Centrifugación en gradiente de densidad: un método para aislar células de LLC de sangre periférica

- En los pacientes con leucemia linfocítica crónica o LLC, los linfocitos B aumentan significativamente en la médula ósea y la sangre. Para aislar estas células de LLC de una muestra de sangre, primero trate la muestra con un cóctel de enriquecimiento de células B humanas que separa las células B mediante selección negativa. Los anticuerpos del cóctel reconocen y entrecruzan específicamente los antígenos expresados por las células no B y los eritrocitos, formando complejos densos.

A continuación, coloque la muestra en capas sobre un medio de gradiente de densidad que tenga una densidad óptima para el aislamiento de linfocitos. Con la centrifugación posterior, los diferentes componentes de la sangre se separan en función de las variaciones en sus densidades en relación con el medio de gradiente. Los complejos de células RBC no B con densidades más altas se asientan a través del medio, formando un pellet. La fracción de plasma menos densa forma la capa superior. Las células CLL menos densas forman una capa blanca en la interfaz del medio de densidad plasmática.

Transfiera con cuidado la capa blanca a un tubo nuevo. Vuelva a centrifugar para obtener un pellet que contenga células CLL purificadas. En el siguiente protocolo, mostramos el aislamiento de células de leucemia linfocítica crónica, a partir de muestras de sangre de pacientes.

- Obtener muestras de sangre periférica de pacientes con leucemia linfocítica crónica previamente consentidas en tubos de extracción de sangre con EDTA acompañadas del recuento de glóbulos blancos.

- Las muestras de sangre humana deben considerarse peligrosas, ya que pueden contener virus transmitidos por la sangre. Asegúrese de que estas muestras se manipulen en un gabinete de bioseguridad de Clase II y que el usuario use una bata de laboratorio y guantes en todo momento. Deseche los materiales contaminados con sangre y desinféctelos.

- Si el recuento de glóbulos blancos es igual o superior a 40 millones de células por mililitro, diluya la muestra en una proporción de 1 a 1 con tampón de lavado RT CLL. A continuación, alícuota del medio de gradiente de densidad RT en un tubo de centrífuga cónico de tamaño adecuado para la muestra. Coloque cuidadosamente la muestra en capas sobre el medio y centrifuga a 400 veces G durante 30 minutos a RT.

Con una pipeta pasteur de plástico, recoja suavemente la capa blanca de células mononucleares que se acumularon en la interfaz del medio de gradiente de densidad y el tampón de lavado de LLC. Transfiera esta monocapa aislada a un tubo de centrífuga cónico nuevo de 50 mililitros. Para lavar las células, agregue 40 mililitros de tampón de lavado CLL a esta monocapa y centrifugue a 300 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Deseche el sobrenadante, agite la parte inferior del tubo para volver a suspender el pellet y repita este lavado. Deseche el sobrenadante, vuelva a mover el fondo del tubo y luego vuelva a suspender el pellet de celda en un volumen determinado de tampón de lavado de CLL, según el tamaño del pellet. Después de contar las células y después de la citometría de flujo para verificar la pureza celular, coloque las células en placas de cultivo de tejidos a la densidad celular requerida, listas para la estimulación o el tratamiento con medicamentos.