La cuantificación de γH2AX focos en respuesta a la radiación ionizante

Hola, soy Ian Ma del Laboratorio de Medicina Epigenómica dirigido por el Dr. Tom Caris en el Baker Eye, DI Heart and Diabetes Institute. Actualmente estoy realizando mi doctorado, que tiene un fuerte enfoque en los efectos de la radiación en Gamma H dos A X, que es el marcador molecular de las roturas de doble cadena. Hoy voy a demostrar un experimento sobre la cuantificación de Gamma H dos A expo en respuesta a la radiación gamma en cretas humanas.

Este protocolo de inmunotinción se puede utilizar para controlar tanto el daño inicial del ADN como la reparación del ADN. Este método también es útil para evaluar la eficacia de posibles compuestos modificadores de la radiación. Por ejemplo, los radiosensibilizadores, que se espera que aumenten el daño al ADN, darán como resultado un mayor número de gamma H dos A X cuatro lados, mientras que los radioprotectores tendrían el efecto contrario con un menor número de ForSight detectado debido a una reducción en las trenzas de doble cadena de ADN.

Ahora comencemos el experimento. Experimento. Las células utilizadas en este experimento son citos humanos, que se preparan en portaobjetos de cámara con 10.000 células colocadas en cada pocillo. Los portaobjetos se incuban a 37 grados en dióxido de carbono al 5% durante tres días antes de la radiación.

Cortar el irradiador 2D transportador en hielo, luego irradiar a dos grises mientras que los portaobjetos controlados se dejan sin irradiar. Después de que los portaobjetos de irradiación se devuelven a la incubadora durante una hora, este período de incubación nos permite observar el daño inicial en el ADN. Luego viene la mancha.

Los medios primero deben construir los pozos con cuidado antes de agregar 300 microlitros de PBS libre de cloruro de calcio y cloruro de magnesio en la cámara. Para enjuagar las células, corte la izquierda en el agitador de platos durante cinco minutos antes de que el PBS se incline suavemente. Las siguientes celdas se fijan en cien microlitros de paraldehído al 4% y se dejan a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de colocarse en un frasco de cartón lleno de PBS en el agitador de placas durante cinco minutos.

Este paso de lavado se repite para dar un total de tres lavados de cinco minutos. Después del lavado, las diapositivas se secan suavemente sobre papel absorbente. Para eliminar el exceso de PBS, las células se premiumizan en cien microlitros de 0.1%Pruebe los siguientes 100 durante 10 minutos a temperatura ambiente Después de 10 minutos, los portaobjetos se lavan en PB S3 veces durante cinco minutos cada uno como se muestra anteriormente.

A continuación, se añadieron cien microlitros de 1%BSA en ese pocillo y se dejaron durante 20 minutos para bloquear la unión inespecífica. Después del paso de bloqueo, se sacude el BSA y se administran cien microlitros de anticuerpo primario, que se compone de una dilución de uno en 500 de antifosfo. Se añade un anticuerpo Gamma H dos X en cada pocillo.

Los portaobjetos se dejan a temperatura ambiente durante una hora, seguida de tres lavados de cinco minutos en PBS. Se sacude el exceso de PBS y se añaden cien microlitros de anticuerpo secundario, que consiste en una dilución de uno en 500 de Alexa floor 4 88 gold anti mouse IgG en cuyo pozo y se deja incubar en la oscuridad durante 45 minutos a temperatura ambiente, al final de la incubación los portaobjetos se lavan en PB S3 veces durante cinco minutos cada uno cubierto con papel de aluminio para evitar el fotoblanqueo. Cien microlitros de la mancha nuclear.

Se agrega la fila superior tres durante 10 minutos, seguido de dos lavados de cinco minutos. Con PBS, las cámaras ahora están listas para ser retiradas de la corredera. Retire suavemente las cámaras tirando hacia arriba y suelte la corredera de su soporte.

Elimine el exceso de humedad y deje que los portaobjetos se sequen antes de agregar una gota de reactivo Antifa de oro prolongado. Baje lentamente un cubreobjetos sobre el portaobjetos, teniendo cuidado de evitar atrapar burbujas de aire. Limpie el reactivo de acceso y deje la rebanada en la oscuridad a temperatura ambiente durante media hora.

Finalmente, aplique esmalte de uñas a lo largo de los lados del cubreobjetos para asegurarlo y deje los portaobjetos a cuatro grados en la oscuridad durante la noche. Se utiliza un microscopio confocal para visualizar el sitio de exposición gamma H dos A formado. La configuración se ajusta para obtener una imagen nítida con un ruido de fondo mínimo.

Las imágenes son necesarias en el patrón de la serie Z con un tamaño de paso de 0,5 micras para minimizar la pérdida de focos presentes en diferentes planos del núcleo. Durante el análisis, los planos individuales se desconvolucan y apilan para producir una imagen proyectada máxima para minimizar la superposición de focos. Para cuantificar el número de focos generados, se utiliza el meta del programa, cada núcleo se resalta utilizando las herramientas disponibles en el programa y cada región de interés se puede transferir a la imagen con los focos gamma H dos A X.

El programa cuantifica un número de focos en cada celda después de que se haya aplicado el umbral para excluir todos los antecedentes, y la información se bloquea en una hoja de cálculo de Excel para su posterior análisis. Y con esto concluye nuestro protocolo de inmunoajuste para visualizar el daño inicial de D tras la exposición a la radiación de carbono. Este ensayo sensible también se puede aplicar a otros aspectos del daño inducido por la radiación que involucra frenos de doble cadena con alta reproducibilidad y confiabilidad.

Gracias por mirar.I.