Name: En vivo-La detección de interacciones proteína-proteína en la Micro-patrón superficies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-19T17:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Aprende a cuantificar interacciones proteína-proteína en células vivas mediante micro-patrón de superficies. Este método de alto rendimiento permite detectar interacciones débiles y analizar procesos celulares dinámicos en membrana plasmática.

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Nos gustaría dar las gracias a Quentina Beatty, de la Universidad de Linz, Austria, por su amable ayuda, Katharina Strub, de la Universidad de Ginebra, Suiza, para la construcción de hCD71-GFP, y Daniel Legler, Universidad de Constanza, Suiza, por el GPI-GFP -DAF construir. Este trabajo fue apoyado por el Fondo Científico de Austria (FMF; proyecto Y250-B03) y el proyecto GEN-AU del Ministerio Federal de Ciencia e Investigación.

Microcontacto de impresión: <ol><li> Recorta el campo de micropattern del sello PDMS con un bisturí </li><li> Lave el campo que contiene el micropattern por lavado con etanol (100%) y agua destilada. </li><li> Seque el sello PDMS con nitrógeno o argón. </li><li> Añadir 50 l de BSA-Cy5 solución de trabajo (0,67 mg / ml) en el sello PDMS, para que todo el campo micropattern está cubierto con la solución. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavar el campo micropattern lavándolo con tampón fosfato salino (PBS) y agua destilada. </li><li> Seque el PDMS con nitrógeno o argón. </li><li> Coloque el sello PDMS por su propio peso en medio de un revestimiento epóxico cubreobjetos y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente en una placa de Petri. </li><li> Etiqueta de la posición de la marca de PDMS en la parte trasera del cubreobjetos y tira el sello de la diapositiva con una pinza. </li><li> Palo de una cámara de sello de hibridación seguro sobre el campo microcontacto impresos en el cubreobjetos. La etiqueta ayuda a localizar el centro del campo. </li><li> Pipeta de 60 estreptavidina l solución de trabajo (50 mg / ml) en la cámara de reacción e incubar la muestra durante 60 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Lavar la muestra con 1 ml de PBS mediante la adición de la memoria intermedia en un puerto de la cámara y eliminarlo de forma simultánea en el segundo puerto con una bomba. </li><li> Pipeta de 60 l de anticuerpos con biotina solución de trabajo (10 mg / ml en PBS suplementado con 0,1% de Tween 20; "PBST") en la cámara de reacción e incubar durante 60 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavar la muestra con 1 ml de PBST y luego 1 ml de PBS mediante la adición de la memoria intermedia en un puerto de la cámara y la eliminación de nuevo en el segundo puerto con una bomba. </li><li> Tienda de las superficies micropatterned en PBS en la oscuridad a temperatura ambiente hasta que las células están listas para la siembra. </li></ol> La incubación de las células en la superficie micropatterned: <ol><li> Crecen las células adherentes al 50% de confluencia en una placa de cultivo de 3 cm de tejido. </li><li> Separar las células que expresan proteínas cebo y la presa de intereses con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y se centrifuga 5 min a 1.000 rpm. </li><li> Eliminar el sobrenadante y disolver el pellet de células en el medio de cultivo de acuerdo. </li><li> Centrifugar 5 min a 1.000 rpm. </li><li> Eliminar el sobrenadante y disolver el pellet de células en medio de cultivo apropiado. </li><li> Intercambio de la PBS de la cámara de reacción en el cubreobjetos micropatterned en un 60 l de la suspensión celular. </li><li> Crear una cámara húmeda empapando una gasa estéril con agua destilada y ponerlo en la placa de Petri para evitar que la muestra de la falta de agua. </li><li> Se incuban las células durante la noche a 37 ° C en un 5% de CO2 la atmósfera en la superficie micropatterned. </li><li> Antes de analizar las células en el microscopio, el medio de intercambio por solución salina tamponada Hank s como Ca 2 + y Mg 2 +. </li></ol> Microscopía: <ol><li> El cubreobjetos se coloca sobre un soporte adecuado y la morfología de las células se examinan bajo luz blanca. </li><li> La calidad de los BSA-Cy5 patrones está marcada por la excitación a 647 nm. </li><li> Micropatrones de presa de proteínas fluorescentes (GFP o YFP) se registran en 488 o 514 nm en reflexión interna total (TIR) ​​de excitación. </li></ol> Los resultados representativos: Si hay una interacción entre las proteínas diana en las células cultivadas en una superficie micropatterned, la presa seguirá la redistribución de cebo. El micropattern resultante puede ser visualizado por la etiqueta de fluorescencia de la proteína de la presa. Es importante destacar el contraste obtenido proporciona una medida directa de la fuerza de interacción (ver Figura 1). Por lo tanto, una simple evaluación de la interacción de dos proteínas es posible - sin necesidad de otro proceso de los datos primarios medidos. <img src="/files/ftp_upload/1969/1969fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Reordenamiento del cebo en la membrana de células plasmáticas en vivo en diferentes fuerzas de interacción. TIR imágenes de las células transfectadas con T24 (a) CD71-GFP en CD71-anticuerpo, CD4 (b) y YFP citosólica de CD4-anticuerpo y (c) GPI-DAF-GFP en microbiochips CD59-anticuerpo se muestran. Los datos son característicos de una fuerte (a), no (b) o de la interacción débil (c). (A) se reproduce a partir de (Weghuber et al., En prensa), (b) de (Schwarzenbacher et al., 2008).

<ol><li>Brameshuber, M., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schuetz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reply+to+%22Uncoupling+diffusion+and+binding+in+FRAP+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Reply to "Uncoupling diffusion and binding in FRAP experiments.</a> Nat. Methods. 6, 183-184 (2009).</li>
<li>Kim, P. W., Sun, Z. J., Blacklow, S. C., Wagner, G., Eck, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Zinc+Clasp+Structure+Tethers+Lck+to+T+Cell+Coreceptors+CD4+and+CD8%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Zinc Clasp Structure Tethers Lck to T Cell Coreceptors CD4 and CD8.</a> Science. 301, 1725-1728 (2003).</li>
<li>Ramm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+screening%3A+a+technology+in+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Image-based screening: a technology in transition.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16, 41-48 (2005).</li>
<li>Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Brameshuber, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+for+quantitative+analysis+of+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Micropatterning for quantitative analysis of protein-protein interactions in living cells.</a> Nat. Methods. 5, 1053-1060 (2008).</li>
<li>Weghuber, J., Brameshuber, M., Sunzenauer, S., Lehner, M., Paar, C., Haselbruebler, T., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Paster, W., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protein-protein+interactions+in+the+live+cell+plasma+membrane+by+quantifying+prey+redistribution+upon+bait+micropatterning%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Detection of protein-protein interactions in the live cell plasma membrane by quantifying prey redistribution upon bait micropatterning.</a> Methods in Enzymology. , Forthcoming Forthcoming.</li>
</ol>

El vídeo contiene imágenes que fueron proporcionados por Olympus, tomada de la página principal del Laboratorio de Investigación de Visualización de la Universidad Brown o reproducido a partir de (Kim<em&gt; Et al</em&gt;., 2003).

El video que acompaña muestra un método para la detección de interacciones proteína-proteína en la membrana plasmática de las células vivas (Schwarzenbacher et al, 2008;. Brameshuber et al, 2009;.. Weghuber et al, en prensa). En principio, cualquier plataforma microscopía TIRF basado puede ser utilizado como sistema de lectura. Sólo cuando se desea una alta sensibilidad (por ejemplo, para la detección de moléculas individuales), los microscopios avanzados se requerirá. Para obtener los mejores resultados los siguientes puntos críticos durante el proceso de preparación requieren una atención especial: <ol class="lroman"><li> Tienda Cy5-de la solución madre en condiciones de oscuridad para evitar la decoloración del fluoróforo y preparar la BSA-Cy5 solución de trabajo poco antes de la impresión por microcontacto. </li><li> Tenga cuidado de no rayar la micropattern en el PDMS con la punta de la pipeta y se incuba la muestra en condiciones de oscuridad para evitar el blanqueo del fluoróforo. </li><li> Coloque el cubreobjetos sobre una gasa estéril para evitar la adherencia de la lámina de vidrio de la placa de Petri. Una vez que el sello de PDMS se ha adherido a la lámina de vidrio, no lo mueva. </li><li> Evite las burbujas de aire en la cámara de reacción e incubar la muestra en condiciones de oscuridad para evitar la decoloración del fluoróforo. </li><li> No permita que la muestra seca por más de 2 minutos para evitar la formación de cristales de sal. </li><li> Para el desprendimiento de las células no utilizan la tripsina, ya que se unirá al dominio extracelular de proteínas de la membrana hasta ahora expresados. Evitar la tripsina será útil para las proteínas con baja tasa de rotación para formar micropatrones inmediatamente después de fijación de las células en la superficie. </li><li> Controlar el número de células se incubaron en un microscopio y asegurarse de que las células no llegan a más de 30-50% de confluencia. Asegúrese de que las células se eliminan inmediatamente excesiva debido a la fijación rápida de las células en la superficie recubiertas de anticuerpos. </li><li> Sólo con diapositivas de alta calidad BSA-Cy5 patrones se pueden utilizar para su posterior análisis. </li><li> La expresión estable de la proteína fluorescente presa es preferible debido a un mayor número de células que pueden ser analizados por barrido. </li><li> Adecuado ajuste TIRF es indispensable para visualizar los patrones de fondo debido a la citosólica. </li></ol> La técnica de micro-patrones ofrece varias posibilidades para el análisis de las interacciones proteína-proteína. En primer lugar, junto con la cuantificación de los locales, resolución espacial interacciones proteína-proteína también la detección de interacciones débiles o indirecta es posible sin el inconveniente de dar un alto número de falsos positivos o negativos. En segundo lugar, permite al investigador para analizar interacciones proteína-proteína en la membrana plasmática de células vivas, lo cual es difícil de conseguir por métodos bioquímicos como la pantalla de dos híbridos. En tercer lugar el método permite la detección de interacciones presa-cebo que son moduladas por los cambios ambientales como la temperatura, la presencia de diferentes proteínas u otras moléculas o modificaciones posteriores a la traducción. Así, el ensayo permite moduladores de detección de un par de interacción dada en el contexto de las células vivas. Por otra parte, mediante la reducción de la densidad superficial del ligando de captura o el uso de ligandos monovalentes, el análisis del estado de reposo se hace posible. Por último, si suficientes plataformas de exploración se utilizan, el número de células analizadas es lo suficientemente alto como para satisfacer las demandas de alto rendimiento de las compañías farmacéuticas para la detección de drogas (Ramm, 2005).

en vivo-la detección de interacciones proteína-proteína en la micro-patrón superficies

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Desentrañar la red de interacción de las moléculas<em&gt; En-vivo</em&gt; Es clave para entender los mecanismos que regulan la función celular y el metabolismo. Una multitud de opciones metodológicas para abordar las interacciones moleculares en las células se han desarrollado, pero la mayoría de estos métodos sufren de ser más bien indirecta y por lo tanto, no cuantitativa. Por el contrario, algunos de gama alta métodos cuantitativos se han introducido, que sin embargo son difíciles de extender a un alto rendimiento. Para combinar las capacidades de alto rendimiento con la posibilidad de extraer información cuantitativa, hemos desarrollado recientemente un nuevo concepto para la identificación de interacciones proteína-proteína (Schwarzenbacher<em&gt; Et al</em&gt;., 2008). Aquí se describe un protocolo detallado para el diseño y la construcción de este sistema que permite analizar las interacciones entre una proteína marcada con fluoróforo (&quot;presa&quot;) y una proteína de membrana (&quot;carnada&quot;)<em&gt; En-vivo</em&gt;. Las células se colocan sobre superficies micropatterned funcionalizados con anticuerpos contra el dominio de cebo exoplasmic. Presa de cebo se analizan las interacciones a través de la redistribución de la presa fluorescentes. El método se caracteriza por una alta sensibilidad al nivel de moléculas individuales, la capacidad de detectar las interacciones débiles, y la capacidad de alto rendimiento, por lo que es aplicable como herramienta de detección.

Este video muestra los experimentos con el posterior análisis de las interacciones proteína-proteína mediante el uso de micro-modelado de superficies. El enfoque ofrece la posibilidad de detectar las interacciones de proteínas en las células vivas y combina una alta capacidad de rendimiento con la posibilidad de extraer información cuantitativa.

En vivo-La detección de interacciones proteína-proteína en la Micro-patrón superficies

Desentrañar la red de interacción de moléculas in vivo es fundamental para comprender los mecanismos que regulan la función y el metabolismo celular. Una multitud de...

Es de particular importancia desentrañar la red de interacciones de moléculas en células vivas para comprender los mecanismos que regulan el metabolismo y la función celular. Un número creciente de metodologías que proporcionan información cualitativa y cuantitativa son la fuerza impulsora en nuestro camino hacia la obtención de imágenes integrales de la función celular. Los ensayos de inmunoprecipitación conjunta, marcaje TAP o enlaces cruzados fotoquímicos permiten la purificación de pre-moléculas in vitro.Además, se diseñaron varios enfoques para el análisis de interacciones proteicas en la célula viva. Estos incluyen ensayos de doble híbrido o complementación de proteínas fluorescentes. Asimismo, se han establecido algunos enfoques espectroscópicos como el FRET o la FCS, así como métodos no espectroscópicos, para abordar esta cuestión.Las técnicas mencionadas anteriormente se han desarrollado para registrar grandes poblaciones de células, pero adolecen de ser bastante indirectas y, por lo tanto, apenas cuantitativas. En contraste, se han introducido algunos enfoques cuantitativos de alta gama. Sin embargo, ampliar el alto rendimiento resulta difícil de combinar con la posibilidad de extraer información cuantitativa.Recientemente desarrollamos un nuevo concepto para identificar interacciones entre proteínas. La técnica de micropatronado aquí mostrada es una ilustración esquemática de las cuadrículas de SA microimpresas de BSA Sci cinco que se depositan sobre cubreobjetos de vidrio funcionalizados y los espacios intermedios se rellenan con estreptavidina, seguido de ligandos biotinilados. En la mayoría de los casos, anticuerpos contra la membrana.Señuelo proteico en células cultivadas en chips de microbioma como estos. El señuelo se organizará en la membrana plasmática de acuerdo con el micro patrón de anticuerpos. Las interacciones con una segunda proteína presa marcada fluorescentemente se analizan midiendo el grado de co-patrón usando un sello de silicona PDMS con una matriz de cuadrados con tamaño y profundidad de características definidos.Los tres micrómetros se producen a partir de un gel y se cortan. Los sellos se lavan con etanol al 100% y agua doblemente desionizada y se secan con nitrógeno previamente. Se incuban con 0,67 miligramos por mililitro de sci-fi.Solución de BSA marcada durante 30 minutos a temperatura ambiente durante la incubación; al mismo tiempo, los cubreobjetos de vidrio modificados con epoxi se limpian de la misma manera. De la misma manera, después de la impresión, los sellos se lavan con PBS y agua. Para la transferencia de BSA sci cinco.Se seca un sello con nitrógeno y, inmediatamente después, se coloca bajo su propio peso debajo de una laminilla de vidrio durante 30 minutos. La ubicación del campo de microdiseño se marca en la parte posterior de la laminilla. Tras retirar los sellos, las laminillas se sellan con máscaras de silicona adhesiva.Las cámaras se cargan con una solución de estreptavidina a 50 microgramos por mililitro, se incuban durante una hora y se lavan posteriormente con un mililitro de PBS. A continuación, los patrones de estreptavidina se incuban con un anticuerpo biotinilado a 10 microgramos por mililitro durante una hora, y tras lavar con PBS, se introducen las células en la cámara. Cuando las células se han adherido a la superficie, la muestra está lista para las mediciones.El único requisito para la lectura es un microscopio de fluorescencia capaz de iluminar la muestra en configuración de reflexión interna total. Dichos sistemas están disponibles comercialmente de diferentes proveedores y en los últimos años se han vuelto fáciles de manejar para el usuario. Nuestro sistema de detección está montado sobre un microscopio de fluorescencia epiescopia.Los láseres de iones de argón y kriptón se utilizan para la excitación selectiva de fluorescencia de las muestras marcadas con fluoróforos. Las muestras se iluminan en una configuración de reflexión interna total basada en objetivo, utilizando un objetivo de inmersión en aceite de alta apertura numérica y 100 aumentos. Tras un filtrado adecuado mediante conjuntos de filtros estándar, la fluorescencia se proyecta sobre una cámara CCD iluminada por la parte posterior. La lectura se realiza en modo de retardo y acumulación temporal, lo que permite escanear áreas muestrales grandes. Para ello, las muestras se desplazan utilizando una platina motorizada XY sincronizada con el desplazamiento de líneas de la cámara.El haz láser reflejado hacia atrás se proyecta sobre un fotodiodo de dos segmentos y la señal diferencial se utiliza para controlar un piezoeléctrico Z para un reenfoque rápido. El lector está equipado con un sistema automatizado de mantenimiento de enfoque que opera durante el proceso de escaneo, con un escaneo a 488 nanómetros para la excitación selectiva de GFP y un segundo escaneo a 647 nanómetros para la excitación selectiva de PS Five. Para el análisis de datos, utilizamos un programa de cálculo de contraste escrito en MATLAB basado en la intensidad de fluorescencia dentro y fuera de la región de anticuerpo capturado.El nivel de contraste y, por ende, el grado de interacción de proteínas se analiza para un examen rápido de un gran número de células. También puede utilizarse software automatizado disponible comercialmente. Por ejemplo, el software de imagen scan R ofrecido por Olympus ha sido probado con éxito para la evaluación de contraste en experimentos de microdisposición.Analizamos la interacción bien conocida entre CD4 y LCK en proteínas de la señalización temprana de linfocitos T, tal como se muestra aquí. La LCK fluorescente se redistribuye claramente en regiones recubiertas con anticuerpos anti-CD4. La alteración de la estructura del cierre de zinc, que es un sitio principal de interacción entre estas dos proteínas, mediante la adición de un quelante de zinc reduce el contraste de los micropatrones de LCK.En resumen, las principales ventajas de la técnica de micropatronado son las siguientes: cuantificación de interacciones proteicas locales con resolución espacial. Además, la detección de interacciones débiles también en la membrana plasmática de células vivas, la detección de interacciones entre presa y cebo moduladas, el análisis del estado de reposo y la aplicabilidad del enfoque para alto rendimiento.

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Investigación

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