Name: La cuantificación de γH2AX focos en respuesta a la radiación ionizante (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-06T19:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Aprende a cuantificar focos de γH2AX en células humanas expuestas a radiación gamma mediante inmunofluorescencia. Este método evalúa daño y reparación del ADN, así como la eficacia de radiosensibilizantes y radioprotectores.

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El apoyo del Instituto Australiano de Ciencia Nuclear e Ingeniería se reconoce. TCK es el ganador de premios AINSE. Laboratorio de Medicina epigenómico el apoyo de la Nacional de Salud y Consejo de Investigación Médica de Australia (566.559). LM con el apoyo de Melbourne de Investigación (Universidad de Melbourne) y de Imágenes Biomédicas becas complementarias CRC. El apoyo de Monash Micro Imaging (Drs. Stephen Cody y Carmichael Iska) fue muy valiosa para este trabajo.

Preparación de células <ol><li> Queratinocitos humanos (FEP-1811) se cultivaron en los queratinocitos-Serum medio libre (K-SFM, Invitrogen) suplementado con factor de crecimiento epidérmico, el extracto de pituitaria bovina y 20 mg / ml de gentamicina, a 37 ° C y CO 2 al 5%. </li><li> Una suspensión de células individuales ha sido preparado por separar con tripsina-EDTA (0,05% v / v) </li><li> Las células fueron sembradas en 8 y Laboratorio de diapositivas Tek II microcámara (10.000 células / pocillo) y las diapositivas se incubaron durante 3 días a 37 º C y 5% CO 2. </li></ol> Irradiación <ol><li> Las células fueron irradiados en el hielo con 2 Gy utilizando una fuente de 137 Cs (Gammacell 1000 irradiador Elite; Nordion Internacional, ON, Canadá; 20,6 segundos / Gy) </li><li> El control no irradiado y 2 Gy células irradiadas se incubaron durante 1 hora a 37 ° C y 5% CO 2. </li></ol> La tinción de inmunofluorescencia <ol><li> Los medios de comunicación fue avisado y se lavaron las células con 300μl de PBS (w / o Ca 2 + o Mg 2 +) por pozo y se gira en un mezclador orbital durante 5 minutos. </li><li> El buffer fue advertido y 100μl de recién preparada 4% (v / v) paraformaldehído se añadió a cada pocillo y las diapositivas se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Todas las incubaciones se realizaron en un canal de tinción humidificado </li><li> Las células fueron lavadas con PBS (w / o Ca 2 + o Mg 2 +). Las láminas fueron colocadas en un frasco de Coplin y se gira en un mezclador orbital durante 5 minutos. Esta etapa de lavado se repitió otras dos veces. </li><li> El buffer fue advertido y el exceso de PBS fue borrada suavemente. </li><li> Las células fueron permeabilized con 100 ml de Triton X-100 (0,1% v / v) por pozo y una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Las células fueron lavadas con PBS (w / o Ca 2 + o Mg 2 +) como se describe en los pasos 3 y 4 anteriores. </li><li> La unión no específica de proteínas fue bloqueado con 100 ml de BSA (1% v / v) por pozo y 20 minutos de incubación a temperatura ambiente. </li><li> El exceso de BSA fue advertido y 100μl de la principal del ratón monoclonal anti-fosfo-histona H2AX de anticuerpos (diluido 1:500, en el 1% de BSA, Millipore), se añadió a cada pocillo de una incubación de 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Las células fueron lavadas con PBS (w / o Ca 2 + o Mg 2 +) como se describe en los pasos 3 y 4 y se incubaron con 100μl del anticuerpo secundario (Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón IgG diluido 1:500, en el 1% de BSA ; Invitrogen) por pocillo durante 45 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. (Anticuerpo diluido se mantuvo en la oscuridad durante todo el procedimiento) </li><li> Las células fueron lavadas con PBS (w / o Ca 2 + o Mg 2 +) como se describe en los pasos 3 y 4 anteriores. Sin embargo, la exposición a la luz se redujo al mínimo el uso de aluminio. </li><li> Contratinción nuclear se realizó con 100 ml TOPRO3 (diluido 1:500; Invitrogen) por pozo y una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente </li><li> Las células fueron lavadas con PBS (w / o Ca 2 + o Mg 2 +) como se describe en el paso 10. </li><li> Las cámaras fueron cuidadosamente removidos de las diapositivas, el exceso de humedad se borró y las diapositivas se deja secar al aire. </li><li> Una gota de prolongar GOLD anti-fade solución (Invitrogen) se añadió por pocillo y diapositivas montadas fueron (22x50 mm cubreobjetos) y el exceso de líquido alrededor de los bordes de la diapositiva se borró. </li><li> Las diapositivas fueron mantenidos en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de sellar con esmalte de uñas. </li><li> Las diapositivas fueron almacenados durante la noche a 4 ° C en la oscuridad, antes del análisis. </li></ol> Microscopía / Análisis <ol><li> Zeiss LSM510 Meta Confocal Microscpe utiliza para adquirir imágenes con la GFP estándar (por γH2AX - Alexa Fluor 488 cabra anti-IgG de ratón) y el láser rojo lejano (por TOPRO-3). Típicamente, un aceite de 63 x lente objetivo de inmersión se usa. Las imágenes se adquieren en un modelo de la serie Z con un tamaño de paso de 0,5 micras. Un tamaño de paso de 0.5 micras fue elegida para minimizar la pérdida de los actuales focos en diferentes planos en los núcleos. Durante el análisis, los planos individuales son deconvoluted y apilados para producir una imagen proyectada máxima para minimizar la superposición de los focos (Top-hat filtro aplicado). </li><li> Metamorph (Molecular Devices, EE.UU.) se utilizó para analizar el número de focos. El programa cuantifica el número de focos en cada celda después de que el umbral se ha aplicado para excluir a fondo. La información se registra en una hoja de cálculo Microsoft Excel para su posterior análisis. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1957/1957fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Visualización de inmunofluorescencia γH2AX focos (verde) en queratinocitos humanos no tratados y en las células irradiadas con 2 Gy y se incubó durante 1 hora a 37 ° C, 5% de CO 2. ADN fue manchado con TOPRO-3 (azul). Las imágenes fueron adquiridas con un Zeiss LSM 510 microscopio confocal Meta. Bar = 10 micras. e_content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/1957/1957fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Inmunofluorescencia visualización de γH2AX focos (verde) en los queratinocitos humanos y en células irradiadas con 2 Gy y se incubó durante 1 hora a 37 ° C, 5% de CO 2. Las imágenes fueron adquiridas con un Zeiss LSM 510 microscopio confocal Meta con 0,5 micras Z-corte (1-9) para asegurar que todos los focos se han desarrollado. Las imágenes se apilan entonces para la cuantificación utilizando Metamorph. ADN fue manchado con TOPRO-3 (azul). El γH2AX apilados y las imágenes fueron apilados azul para la visualización. Bar = 10 micras.

<ol><li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li>
<li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma+H2AX+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gamma H2AX and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li>
<li>Savic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+Dynamic+%5Bgamma%5D-H2AX+Domains+along+Broken+DNA+Strands+Is+Distinctly+Regulated+by+ATM+and+MDC1+and+Dependent+upon+H2AX+Densities+in+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of Dynamic [gamma]-H2AX Domains along Broken DNA Strands Is Distinctly Regulated by ATM and MDC1 and Dependent upon H2AX Densities in Chromatin.</a> Molecular Cell. 34 (3), 298-310 (2009).</li>
<li>Downs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+chromatin-modifying+activities+to+phosphorylated+histone+H2A+at+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Binding of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites.</a> Mol Cell. 16 (6), 979-990 (2004).</li>
<li>Chowdhury, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5Bgamma%5D-H2AX+Dephosphorylation+by+Protein+Phosphatase+2A+Facilitates+DNA+Double-Strand+Break+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">[gamma]-H2AX Dephosphorylation by Protein Phosphatase 2A Facilitates DNA Double-Strand Break Repair.</a> Molecular Cell. 20 (5), 801-809 (2005).</li>
<li>Nakada, S., Chen, G., Gingras, A., Durocher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PP4+is+a+gamma+H2AX+phosphatase+required+for+recovery+from+the+DNA+damage+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">PP4 is a gamma H2AX phosphatase required for recovery from the DNA damage checkpoint.</a> EMBO Rep. 9 (10), 1019-1026 (2008).</li>
<li>Altaf, M., Auger, A., Covic, M., Côté, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connection+between+histone+H2A+variants+and+chromatin+remodeling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Connection between histone H2A variants and chromatin remodeling complexes.</a> Biochem Cell Biol. 87 (1), 35-50 (2009).</li>
<li>Kusch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+by+Tip60+Is+Required+for+Selective+Histone+Variant+Exchange+at+DNA+Lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acetylation by Tip60 Is Required for Selective Histone Variant Exchange at DNA Lesions.</a> Science. 306, 2084-2087 (2004).</li>
<li>Hurlin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+human+papillomavirus+type+18-immortalized+human+keratinocytes+to+a+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (2), 570-574 (1991).</li>
<li>Dickey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+functional+roles+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. , Forthcoming (2009).</li>
</ol>

Después de la exposición a la radiación ionizante (rayos γ), γH2AX forma rápida los focos y los números de focos de alcanzar un máximo entre los 30-60 minutos 2. Por lo tanto, nuestra una hora después de la irradiación punto del tiempo refleja la formación inicial del OSD. Hemos utilizado la dosis de radiación clínicamente relevante de 2 Gy para nuestro experimento. Sin embargo, el método puede ser utilizado para la dosis de radiación hasta 4 Gy para la detección de la formación inicial del OSD; superposición...

<table><tbody><tr><td>Medio libre de suero para queratinocitos (K-SFM)</td><td>Medio</td><td>Invitrogen</td><td>17005042</td><td>Medio para queratinocitos suplementado con factor de crecimiento epidérmico recombinante humano 1-53 (EGF 1-53) y extracto de hipófisis bovina (BPE).</td></tr><tr><td>Placas con cámaras Lab Tek II (8 pocillos)</td><td>Placas con cámaras</td><td>Nalge Nunc international</td><td>NUN154534</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos (22x50 mm)</td><td>Cubreobjetos</td><td>Menzel-Glaser</td><td>CS2250100</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>La BSA (1 %) se utiliza para bloquear la unión inespecífica de anticuerpos. Los anticuerpos primarios y secundarios se diluyen en BSA.</td></tr><tr><td>PBS (sin Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; y Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA al 0,5 % x10</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td>Se utiliza tripsina-EDTA (0,05 %) para desprender las células de los frascos de cultivo.</td></tr><tr><td>Tritón X-100</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Se utiliza Tritón X-100 (0,1 %) para permeabilizar las células.</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>Se utiliza paraformaldehído (4 %) para fijar las células.</td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal de ratón anti-histona fosfo-H2AX</td><td>Anticuerpo primario</td><td>EMD Millipore</td><td>16193</td><td>Dilución del anticuerpo primario (1:500) en BSA al 1 %.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 de cabra anti-IgG de ratón (H+L)</td><td>Anticuerpo secundario</td><td>Invitrogen</td><td>11029</td><td>Dilución del anticuerpo secundario (1:500) en BSA al 1 %.</td></tr><tr><td>TOPRO3</td><td>Tinción de ADN</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td>Tinción de ADN comúnmente utilizada: clorhidrato de 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Solo puede utilizarse con microscopios que dispongan del láser de excitación adecuado.</td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Solución antifade</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>Índice de refracción de 1,42 a 20&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Frascos de cultivo celular con tapón ventilado</td><td>Frascos de cultivo</td><td>BD Biosciences</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular (150x25 mm)</td><td>Placa de Petri</td><td>BD Biosciences</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>Frascos Coplin, de vidrio</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>1771-OG</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta para tinción</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>V1991.99</td><td></td></tr><tr><td>Irradiador Gammacell 1000 Elite</td><td>Irradiador gamma</td><td>Nordion International Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Meta Confocal</td><td>Microscopio confocal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Software para análisis de imágenes</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la cuantificación de γh2ax focos en respuesta a la radiación ionizante

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

ADN de doble filamento se rompe (DSBs), que son inducidas por cualquiera de los procesos metabólicos endógenos o por causas exógenas, son una de las lesiones del ADN más críticos con respecto a la supervivencia y la preservación de la integridad genómica. Una primera respuesta a la inducción de DSBs es la fosforilación de la variante de la histona H2A, H2AX, en la serina-139 de residuos, en el altamente conservadas C-terminal motivo SQEY, formando γH2AX<sup&gt; 1</sup&gt;. Después de la inducción de DSBs, H2AX es rápidamente fosforilado por la fosfatidil-inosito 3-quinasa (PIKK) de la familia de las proteínas, la ataxia telangiectasia mutada (ATM), el ADN-proteína de la subunidad catalítica y la quinasa ATM y RAD3 relacionados (ATR)<sup&gt; 2</sup&gt;. Por lo general, sólo unos pocos pares de bases (pb) están implicados en un OSD, sin embargo, no hay amplificación de la señal significativa, dada la importancia de las modificaciones de la cromatina en la señalización de daño en el ADN y la reparación. La fosforilación de H2AX mediada predominantemente por ATM se extiende a las áreas adyacentes de la cromatina, que afecta a aproximadamente 0,03% del total de H2AX celulares por OSD<sup&gt; 2,3</sup&gt;. Esto corresponde a la fosforilación de aproximadamente 2000 moléculas H2AX que abarca ~ 2 Mbps regiones de la cromatina que rodea el sitio de la OSD y los resultados en la formación de focos discretos γH2AX que pueden ser fácilmente visualizados y cuantificados por microscopía de inmunofluorescencia<sup&gt; 2</sup&gt;. La pérdida de γH2AX al OSD refleja reparación, sin embargo, existe cierta controversia en cuanto a lo que define la reparación completa de DSBs, se ha propuesto que la reincorporación de las dos hebras de ADN es suficiente sin embargo, también se ha sugerido que restablecimiento de la cromatina estado original de la compactación es necesario<sup&gt; 8.4</sup&gt;. La desaparición de γH2AX implica al menos en parte, defosforilación por fosfatasas, fosfatasa 2A y 4C fosfatasa<sup&gt; 5,6</sup&gt;. Además, la eliminación de γH2AX de redistribución que implican el intercambio de histonas con H2A.Z se ha implicado<sup&gt; 7,8</sup&gt;. Es importante destacar que el análisis cuantitativo de los focos γH2AX ha llevado a una amplia gama de aplicaciones en la investigación médica y la energía nuclear. Este sentido, demuestran el método más comúnmente utilizado de inmunofluorescencia para la evaluación de daños en el ADN inicial de detección y cuantificación de γH2AX focos en γ-irradiados queratinocitos humanos adherentes<sup&gt; 9</sup&gt;.

La cuantificación de ADN de doble filamento con la formación de estrías γH2AX como un marcador molecular se ha convertido en una herramienta indispensable en la biología de la radiación. Aquí se demuestra el uso de un ensayo de inmunofluorescencia para la cuantificación de γH2AX focos después de la exposición de las células a la radiación.

La cuantificación de γH2AX focos en respuesta a la radiación ionizante

Las rupturas de doble cadena (DSB) del ADN, inducidas ya sea por procesos metabólicos endógenos o por fuentes exógenas, constituyen una de las lesiones más críticas del ADN...

Hola, soy Ian Ma del Laboratorio de Medicina Epigenómica dirigido por el Dr. Tom Caris en el Baker Eye, DI Heart and Diabetes Institute. Actualmente estoy realizando mi doctorado, que tiene un fuerte enfoque en los efectos de la radiación sobre Gamma H dos A X, que es el marcador molecular de roturas de doble cadena. Hoy demostraré un experimento sobre la cuantificación de Gamma H dos A X en respuesta a la radiación gamma en células humanas.Este protocolo de inmunotinción puede utilizarse para monitorear tanto el daño inicial del ADN como la reparación del ADN. Este método también es útil para evaluar la eficacia de compuestos modificadores de la radiación potenciales. Por ejemplo, los radiosensibilizadores, que se espera que aumenten el daño en el ADN, darán como resultado un mayor número de gamma H dos A X cuatro lateral, mientras que los radioprotectores tendrían el efecto opuesto, con un menor número de ForSight detectado debido a una reducción en las hebras dobles de ADN.Ahora comencemos el experimento. Las células utilizadas en este experimento son cíticas humanas, que se preparan en portaobjetos con cámara con 10.000 células asentadas en cada pocillo. Los portaobjetos se inc

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Investigación

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Biología

La cuantificación de ADN de doble filamento se rompe sobre la base de γH2AX focos se ha convertido en una herramienta de valor incalculable, sobre todo en biología de la radiación, para la evaluación de la radiosensibilidad del tejido y los efectos de los compuestos de la radiación modificar. Aquí se demuestra el uso de un ensayo de inmunofluorescencia para la cuantificación de γH2AX focos en muestras de tejido.

La cuantificación de γH2AX focos en muestras de tejido

El análisis microscópico de γH2AX focos, que forman después de la fosforilación de H2AX en la Ser-139 en respuesta a ADN de doble filamento se rompe, se ha convertido en una herramienta indispensable en la biología de la radiación. Aquí hemos utilizado un anticuerpo mono-metílico de la histona H3 lisina 4 como marcador epigenético de la eucromatina activa la transcripción, para evaluar la distribución espacial de la radiación inducida por la formación de γH2AX dentro del núcleo.

Evaluación de la distribución espacial de la radiación ionizante γH2AX siguientes

Se presenta un protocolo para evaluar los cambios en los niveles de daño en el ADN y la capacidad de reparación del ADN que pueden ser inducidos por la irradiación crónica in vivo de baja dosis en linfocitos de bazo de ratón, mediante la medición de la histona fosforilada H2AX, un marcador de roturas de doble cadena de ADN, utilizando citometría de flujo.

Medición de daños y reparación del ADN en esplenocitos de ratón Después crónica<em&gt; En Vivo</em&gt; La exposición a dosis muy bajas de beta y gamma Radiación

Este manuscrito ofrece un protocolo para el análisis de roturas de doble cadena de DNA por microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1.

Microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1 para analizar la formación y la reparación de roturas de doble cadena de DNA

Reparación de roturas del DNA de doble cadena es un proceso dinámico, que requiere no sólo la formación de complejos de reparación en los descansos, pero también su resolución después de la lesión se trata. Aquí, utilizamos microscopia de la inmunofluorescencia para roturas de doble hebra transitorias y duradera como una herramienta para diseccionar este mecanismo de mantenimiento del genoma.

Caracterización de procesos de reparación del ADN en transitoria y duradera doble cadena DNA roturas por microscopia de la inmunofluorescencia

El método presentado combina el análisis cuantitativo de las roturas de doble cadena de ADN (DSB), la distribución del ciclo celular y la apoptosis para permitir la evaluación específica del ciclo celular del Dsb de inducción y la reparación, así como las consecuencias de la falla de reparación.

Medición específica del ciclo celular de la éH2AX y la apoptosis después del estrés genotóxico por citometría de flujo

No se ha establecido completamente la respuesta de daño del ADN inducida por radiación activada por el haz mixto de neutrones utilizado en la terapia de captura de neutrones de boro (BNCT). Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para detectar focos inducidos por radiación (RIF) de proteínas de reparación mediante tinción de inmunofluorescencia en líneas celulares de cáncer de colon humano después de la irradiación con el haz mezclado con neutrones.

Imágenes de inmunofluorescencia de daños en el ADN y dosis de focos en células de cáncer de colon humano

Después del daño del ADN, las células humanas activan vías de reparación esenciales para restaurar la integridad de su genoma. Aquí, describimos el método de inmunofluorescencia indirecta como un medio para detectar proteínas de reparación del ADN, analizar su reclutamiento espacial y temporal, y ayudar a interrogar la interacción proteína-proteína en los sitios de daño del ADN.

Visualización de la interacción de proteínas de reparación del ADN por inmunofluorescencia

Este protocolo presenta la preparación de diapositivas y la puntuación automatizada del ensayo de focos γ-H2AX en linfocitos de sangre periférica. Para ilustrar el método y la sensibilidad del ensayo, se irradiaron linfocitos aislados in vitro. Este método automatizado de detección de ADN DSB es útil para aplicaciones de dosimetría biológica rápidas y de alto rendimiento.

Un método automatizado de puntuación microscópica para el ensayo de focos γ-H2AX en linfocitos de sangre periférica humana

Este protocolo presenta un método para evaluar la formación y reparación de roturas de doble cadena de ADN mediante la detección simultánea de focos γH2AX y 53BP1 en núcleos interfase de linfocitos periféricos humanos tratados con bleomicina.

Inmunofluorescencia dual de γH2AX y 53BP1 en linfocitos periféricos humanos

Aquí, presentamos un protocolo simple y rápido para la detección de la interacción de proteínas en sitios de daño en el ADN.

Ensayo de ligando de proximidad para localizar proteínas en sitios de daño en el ADN

Aprende a cuantificar focos de γH2AX en células humanas expuestas a radiación gamma mediante inmunofluorescencia. Este método evalúa daño y reparación del ADN, así como la eficacia de radiosensibilizantes y radioprotectores.

La cuantificación de γH2AX focos en respuesta a la radiación ionizante

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