Muestreo de sangre retroorbital: un método para aislar células mononucleares del seno retroorbital de un ratón

0 vistas3:18 min • April 30th, 2023

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- Primero, sostenga un ratón anestesiado por el cuello y protruya el ojo. Inserte un tubo capilar fino en el canto medial del ojo. Permita que la sangre fluya por acción capilar hacia un tubo. Transfiera la sangre a un tubo recubierto de EDTA y manténgalo en hielo. El EDTA se une a los iones de calcio, evitando la coagulación de la sangre. Una temperatura más baja reduce la actividad glucolítica de las células y las posibilidades de contaminación microbiana.

A continuación, diluya la sangre con un tampón que contenga EDTA y mezcle bien. Agregue con cuidado una capa de una solución separadora adecuada en el fondo, sin alterar la sangre. Centrifugar la suspensión. El polímero en la solución de separación agrega los glóbulos rojos y los sedimentos en el fondo. Las células mononucleares y las plaquetas, al ser más ligeras que el polímero, se depositan por encima del gradiente polimérico.

Retire la capa superior que contiene plasma y recoja el anillo blanco opaco que contiene células mononucleares. Diluya las células con PBS y centrífuga para eliminar el plasma y las plaquetas residuales. Utilice las células mononucleares aisladas para un análisis posterior. El siguiente protocolo demostrará el aislamiento de células mononucleares de un ratón congénito inyectado con una línea celular leucémica C1498.

- Introducir un tubo capilar en el canto medial del ojo del animal leucémico anestesiado y extraer de 100 a 200 microlitros de sangre del seno orbitario hasta el tubo capilar. Retire el tubo y controle el sangrado con la aplicación suave de una esponja de gasa estéril en el ojo. Luego, transfiera la sangre a un tubo de EDTA y almacene el tubo en hielo hasta el aislamiento de la célula mononuclear.

Para aislar las células mononucleares de la sangre, primero se añade PBS suplementado con EDTA 1 milimolar hasta un volumen final de 500 microlitros. A continuación, transfiera la muestra a un tubo de microcentrífuga. A continuación, use una jeringa de 1 mililitro equipada con una aguja de calibre 30 para colocar cuidadosamente 500 microlitros de solución de separación debajo de la sangre, teniendo cuidado de no mezclar las capas.

Separe las células por centrifugación y utilice una pipeta para transferir la capa de células mononucleares blancas opacas a un nuevo tubo de microcentrífuga. A continuación, lave las células inmunitarias en 1 mililitro de PBS. Centrifugarlos y volver a suspender el pellet en 600 microlitros de tampón FACS para su tinción y análisis por citometría de flujo.

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Última actualización: 1 agosto 2026