Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Investigación sobre el cáncer
0 visualizaciones • 3:20 min. • April 30th, 2023
- Las ondas ultrasónicas de baja frecuencia conducen a la lisis selectiva de las células de leucemia humana y el ensayo XTT ayuda a determinar el grado de este daño. El ensayo se basa en el principio de que las enzimas mitocondriales de las células sanas convierten un tinte XTT amarillo en un compuesto anaranjado llamado formazán. Para comenzar el ensayo, trate las células con metilbeta-ciclodextrina, un agente que agota el colesterol, y posteriormente sonique las células a baja potencia para inducir daño celular.
Centrífuga para peletizar las células y agregar medios de crecimiento celular frescos al pellet. Siembre las células en la concentración deseada en una microplaca de pocillos múltiples e incube durante la noche. Ahora, agregue la solución XTT activada a las células e incube hasta que se desarrolle el color naranja en los pocillos de la microplaca. Coloque la placa en un espectrofotómetro. Mida la absorbancia de 450 a 500 nanómetros y luego de 630 a 690 nanómetros. Reste los dos valores para obtener resultados precisos. El valor más alto de la absorbancia en el ensayo XTT indica una mayor actividad de las enzimas mitocondriales y una mayor viabilidad celular.
En el siguiente video, demostraremos el uso del ensayo XTT para determinar la eficacia de las ondas ultrasónicas de baja frecuencia para causar daño celular en células leucémicas tratadas con metilbeta ciclodextrina.
- Para evaluar la viabilidad de las células sonicadas mediante el ensayo XTT, sonicar las células utilizando un rango de uno a tres pulsos de un segundo, basados en un segundo de diferencia, para desarrollar un rango de daño para que el kit XTT lo evalúe. A continuación, gire las células y vuelva a suspender los gránulos a 1 por 10 a la quinta célula por mililitro en un medio de crecimiento recién preparado. A continuación, siembre 100 microlitros de células por pocillo en placas individuales de microtitulación de 96 pocillos de fondo plano por triplicado, incluidos tres pocillos de control que contengan 100 microlitros de medio de crecimiento completo solo para lecturas de absorbancia en blanco. Incubar las células durante 24 horas.
En la mañana del ensayo, agite suavemente las alícuotas de XTT calentado a 37 grados centígrados y los reactivos de activación hasta que las soluciones estén claras. A continuación, añada 0,1 mililitros del reactivo de activación a una alícuota de 5 mililitros del reactivo XTT. A continuación, agregue 50 microlitros de la solución XTT activada a cada pocillo de las placas inoculadas U937 y THP1 y devuelva las células a la incubadora de cultivo celular. Después de dos horas, agite las placas suavemente para distribuir uniformemente el tinte naranja en los pocillos positivos y mida la absorbancia en un lector de placas de microtitulación entre 450 y 500 nanómetros. Por último, vuelva a medir la absorbancia de todos los pocillos de ensayo entre 630 y 690 nanómetros.