Cocultivo 2D de células leucémicas con BMSC: un método para obtener subpoblaciones de células leucémicas

- En un sistema de cocultivo 2D, varios tipos de células crecen juntas en placas de cultivo planas. Este sistema de cultivo facilita el estudio de las interacciones y el comportamiento celular in vitro. Para establecer el cocultivo de células leucémicas con células estromales de médula ósea (BMSC, por sus siglas en inglés), agregue suspensión de células leucémicas a un cultivo monocapa adherente de BMSCs. Incube la placa en condiciones de cultivo adecuadas. Mantener el cocultivo reemplazando el 90% del medio de cultivo cada cuatro días.

Durante este cocultivo en 2D, las células leucémicas interactúan con las BMSC y se localizan en distintas regiones del cultivo, formando tres subpoblaciones. La microscopía de contraste de fase permite diferenciar visualmente las tres subpoblaciones. El primer grupo de células leucémicas que aparece flotando libremente en el medio se clasifica como células en suspensión. El segundo grupo de células leucémicas que se han adherido a la superficie de la monocapa de BMSC parece brillante y se clasifica como células de fase brillante.

El tercer grupo de células leucémicas que han migrado por debajo de la monocapa parece tenue y se clasifica como células de fase diminuta. En el siguiente protocolo, realizamos el cocultivo de leucemia linfoblástica aguda, o células de LLA, con células estromales de médula ósea humana.

- Comience sembrando de 5 a 20 veces, de 10 a la sexta células leucémicas en 10 mililitros de medio de cultivo específico para tumores en una placa de 100 milímetros de células estromales de médula ósea u osteoblastos confluentes al 80% a 90%. Cada cuatro días, incline la placa hacia un lado y aspire todo menos 1 mililitro del medio, teniendo cuidado de no perturbar la capa de células adherentes. Luego, agregue con cuidado 9 mililitros de medio de cultivo de células leucémicas frescas gota a gota en la esquina de la placa a lo largo del costado para garantizar una interrupción mínima de las células adherentes.

Después del 12º día de cocultivo, pipetee suavemente el medio de cultivo hacia arriba y hacia abajo sobre la placa aproximadamente de 5 a 10 veces para recolectar las células leucémicas flotantes y transfiéralas a un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, vuelva a sembrar las células en una nueva placa de 80% a 90% de células estromales de médula ósea confluentes u osteoblastos, como se acaba de demostrar. Para el día 4, se habrán formado tres subpoblaciones de células leucémicas, con las células leucémicas suspendidas flotando libremente en el medio, las células leucémicas de fase brillante adheridas a la superficie de la monocapa de células adherentes y las células leucémicas de fase diminuta migraron debajo de la monocapa.