JoVE Encyclopedia of Experiments
Investigación sobre el cáncer
0 vistas • 3:57 min • April 30th, 2023
- Las células T, una clase de linfocitos, desempeñan un papel activo en la lucha contra las infecciones. Junto con muchos otros tipos de células sanguíneas, las células T inmunocompetentes están presentes en el bazo y los ganglios linfáticos de los ratones. Para aislar selectivamente las células T, se extraen el bazo y los ganglios linfáticos murinos y se maceran en un colador de células. Enjuague el tejido con un medio apropiado para obtener una suspensión unicelular.
Agregue cloruro de amonio y potasio, o tampón ACK, para lisar los glóbulos rojos. Centrífuga para separar las células sanguíneas intactas del lisado. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en un tampón adecuado. Trate la suspensión con una mezcla de anticuerpos antiratón biotinilados para dirigirse a las células sanguíneas como granulocitos, células B, células NK y cualquier eritrocito restante. Las células T no son objetivo y, por lo tanto, permanecen sin etiquetar.
A continuación, agregue microesferas magnéticas anti-biotina a la suspensión. Todas las células marcadas con biotina se unen a las microperlas. Cuando se mantienen bajo la influencia de un fuerte campo magnético, las células marcadas magnéticamente se adhieren a la pared del tubo. Las células T no marcadas permanecen en suspensión. Recoja las células T enriquecidas no unidas en un tubo de recolección nuevo. En el siguiente protocolo, mostramos el aislamiento de las células T del bazo y los ganglios linfáticos de ratón, utilizando una técnica de separación magnética.
- Agrupe los ganglios linfáticos y el bazo en un colador de poros de 40 micrómetros y use un émbolo de jeringa para macerar los tejidos a través de los filtros para liberar las células. Lave el colador y el émbolo con medio RPMI suplementado con 1% de FBS para recoger todas las células y sedimentar las células por centrifugación. Agregue 5 mililitros de tampón de lisis ACK al pellet de celda.
Después de cinco minutos a temperatura ambiente, detenga la reacción con 5 mililitros de medio suplementado con FBS al 1% y granule los glóbulos blancos por centrifugación. Vuelva a suspender el pellet en 5 mililitros de tampón MACS para contar y diluya las células hasta una concentración de 2 veces 10 a las 8 células por microlitro en tampón MACS fresco. Agregue la concentración adecuada de anticuerpos anti-eritroides, anti-granulocitos, anti-células B y anti-células de depleción de células NK por 1 veces 10 a las 6 células para una incubación de 15 minutos a 4 grados Celsius.
Al final de la incubación, lave las células con 10 milímetros de tampón MACS helado y vuelva a suspender el pellet a una concentración de 1 por 10 a 8 células por mililitro en el tampón MACS fresco. A continuación, agregue 0,22 microlitros de microesferas anti-biotina por 1 veces 10 a las 6 celdas con mezcla para una incubación de 15 minutos a 4 grados centígrados.
Al final de la incubación, lave las células con 10 mililitros de tampón MACS helado y recoja las células T enriquecidas no unidas mediante la separación magnética de perlas utilizando el separador MACS express de acuerdo con los protocolos estándar de aislamiento de perlas. Al final de la separación, sedimente las células T por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en 5 mililitros de tampón MACS fresco para el recuento.