aquellos que estén deformados o rotos.Utilice pinzas de posicionamiento romas para colocar los capilares en la placa de Petri. La base de los capilares se adhiere a la almohadilla adhesiva y la parte superior se apoya en la varilla de vidrio con la punta orientada hacia arriba. Continúe tirando de los capilares hasta que la placa de Petri esté llena.Aproximadamente 80 capilares caben en un plato de 10 centímetros de diámetro. A continuación, recubra los capilares con oro. Inserte la placa en el evaporador de oro por pulverización catódica.Asegúrese de que el suministro de gas se elija según las instrucciones del fabricante y active un ciclo de recubrimiento predefinido. El recubrimiento se repite de tres a seis veces hasta que los capilares adquieran un color dorado uniforme. Una vez que los capilares estén listos, proceda a calibrar el espectrómetro de masas.La mayoría de los experimentos realizados con complejos MultiPro se llevan a cabo mediante un espectrómetro de masas cuadrupolo con tiempo de vuelo y electroaspersión como este. Entrada de waters, modificada para masas elevadas. Antes de cargar la muestra proteica, calibre el espectrómetro de masas utilizando yoduro de cesio.Primero, prepare una solución de 100 miligramos por mililitro de cesio en agua purificada; el cesio se utiliza para la calibración de alta masa. Dado que los agregados de sal cargados sencillamente abarcan un amplio rango de masas, desde una relación masa/carga de 393 hasta valores superiores a 10.000, utilice pinzas romas para tomar un capilar recubierto de la placa de Petri y cargue dos microlitros de la solución de cesio en el capilar.Utilizando una punta cargada con gel einor. Deslice la solución hacia la punta del capilar, ya sea manualmente o mediante un adaptador de centrifugación. Introduzca el capilar en el porta-capilares y ajústelo de manera que la punta quede aproximadamente a 10 milímetros del borde del soporte.Coloque la capilaridad bajo un microscopio óptico y utilice pinzas finas de tipo AA para recortar la punta. Es importante verificar que no haya burbujas de aire dentro de la capilaridad que puedan obstruir el flujo y que la capilaridad no esté obstruida. Además, asegúrese de que el recubrimiento de oro no se haya desprendido de la capilaridad.En caso afirmativo, reemplace el capilar o recorte la punta y retire la sección sin recubrir. A continuación, conecte el porta-capilares al interfaz ESI de flujo nano. Gire el escenario XY, Z hacia atrás para evitar dañar el capilar y empuje el escenario hacia su posición activada.El capilar debe colocarse a una distancia de uno a diez milímetros del orificio del cono. Aplique voltaje al capilar y presión baja de flujo nano hasta que comience la pulverización. Luego, intente reducir la presión de flujo nano a un valor mínimo.Optimice la intensidad de la señal ajustando la posición del escenario XYZ, el voltaje del capilar, la presión de flujo nano y el flujo de gas de desolvatación. Para detectar una amplia gama de masas de series de picos estacionales, deben optimizarse los voltajes de aceleración. Los parámetros utilizados aquí son: capilar de 1,3 a 1,7 kilovoltios, cono de muestra de 80 a 150 voltios y cono de extracción de uno a tres voltios, para optimizar la transmisión de iones de alta masa, que requieren condiciones suaves de desalación.La presión de respaldo se eleva a entre cinco y seis milibares en la etapa de vacío inicial entre la fuente y el analizador. Para aumentar la presión de respaldo, reduzca cuidadosamente la conductancia de la línea de vacío de la fuente hacia la bomba espiral cerrando parcialmente la válvula de aislamiento, mientras monitorea el efecto sobre la intensidad de la señal. Al configurar completamente los espectrómetros de masas, recolecte aproximadamente 30 escaneos a un escaneo por segundo en un rango de relación carga-masa maestro entre 1000 y 15 000; después de la adquisición, calibre el tiempo de vuelo utilizando la tabla de calibración adecuada.Ahora que la calibración está completa, se puede cargar la muestra de proteína. La muestra se prepara antes de calibrar el espectrómetro de masas; se requieren concentraciones bajas en micromolar. Si es necesario, concentre la muestra utilizando dispositivos de ultrafiltración centrífuga.Verifique que el complejo proteico no esté absorbido en la membrana del dispositivo antes de su uso. Al comprobar el volumen y la absorbancia UV, solo pueden usarse soluciones volátiles para NESI, lo que a menudo hace necesario el intercambio de tampón. Puede utilizarse una columna de filtración en gel de microcentrífuga para eliminar todos los rastros de sales, moléculas de tampón o cualquier otro aducto no volátil.En cambio, suspenda la muestra en una solución acuosa de acetato de amonio. Este paso crítico determina la calidad de los espectros.Repita el intercambio de tampón hasta tres veces con una dilución mínima, inferior a un factor de 1,3 por dispositivo, hasta alcanzar el intercambio máximo. Si se requieren tanto la concentración como el intercambio de tampón, estos pueden realizarse simultáneamente mediante filtración ultra centrífuga, como se acaba de mostrar al principio de esta sección. A continuación, cargue la muestra como se muestra para la calibración con yoduro de cesio e inicie el aerosol.Comience con la optimización inicial del aerosol hasta que se detecte la señal. Utilice la ecuación para el estado de carga promedio mostrada, en la que M es la masa del complejo. Sin embargo, en Daltons, la posición exacta de los estados de carga depende de la proteína.Para evitar la disociación del complejo, no caliente la fuente de hierro. Apague el calentador o mantenga la temperatura por debajo de 40 grados Celsius. Varíe la posición del capilar, así como los voltajes del cono de muestra y del extractor.Para maximizar la transmisión de hierro, un punto de partida posible es el voltaje del cono, 100 voltios para el cono extractor, un voltio y un voltaje de capilar de 1,5 kilovoltios. Verifique el cambio resultante en los espectros. Optimice estos parámetros en combinación con una presión de flujo nano para mejorar la desolvatación y eliminar los componentes residuales de agua y tampón.Aumente el voltaje de polarización junto con la presión del gas en la celda de colisión. Los voltajes de polarización típicos se encuentran en el rango de 10 a 100 voltios con un flujo de gas de trampa de uno a 10 mililitros por minuto. Realice este procedimiento con cuidado para evitar la asociación del complejo, y ajuste las energías de colisión de trampa y transferencia.A menudo se requieren voltajes más altos, generalmente dentro del rango de 10 a 30 voltios, para la transmisión de iones de alta masa. En este punto, es importante evitar la disociación inducida por colisión del complejo, como se muestra aquí. Una vez que se alcanza una señal estable, se recomienda reducir la presión del flujo nano y el voltaje del capilar a valores mínimos manteniendo al mismo tiempo un spray estable.Después de recopilar varios escaneos, proceda a identificar los componentes del complejo mediante espectrometría de masas en tándem. Una vez que se haya obtenido una señal óptima y estable para el complejo proteico, seleccione un ion precursor y establezca el centro de masa en el ancho de aislamiento. Generalmente, utilice una resolución de masa baja de 12 y una resolución de masa alta entre 13 y 15 con un rango de masa amplio para detectar los productos de disociación de alta masa y baja carga, y luego reduzca el rango a los valores deseados para realizar la ms.La disociación por MS del precursor de hierro se logra aumentando la energía de colisión, abreviada como CE, y la presión en la celda de colisión; aumente gradualmente la CE de captura o transferencia en pasos de 10 a 20 voltios y eleve la presión del gas de colisión de cero a cinco mililitros por minuto. Monitoree los cambios en los espectros hasta alcanzar las condiciones óptimas de activación. Una energía de activación elevada puede inducir la disociación de una o más subunidades del complejo intacto y aclarar las afinidades de interacción de las diferentes subunidades.Seleccione más de una carga para el análisis de MS. En el caso de componentes solapados, adquirir un conjunto de espectros de MS en tándem ayuda a resolver la serie de cargas de las diferentes poblaciones. Además, los estados de carga más altos se disocian más fácilmente en comparación con los estados de carga más bajos; superponga el MS y el ms.Espectros de MS para validar el aislamiento del ion precursor elegido. Además de la caracterización del complejo intacto mediante MS y MS/MS, generar subcomplejos más pequeños en solución bajo condiciones desnaturalizantes suaves y caracterizarlos también.El análisis por MS y MS/MS de subcomplejos constituye la base para definir la arquitectura de subunidades del complejo. Para interrumpir parcialmente las interacciones entre subunidades, se añaden gradualmente disolventes orgánicos hasta una concentración del 50 %, o se modifica el pH de la solución mediante la adición de amoníaco o ácido fórmico hasta una concentración del 4 %. Finalmente, para determinar las masas de las subunidades individuales que componen el complejo, es fundamental adquirir el espectro bajo condiciones desnaturalizantes. Esto puede realizarse utilizando un tip Zip C4 con una proporción de agua-acetonitrilo del 25 al 75 % y ácido fórmico al 1 % como disolvente de elución. Todos los datos recopilados se procesan y analizan según se detalla en el protocolo escrito adjunto. Antes de cargar la muestra del complejo proteico, se calibra el espectrómetro de masas utilizando yoduro de cesio.La serie de picos igualmente espaciados marcados en rojo se extiende sobre un amplio rango, desde una relación de carga principal de 393 hasta bien pasados los 10 000. Se asignan a agregados de sal con carga sencilla de la composición general del complejo de cesio más. Las señales adicionales entre los picos principales marcados en negro son causadas por especies con carga doble y triple de la serie del complejo de cesio dos más y del complejo de cesio tres más.Incrementar la presión en la etapa inicial de vacío es esencial para detectar los cúmulos de alta masa. Aquí se demuestra el efecto de la presión sobre los picos de alta masa con lecturas de presión de 1,2 y 5,3 milibares. El espectro de masas para la presión más alta se muestra ampliado aquí.Aquí se muestra un ejemplo de espectrometría de masas de un complejo de variante de lectina que da lugar a una distribución de estados de carga entre 3000 y 5.000 de relación masa/carga. Sin embargo, debido a una desalificación adecuada de los iones, los picos son amplios. Al aumentar el voltaje de polarización de cuatro a 15 voltios, lo que provoca un incremento en las condiciones de aceleración, se produce la eliminación de agua residual y componentes del tampón, obteniéndose un espectro altamente resuelto, cuya masa medida corresponde a un complejo pentamérico.El estado de carga positivo 15 se seleccionó luego para el análisis de MS en tándem. El aumento en la energía de colisión provoca la liberación de un monómero altamente cargado centrado en una relación carga/masa de 1,664 y un complejo tetramérico despojado en el rango de 5,000 a 8,000 de relación masa/carga. El complejo de la variante de lectina también se examinó bajo condiciones desnaturalizantes, lo que llevó a la asociación del complejo. De este modo, se puede determinar la masa exacta de las subunidades individuales que componen el complejo. Acaban de mostrarse cómo adquirir espectros de MS y espectros en tándem de iones de alta masa. Al realizar este procedimiento, es importante preparar adecuadamente la muestra y utilizar únicamente tampones volátiles compatibles con la espectrometría de masas.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Investigación

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Biología

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La combinación de reticulación química y espectrometría de masas de complejos de proteína intacta para el estudio de la arquitectura de multi-subunidades proteína asambleas

Aquí presentamos un protocolo para supervisar el montaje y desmontaje de la toxina del ántrax mediante interferometría de la biocapa (BLI). Tras el montaje y desmontaje en la superficie del biosensor, los complejos de proteínas grandes son liberados de la superficie para la visualización e identificación de componentes de los complejos usando microscopia electrónica y espectrometría de masas, respectivamente.

Análisis complejos de la proteína dinámica montan en y de interferometría de biocapa Biosensor usando espectrometría de masas y microscopia electrónica

Espectrometría de masas (MS) se ha convertido en una herramienta importante para la investigación de la estructura y la dinámica de asambleas macromoleculares. Aquí, integramos los enfoques basados en la MS para interrogar la formación de complejos de proteína y de ligando.

Análisis de arquitecturas de proteínas y complejos de proteína-ligando por espectrometría de masa estructural integrativo

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Se describen los procedimientos experimentales para realizar el etiquetado covalente a base de dietilpirocarbonato con detección espectrométrica de masas. El dietilpirocarbonato simplemente se mezcla con la proteína o complejo proteico de interés, lo que lleva a la modificación de residuos de aminoácidos accesibles al disolvente. Los residuos modificados se pueden identificar después de la digestión proteolítica y la cromatografía líquida / análisis de espectrometría de masas.

Etiquetado Covalente Con Dietilpirocarbonato Para El Estudio De La Estructura De Orden Superior De Proteínas Por Espectrometría De Masas

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El análisis de grandes complejos de proteínas por espectrometría de masas estructurales

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