JoVE Encyclopedia of Experiments
Investigación sobre el cáncer
0 vistas • 3:22 min • April 30th, 2023
- Para empezar, siembre las células de leucemia humana en un medio de cultivo recién preparado e incube durante el período deseado. Después de la incubación, tiña una pequeña cantidad de esta suspensión celular con azul de tripano y evalúa la viabilidad celular con un portaobjetos de contador de células TC20. Las células muertas son permeables y absorben el tinte cargado negativamente, mientras que las células viables son impermeables.
A continuación, agregue metil beta ciclodextrina al matraz de cultivo para agotar suficientemente el colesterol de la célula, haciéndolas susceptibles a los ultrasonidos. Incubar las células durante el período deseado. Llene el sistema de sonicación celular con agua desionizada y desgasifique durante unos minutos para evitar burbujas de vacío. Transfiera la cantidad deseada de células en el vial de centelleo y conecte el vial al dispositivo de retención del sistema de sonicación celular.
Coloque el dispositivo de sujeción en la parte superior de la bocina y establezca la elevación deseada desde la parte superior de la bocina. Establezca los pulsos necesarios durante la duración deseada para sonicar las celdas. Agregue azul de tripano a la suspensión celular y colóquela en el contador de células TC20 para analizar la viabilidad y el daño celular. Las células leucémicas tratadas con metilbeta ciclodextrina, cuando se exponen a ultrasonidos de baja frecuencia, muestran una lisis celular significativa.
En el siguiente protocolo, estudiaremos la sonicación celular y la evaluación del daño de las células leucémicas humanas.
- Para preparar las células para la sonicación, primero siembróguelas a 4 veces 10 a la cuarta célula por mililitro en un matraz de 25 centímetros cuadrados con medio recién preparado. Después de determinar el número de células viables por exclusión de azul de tripano, incubar el cultivo a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono hasta que el cultivo haya alcanzado la concentración deseada. Cuando las células estén listas para la sonicación, utilice un vacío y un matraz Buchner para desgasificar un volumen de agua destilada ionizada. Luego use el agua para llenar el cuerno de la copa hasta 15 milímetros por encima de la parte superior del cuerno.
Haga funcionar el sistema con el agua desgasificada durante unos siete minutos, luego transfiera 3 mililitros de células a un vial de centelleo de vidrio de 20 mililitros y conecte el vial al dispositivo de retención. A continuación, coloque el dispositivo de sujeción en la parte superior de la bocina de la copa y utilice el mecanismo deslizante para colocar el dispositivo de sujeción a una altura de 15 milímetros desde la parte superior de la bocina en la superficie del agua. Ahora sonique las células utilizando tres pulsos de ultrasonido de un segundo con un espaciado de un segundo entre cada uno de los pulsos con una amplitud del 33% y el 50%.
Evaluar la viabilidad celular tras la sonicación por exclusión del azul de tripano. Para evaluar el daño celular, enjuague la abertura de un analizador de partículas Z2 al menos 2 veces con solución salina isotónica. A continuación, añada 100 microlitros de las células sonicadas en 20 mililitros de solución salina isotónica y transfiera la muestra de células al soporte del mostrador. A continuación, eleve la plataforma hasta la apertura y analice el daño de la celda, la viabilidad y los residuos de acuerdo con las instrucciones del fabricante.