Clasificación de células activadas magnéticamente: un método para aislar células C-Kit positivas

- c-Kit, o CD117, es un receptor transmembrana de tirosina cinasa expresado por células madre hematopoyéticas o progenitoras presentes en la médula ósea y la sangre. También es un marcador para la detección de la leucemia mieloide aguda.

Para aislar las células c-Kit positivas, recoja los huesos murinos de las piernas y tritúrelos para liberar la médula desde el interior. Filtre la suspensión de médula ósea para eliminar cualquier fragmento de hueso. Coloque el filtrado que contiene células de médula ósea en un medio de gradiente de densidad y centrifuga para separar las células mononucleares de otras fracciones.

Recoja la capa turbia de células mononucleares en un tubo que contenga microperlas conjugadas con anticuerpos anti-CD117 de ratón. Incubar para que los complejos anticuerpo-perlas se unan a los receptores CD117 en las células c-Kit positivas. Pase la suspensión incubada a través de una columna magnética colocada en un campo magnético. Todas las células positivas del c-Kit marcadas con las microperlas magnéticas permanecen en la columna, mientras que las células no marcadas pasan a través de ella.

Retire la columna del campo magnético y enjuague el contenido con un tampón adecuado para eluir las celdas positivas del c-Kit. En el siguiente protocolo, mostraremos el aislamiento de células c-Kit positivas de la médula ósea de un ratón transgénico.

- Para empezar, recolecta los huesos de las patas de un ratón sacrificado. Limpia los tejidos de los huesos con un bisturí. Luego, coloque los huesos en PBS frío sobre hielo y triture los huesos con un mortero. Después de esto, filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 70 micrómetros en un tubo con tapón de rosca de 50 mililitros con una pipeta de 10 mililitros. Lave el mortero varias veces con PBS frío y agregue la suspensión de celdas al tubo de 50 mililitros.

A continuación, centrifugar la médula ósea y eliminar el sobrenadante con vacío y pipeta de vidrio. Vuelva a suspender el pellet celular en cinco mililitros de PBS. Con una pipeta, agregue lentamente la médula ósea suspendida a la parte superior de la polisacarosa a temperatura ambiente.

Después de esto, haga girar la polisacarosa a 400 g durante 20 minutos con el freno apagado. Después de la cetrifugación, recoja la interfaz de celda mononuclear total turbia con una pipeta y transfiérala a un nuevo tubo de 15 mililitros. Lleve el volumen a 10 mililitros con PBS y retire 20 microlitros para contar.

Después de la cetrifugación, deseche el sobrenadante y coloque el pellet sobre hielo. A continuación, vuelva a suspender el pellet de celda en PBS con EDTA y BSA. Agregue microperlas CD117 a la suspensión celular y vórtice para mezclar. Después de esto, incubar la suspensión durante 10 minutos a 4 grados centígrados. Luego, suba el volumen a 10 mililitros con más PBS con EDTA y BSA y centrifugue a 1.200 g a 4 grados centígrados durante cinco minutos.

Utilice el vacío para eliminar el sobrenadante y suspender el pellet de celda en PBS con EDTA y BSA. Luego, agregue tres mililitros de PBS con EDTA y BSA a un soporte magnético con una columna magnética y deje que fluya hacia un tubo de recolección. Una vez que el tampón termine de fluir a través de la columna, agregue la suspensión de celda y permita que fluya a través de la columna hacia el tubo de recolección.

A continuación, añada 5 mililitros más de PBS con EDTA y BSA a la columna y enjuáguela inmediatamente con el émbolo. Retire el émbolo y repita el lavado antes de contar las celdas. Después de centrifugar las células, retire el sobrenadante y suspenda el pellet celular en IMDM completo para el cultivo. Cultive las células durante la noche a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.