JoVE Encyclopedia of Experiments
Investigación sobre el cáncer
0 vistas • 4:39 min • April 30th, 2023
- El ensayo de flujo extracelular ayuda a estudiar el metabolismo celular midiendo las dos principales vías de energía: la glucólisis y la respiración mitocondrial. Durante la glucólisis, las células metabolizan la glucosa y secretan lactato en el espacio extracelular junto con protones, determinado mediante la medición de la tasa de acidificación extracelular o ECAR. Durante la respiración mitocondrial, las células utilizan el oxígeno para la producción de ATP, medido mediante la determinación de la tasa de consumo de oxígeno u OCR.
Las células cancerosas exhiben una alta absorción de glucosa a medida que alteran su tasa metabólica para adaptarse y mantener la proliferación celular no regulada. Para analizar el metabolismo en las células cancerosas, primero ensamble una microplaca de análisis de flujo que contenga una monocapa de células cancerosas adherentes y un cartucho sensor hidratado. Transfiera el conjunto de placas a un analizador de flujo. Dentro del analizador, las sondas del sensor descienden para crear una microcámara transitoria. Para medir el flujo extracelular, el puerto de inyección introduce compuestos de prueba en la microplaca en puntos de tiempo preestablecidos.
En función del metabolismo celular, las concentraciones de oxígeno disponibles y los protones liberados en la microcámara fluctúan. Dos fluoróforos incrustados en la base del cartucho detectan y miden simultáneamente los niveles de oxígeno y protones, indicativos de la respiración mitocondrial y la glucólisis, respectivamente. En el siguiente protocolo, demostraremos un ensayo de flujo extracelular para medir la actividad metabólica de las células leucémicas primarias.
- Mientras tanto, para preparar las placas para el análisis de flujo extracelular, agregue 12,5 microlitros de solución adhesiva celular en cada pocillo de dos placas analizadoras de flujo extracelular de 8 pocillos. Después de 20 minutos, aspire el adhesivo celular y lave cada pocillo dos veces con 200 microlitros de agua estéril por lavado.
Después del segundo lavado, deje las placas en la campana hasta que los pocillos estén secos y coloque el cartucho del sensor boca abajo en la mesa del laboratorio. Separe la placa de utilidad y el cartucho del sensor del analizador de flujo, y llene cada pocillo de la placa de utilidad con 200 microlitros de calibrante y cada foso alrededor del exterior de los pocillos con 400 microlitros de calibrante.
Regrese el cartucho del sensor a la placa de utilidad que ahora contiene el calibrador y coloque el conjunto del cartucho en una incubadora humidificada a 37 grados Celsius sin CO2 durante la noche. A continuación, encienda el analizador de flujo extracelular y deje que se caliente a 37 grados centígrados durante la noche.
A la mañana siguiente, transfiera las células del matraz a tubos cónicos de 50 mililitros para la centrifugación y vuelva a suspender los gránulos en 1 mililitro del medio experimental apropiado para el recuento. Vuelva a suspender las células a 4 veces 10 a las 6 células en 400 microlitros de concentración de medio experimental y agregue 50 microlitros de células en los pocillos B a G de la placa del analizador de flujo, y 180 microlitros del medio experimental en los pocillos A y H como pocillos de control de fondo.
Después de la centrifugación, agregue lenta y cuidadosamente 130 microlitros del medio experimental a los pocillos B a G, y confirme visualmente la adherencia estable de las células al fondo de cada pocillo bajo el microscopio. A continuación, devuelva la placa de análisis de flujo a la incubadora humidificada a 37 grados centígrados sin CO2 durante 30 minutos.
20 minutos antes del final de la incubación, cargue los compuestos en los puertos de inyector apropiados del cartucho de acuerdo con el protocolo experimental, como se indica en la tabla. A continuación, establezca el programa de análisis de flujo extracelular adecuado. Inicie el programa y reemplace la placa de calibración con la placa de ensayo cuando se le solicite.