JoVE Encyclopedia of Experiments
Investigación sobre el cáncer
0 vistas • 3:24 min • April 30th, 2023
- La bromodeoxiuridina o BrdU es un análogo sintético de nucleósidos de timidina. Durante la fase de síntesis del ciclo celular, el BrdU sustituye a la timidina y se integra en el ADN recién sintetizado. El BrdU incorporado permite el seguimiento de la progresión del ciclo celular. Para detectar el BrdU incorporado, primero hay que fijar y permeabilizar las células para hacerlas permeables.
A continuación, trate las células con la enzima ADNasa para escindir las hebras de ADN y exponer el BrdU incorporado. Posteriormente, agregue un anticuerpo anti-BrdU marcado con fluorescencia adecuado. El anticuerpo entra en el núcleo y se une fácilmente al BrdU expuesto presente en el ADN.
Además, trate las células con un tinte fluorescente adecuado de unión al ADN. El tinte se une al ADN, lo que permite cuantificar el contenido total de ADN. Utilice la citometría de flujo para detectar la fluorescencia tanto del BrdU marcado como del ADN.
Las intensidades de fluorescencia del ADN marcado diferencian las células en diferentes fases del ciclo celular en función de la variación en el contenido total de ADN. La señal fluorescente de BrdU identifica la posición actual del ciclo celular de las células incorporadas a BrdU.
En este ejemplo, realizaremos la tinción inmunofluorescente BrdU de células de leucemia linfoblástica aguda NALM-6.
- Antes de la tinción de anticuerpos, trate las células con ADNasa. Resuspender las células en 100 microlitros de solución de ADNasa e incubar durante una hora a 37 grados centígrados. Agregue un mililitro de tampón de lavado, centrifugue las células y deseche el sobrenadante. La tinción de anticuerpos para marcadores intracelulares distintos de BrdU se puede realizar simultáneamente con la tinción con BrdU.
- Es importante preparar controles de compensación que consistan en células no teñidas y células marcadas con cada fluorocromo. Lo ideal es utilizar los mismos anticuerpos para los controles de compensación que los utilizados en los tubos experimentales.
- Resuspendió las células en 50 microlitros de tampón de lavado con un microlitro por cada 10 a las 6 células de anticuerpo BrdU. Si se utilizan anticuerpos contra otros antígenos intracelulares específicos, deben agregarse en este punto. Incubar las células durante 20 minutos a temperatura ambiente.
Después de 20 minutos, lave las celdas con un mililitro de tampón de lavado como se muestra anteriormente. Por último, tiñe el ADN para el análisis del ciclo celular. Afloje el gránulo moviendo el tubo y agregue 20 microlitros de la solución de 7-AAD. Es fundamental utilizar una cantidad constante de 7-AAD por celda. Vuelva a suspender las células en un mililitro de tampón de tinción. Posteriormente, realizar el análisis de citometría de flujo.