Cultivo y recolección de clones de HSPC: un método para obtener los clones de HSPC clasificados individualmente

- Células madre y progenitoras hematopoyéticas o HSPC, pueden autorrenovarse y diferenciarse en varios tipos de células sanguíneas. Las HSPC acumulan gradualmente mutaciones en el ADN a lo largo de su vida, lo que puede contribuir a la leucemia. Para analizar este tipo de mutaciones, las HSPC se generan normalmente a partir de la médula ósea.

Comience por agregar anticuerpos conjugados con fluoróforos a las células mononucleares (células madre adultas aisladas de la médula ósea) e incubarlas durante el tiempo deseado. Los anticuerpos se unen a marcadores específicos de la superficie celular, como CD34. Ahora, cargue la mezcla en la máquina de citometría celular activada por fluorescencia o FACS.

Los anticuerpos conjugados con fluoróforos emiten fluorescencia cuando son golpeados por el láser. Las gotas de células individuales pasan a través del detector que mide la intensidad de fluorescencia, en función de la cual la gota posee una carga eléctrica. En presencia de campos electromagnéticos, las células cargadas positivamente se mueven al contenedor negativo y viceversa.

Ahora, cultive las HSPC positivas para CD34 clasificadas por FACS en un medio adecuado durante el tiempo deseado hasta que los clones sean visibles. A continuación, desaloje los clones mediante un pipeteo vigoroso y centrifugar para pellet las células. Almacene el pellet que contiene HSPC clonales a menos 20 grados centígrados para su posterior análisis. En el siguiente protocolo, generaremos clones de HSPC a partir de las células mononucleares.

- Comience este procedimiento con la preparación del material de muestra y la tinción como se describe en el protocolo de texto. Luego, prepare 25 mililitros de medio de cultivo de células madre y progenitoras hematopoyéticas, o HSPC. Llene una placa de cultivo celular de 384 pocillos con 75 microlitros de medio de cultivo HSPC en cada pocillo. Para evitar la evaporación del medio en los pozos exteriores, llene los pozos exteriores con 75 microlitros de agua estéril o PBS y no utilice estos pozos para la clasificación de células.

La clasificación correcta de las HSPC de señal viables es el paso más crítico en este protocolo. Establezca compuertas para la clasificación de HSPC en función de un control sin tinción en 10.000 células de la muestra de tinción. Puerta de celdas individuales dibujando una puerta alrededor de la altura de dispersión directa lineal frente a la fracción de área de dispersión directa.

Utilice la fracción de control sin manchar para dibujar una puerta para la fracción de linaje. Dibuje puertas para las células CD34 positivas y caracterice aún más este subconjunto estableciendo una puerta específica para las células CD38 negativas y CD45RA negativas. Cargue la placa de 384 pocillos en la máquina FACS y clasifique las celdas individuales. Si es aplicable a la máquina FACS, active la opción de mantener los datos de clasificación de índices para permitir el seguimiento de las celdas ordenadas.

Para cultivar HSC clasificadas individualmente, envuelva la placa de cultivo de 384 pocillos con tapa en una envoltura de polietileno transparente. Transfiera la placa de 384 pocillos a una incubadora humidificada a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono y manténgala en la incubadora durante tres o cuatro semanas hasta que aparezcan los clones visibles. Después de cuatro semanas de cultivo, determine qué pozos tienen una confluencia del 30% o más.

Para cada clon, rellene previamente microtubos de 1,5 milímetros con 1 mililitro de BSA al 1% en PBS y etiquete el tubo de acuerdo con el pocillo correspondiente. Humedecer previamente la punta de una pipeta con un 1 % de BSA en PBS para minimizar el número de células que se adhieren a la punta de la pipeta. Pipetee ferozmente el medio hacia arriba y hacia abajo al menos cinco veces mientras raspa el fondo del pozo con una pipeta de 200 microlitros ajustada a 75 microlitros.

Recoja la suspensión celular en el microtubo marcado que corresponde al pocillo. Repita el pipeteo en el pocillo con hasta 75 microlitros de BSA y PBS frescos al 1 % para garantizar la máxima absorción de células. Las células cultivadas clonalmente pueden adherirse al fondo de un pozo. Inspeccione los pocillos con un microscopio de luz invertida estándar para asegurarse de que se hayan recolectado todas las células.

Si se han cosechado todos los pocillos con más del 30% de confluencia, vuelva a colocar la placa de 384 pocillos en la incubadora. Los cultivos clonales pueden proliferar hasta cinco semanas. Gire la suspensión de la celda durante cinco minutos a 350 veces g. Un pequeño perdigón debe ser visible. Retire con cuidado todos los microlitros del sobrenadante, excepto unos cinco. Los gránulos de células pueden congelarse a menos 20 grados centígrados y almacenarse durante varios meses antes del aislamiento del ADN.