En vivo-La detección de interacciones proteína-proteína en la Micro-patrón superficies

Es de particular importancia desentrañar la red de interacciones de moléculas en células vivas para comprender los mecanismos que regulan el metabolismo y la función celular. Un número creciente de metodologías que proporcionan información cualitativa y cuantitativa son la fuerza impulsora en nuestro camino hacia la obtención de imágenes integrales de la función celular. Los ensayos de inmunoprecipitación conjunta, marcaje TAP o enlaces cruzados fotoquímicos permiten la purificación de pre-moléculas in vitro.

Además, se diseñaron varios enfoques para el análisis de interacciones proteicas en la célula viva. Estos incluyen ensayos de doble híbrido o complementación de proteínas fluorescentes. Asimismo, se han establecido algunos enfoques espectroscópicos como el FRET o la FCS, así como métodos no espectroscópicos, para abordar esta cuestión.

Las técnicas mencionadas anteriormente se han desarrollado para registrar grandes poblaciones de células, pero adolecen de ser bastante indirectas y, por lo tanto, apenas cuantitativas. En contraste, se han introducido algunos enfoques cuantitativos de alta gama. Sin embargo, ampliar el alto rendimiento resulta difícil de combinar con la posibilidad de extraer información cuantitativa.

Recientemente desarrollamos un nuevo concepto para identificar interacciones entre proteínas. La técnica de micropatronado aquí mostrada es una ilustración esquemática de las cuadrículas de SA microimpresas de BSA Sci cinco que se depositan sobre cubreobjetos de vidrio funcionalizados y los espacios intermedios se rellenan con estreptavidina, seguido de ligandos biotinilados. En la mayoría de los casos, anticuerpos contra la membrana.

Señuelo proteico en células cultivadas en chips de microbioma como estos. El señuelo se organizará en la membrana plasmática de acuerdo con el micro patrón de anticuerpos. Las interacciones con una segunda proteína presa marcada fluorescentemente se analizan midiendo el grado de co-patrón usando un sello de silicona PDMS con una matriz de cuadrados con tamaño y profundidad de características definidos.

Los tres micrómetros se producen a partir de un gel y se cortan. Los sellos se lavan con etanol al 100% y agua doblemente desionizada y se secan con nitrógeno previamente. Se incuban con 0,67 miligramos por mililitro de sci-fi.

Solución de BSA marcada durante 30 minutos a temperatura ambiente durante la incubación; al mismo tiempo, los cubreobjetos de vidrio modificados con epoxi se limpian de la misma manera. De la misma manera, después de la impresión, los sellos se lavan con PBS y agua. Para la transferencia de BSA sci cinco.

Se seca un sello con nitrógeno y, inmediatamente después, se coloca bajo su propio peso debajo de una laminilla de vidrio durante 30 minutos. La ubicación del campo de microdiseño se marca en la parte posterior de la laminilla. Tras retirar los sellos, las laminillas se sellan con máscaras de silicona adhesiva.

Las cámaras se cargan con una solución de estreptavidina a 50 microgramos por mililitro, se incuban durante una hora y se lavan posteriormente con un mililitro de PBS. A continuación, los patrones de estreptavidina se incuban con un anticuerpo biotinilado a 10 microgramos por mililitro durante una hora, y tras lavar con PBS, se introducen las células en la cámara. Cuando las células se han adherido a la superficie, la muestra está lista para las mediciones.

El único requisito para la lectura es un microscopio de fluorescencia capaz de iluminar la muestra en configuración de reflexión interna total. Dichos sistemas están disponibles comercialmente de diferentes proveedores y en los últimos años se han vuelto fáciles de manejar para el usuario. Nuestro sistema de detección está montado sobre un microscopio de fluorescencia epiescopia.

Los láseres de iones de argón y kriptón se utilizan para la excitación selectiva de fluorescencia de las muestras marcadas con fluoróforos. Las muestras se iluminan en una configuración de reflexión interna total basada en objetivo, utilizando un objetivo de inmersión en aceite de alta apertura numérica y 100 aumentos. Tras un filtrado adecuado mediante conjuntos de filtros estándar, la fluorescencia se proyecta sobre una cámara CCD iluminada por la parte posterior. La lectura se realiza en modo de retardo y acumulación temporal, lo que permite escanear áreas muestrales grandes. Para ello, las muestras se desplazan utilizando una platina motorizada XY sincronizada con el desplazamiento de líneas de la cámara.

El haz láser reflejado hacia atrás se proyecta sobre un fotodiodo de dos segmentos y la señal diferencial se utiliza para controlar un piezoeléctrico Z para un reenfoque rápido. El lector está equipado con un sistema automatizado de mantenimiento de enfoque que opera durante el proceso de escaneo, con un escaneo a 488 nanómetros para la excitación selectiva de GFP y un segundo escaneo a 647 nanómetros para la excitación selectiva de PS Five. Para el análisis de datos, utilizamos un programa de cálculo de contraste escrito en MATLAB basado en la intensidad de fluorescencia dentro y fuera de la región de anticuerpo capturado.

El nivel de contraste y, por ende, el grado de interacción de proteínas se analiza para un examen rápido de un gran número de células. También puede utilizarse software automatizado disponible comercialmente. Por ejemplo, el software de imagen scan R ofrecido por Olympus ha sido probado con éxito para la evaluación de contraste en experimentos de microdisposición.

Analizamos la interacción bien conocida entre CD4 y LCK en proteínas de la señalización temprana de linfocitos T, tal como se muestra aquí. La LCK fluorescente se redistribuye claramente en regiones recubiertas con anticuerpos anti-CD4. La alteración de la estructura del cierre de zinc, que es un sitio principal de interacción entre estas dos proteínas, mediante la adición de un quelante de zinc reduce el contraste de los micropatrones de LCK.

En resumen, las principales ventajas de la técnica de micropatronado son las siguientes: cuantificación de interacciones proteicas locales con resolución espacial. Además, la detección de interacciones débiles también en la membrana plasmática de células vivas, la detección de interacciones entre presa y cebo moduladas, el análisis del estado de reposo y la aplicabilidad del enfoque para alto rendimiento.