Elaborazione delle gambe degli insetti per microscopia a fluorescenza: un metodo per preservare le strutture neuromuscolari per l'imaging

- Per iniziare, immergere gli insetti anestetizzati in soluzione di etanolo al 70% per ridurre l'idrofobicità della cuticola. Quindi lavare e permeabilizzare il tessuto con salina tamponata da fosfati contenente un detergente per almeno 30 minuti per consentire la penetrazione dei tessuti durante la fissazione.

Quindi, rimuovere la testa e l'addome dal torace. Utilizzare le forcelle per applicare una pressione delicata alla giunzione coxa-torace e staccare la gamba. Posizionare con cura le gambe in una soluzione di paraformaldeide del 4% ghiacciata durante la notte per consentirgli di penetrare nel tessuto. La paraformaldeide fissa i tessuti incrociando le proteine.

Quindi, rimuovere la soluzione di fissazione e lavare il tessuto più volte con una salina tamponata con fosfato contenente detersivo. Prima di montare, posizionare le gambe in un tampone di montaggio puro o leggermente diluito per almeno un giorno per fornire tempo sufficiente affinché il tampone entri nel tessuto.

Infine, montare le gambe in una goccia di mezzo di montaggio. Utilizzare un distanziale tra lo scivolo del microscopio e il coperchio per evitare danni al campione e fissare il supporto con smalto per unghie.

Nell'esempio seguente, vedremo la dissezione, la fissazione e il montaggio delle gambe di Drosophila melanogaster.

- Iniziare riempiendo il numero appropriato di pozzi in una piastra multiwell in vetro con etanolo al 70%.

Dopo non più di un minuto, sciacquare le mosche tre volte con una soluzione detergente tensioattiva non ionica allo 0,3% in salina tamponata da fosfati per almeno 10 minuti per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, utilizzare le flessione per rimuovere la testa e l'addome di ogni mosca senza danneggiare il segmento toracico o le gambe e utilizzare la punta di un paio di forcelle fini per applicare delicatamente ma saldamente pressione alla giunzione coxa-torace per staccare una gamba dal segmento toracico.

Posizionare le gambe in un pozzo di una nuova piastra multiwell, contenente paraformaldeide al 4% preparata al momento sul ghiaccio, per un'incubazione notturna a 4 gradi Celsius.

- È importante spingere delicatamente le gambe nel tampone di fissazione senza lasciarle galleggiare per ottenere gambe ben fissate.

- Il giorno successivo, lavare le gambe cinque volte in soluzione detergente tensioattiva non ionica fresca allo 0,3% per 20 minuti per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, sostituire il detergente con il mezzo di montaggio e mantenere le gambe nel mezzo di montaggio per almeno 24 ore.

Il giorno successivo, aggiungere circa 20 microlitri di glicerolo al 70% accanto all'estremità rivestita dello scivolo del microscopio di vetro e coprire il glicerolo con un coverslip da 22 x 22 millimetri. Successivamente, aggiungere circa 10 microlitri di supporto a destra del copripazzo e applicare una seconda linea di montaggio da 30 microlitri a destra della linea a 10 microlitri.

Utilizzando forcep fini, trasferire una gamba dalla piastra multiwell in una goccia di media alla striscia da 10 microliter del supporto di montaggio in un lato esterno verso l'alto o verso il basso. Ripetere fino a quando non sono state montate e allineate da sei a otto gambe e posizionare un secondo copripasta sulle gambe in modo che il secondo coverslip poggia leggermente sul primo coverslip. Quindi, utilizzare lo smalto per unghie in ogni angolo dei copripavimenti per fissarli in posizione.