Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina: una técnica para estudiar las interacciones proteína-ADN en células

- La inmunoprecipitación de cromatina, o ChIP, es una técnica utilizada para determinar las interacciones proteína-ADN en las células. Las proteínas se unen a sitios específicos en el ADN y regulan la expresión génica. Primero, estabilice el complejo ADN-proteína con formaldehído. El formaldehído entrecruza las proteínas con la secuencia de ADN asociada mediante la formación de enlaces covalentes.

A continuación, utilice un tampón de lisis adecuado para lisar las células y liberar cromatina que contiene los complejos de proteínas y ADN reticulados. Centrifugar la suspensión y sonicar el sobrenadante para obtener fragmentos de cromatina. A continuación, etiquete la muestra con un anticuerpo adecuado que se una específicamente a la proteína unida al ADN.

Agregue perlas magnéticas especializadas a la muestra. La perla reconoce el anticuerpo y se une a él. Utilice un imán para recoger las perlas magnéticas con el complejo anticuerpo-proteína-ADN. Lave la muestra para eliminar la cromatina o los anticuerpos no unidos. Agregue un tampón de alta concentración de sal al complejo e incube a temperaturas más altas para revertir los enlaces cruzados de proteínas de ADN.

Con un imán, recoja el sobrenadante que contiene el ADN y las proteínas. Agregue la enzima proteinasa K para degradar las proteínas de la muestra. Añada un tampón adecuado para precipitar el ADN y utilícelo para análisis posteriores. El siguiente protocolo demostrará la inmunoprecipitación de cromatina en células de leucemia linfocítica crónica para identificar los genes diana de NFAT2.

- Primero, prepare 20 microlitros de perlas recubiertas de proteína A para cada precipitación en un tubo de 1,5 mililitros. Deje que las cuentas se depositen en una rejilla magnética durante un minuto y retire el sobrenadante. A continuación, lave las perlas con 40 microlitros de 1x tampón ChIP 1 por cada 20 microlitros de perlas recubiertas de proteína A pipeteando hacia arriba y hacia abajo.

Deje que las cuentas se depositen en una rejilla magnética durante un minuto y retire el sobrenadante. Repita este proceso de lavado tres veces más antes de volver a suspender las cuentas en su volumen original de 1x ChIP buffer 1. Agregue BSA, inhibidor de proteasa, tampón ChIP 5x y agua de grado ChIP-seq a las perlas. A continuación, agregue la cromatina cortada.

Use 10 microgramos de anticuerpo anti-NFAT2 para capturar NFAT2 y 2,5 microgramos de anticuerpo IgG como control. Incubar las mezclas durante la noche a 4 grados centígrados en una rueda que gire a seis RPM. Al día siguiente, haga girar los tubos durante cinco segundos a 7.000 veces g e incube en la rejilla magnética durante un minuto.

A continuación, aspire el sobrenadante y lave las perlas una vez con los tampones de lavado 1, 2, 3 y 4, consecutivamente. Haga girar los tubos durante cinco segundos a 7.000 veces g antes de incubar los tubos en la rejilla magnética durante un minuto. Después de esto, retire el sobrenadante y agregue el siguiente tampón de lavado.

Después del último lavado, gire los tubos durante cinco segundos a 7.000 veces g. Incube los tubos en la rejilla magnética durante un minuto. Retire el sobrenadante y recoja las perlas en 100 microlitros de tampón de elución 1. Luego, incube los tubos en la rueda giratoria durante 30 minutos.

A continuación, gire brevemente los tubos y colóquelos en una rejilla magnética durante un minuto. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros y agregue 4 microlitros de tampón de elución 2. Para crear el control de entrada, mezcle 1 microlitro de la cromatina cortada con 99 microlitros de tampón de elución uno y 4 microlitros de tampón de elución dos. Luego incubar las muestras durante cuatro horas a 65 grados centígrados con agitación.

Después de esto, agregue 100 microlitros de isopropanol al 100% a los tubos. Vórtice y gire las muestras durante cinco segundos a 7.000 veces g. A continuación, añada 10 microlitros de perlas magnéticas a cada muestra. Vértice e incube las muestras en una rueda giratoria a temperatura ambiente durante una hora.

A continuación, gire los tubos brevemente y colóquelos en una rejilla magnética durante un minuto. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las perlas en 100 microlitros de tampón de lavado. Invierta los tubos para mezclarlos e incubarlos durante cinco minutos en una rueda giratoria a temperatura ambiente. A continuación, centrifuga brevemente los tubos. Colóquelos en una rejilla magnética durante un minuto y use una pipeta para eliminar el sobrenadante.

A continuación, añade 100 microlitros de tampón de lavado dos. Invierta los tubos para mezclar e incube durante cinco minutos en una rueda giratoria a temperatura ambiente. Después de esto, centrifuga brevemente los tubos y colócalos en una rejilla magnética durante un minuto. Retire el tampón de lavado dos, por aspiración, y vuelva a suspender las perlas en 55 microlitros de tampón de elución.

Para eluir el ADN precipitado, incube las muestras en una rueda giratoria a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de esto, gire los tubos brevemente y colóquelos en una rejilla magnética durante un minuto. Por último, transfiera el sobrenadante a nuevos tubos de 1,5 mililitros.