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Investigación sobre el cáncer
0 vistas • 4:59 min • April 30th, 2023
- Los retrovirus son virus de ARN que se replican mediante el uso de transcriptasa inversa para convertir su genoma de ARN en ADN bicatenario e integrarse permanentemente en el genoma del huésped. Las nuevas partículas virales salen de la célula y pueden infectar otras células. La terapia génica contra el cáncer emplea vectores retrovirales para introducir genes terapéuticos en las células diana a través de una técnica llamada transducción para regular a la baja el gen mutado o eliminar células.
Para obtener vectores retrovirales de alto título, transfecte las células HEK 293 con una mezcla de transfección que contenga el plásmido retroviral deseado, un plásmido de empaquetamiento y un agente transfector adecuado. Incuba las células. El agente transfecético facilita la entrega de ambos plásmidos en las células.
El plásmido retroviral codifica el genoma viral con el gen diana, mientras que el plásmido de empaquetamiento codifica las proteínas de la envoltura viral. La maquinaria celular de las células de empaquetamiento forma partículas retrovirales y las libera en el medio. Recoja el sobrenadante viral y centrifugue para eliminar las células.
Transfiera la concentración deseada de partículas virales y células cancerosas a una placa de cultivo recubierta de fibronectina para facilitar la unión de las proteínas de la envoltura viral a las células. Incuba las células. Recoja las células y realice la citometría de flujo para analizar la eficiencia de la transducción. Este protocolo llevará a cabo la transducción mediada por retrovirales de células de médula ósea de ratón c-Kit positivas.
- Primero, combine el ADN del plásmido retroviral con el plásmido de empaque, el cloruro de calcio y el agua en un tubo de 1,5 mililitros. A continuación, añade 500 microlitros de HBS a otro tubo de 1,5 mililitros. Agregue la mezcla de transfección gota a gota al tubo que contiene HBS mientras mezcla simultáneamente con el vórtice ajustado al ajuste más bajo.
Incube la mezcla de transfección a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos. Durante el período de incubación, agregue cloroquina a las células HEK y manténgalas en la incubadora. Después de agregar la mezcla de transfección, incube las células durante 8 horas en una incubadora de 37 grados Celsius, 5% de CO2, cambiando el medio celular agregando 14 mililitros de medio DMEM 10 fresco muy lentamente. El pipeteo lento contra la pared de la placa ayuda a evitar la extracción de las células HEK.
A continuación, incubar las células durante la noche en la incubadora de 37 grados centígrados con un 5% de CO2. Use una jeringa de 10 mililitros para recolectar el sobrenadante viral. A continuación, conecte un filtro de jeringa de 0,45 micrómetros a la jeringa. Sumerge el sobrenadante viral en un nuevo tubo de recolección. Recoja el sobrenadante viral aproximadamente 16 horas después.
Después de esto, agregue 2 mililitros de fragmento de fibronectina humana recombinante en PBS a placas de cultivo de 6 pocillos sin tratar. Al día siguiente, utilice una pipeta para eliminar la fibronectina de las placas. Bloquee las placas con 2% de BSA en PBS e incube las placas a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Use una aspiradora para eliminar el BSA y lave las placas con PBS antes de quitarlo con la aspiradora. Después de esto, agregue inmediatamente el sobrenadante viral filtrado y centrifugue la placa durante dos horas. Use una aspiradora para eliminar el sobrenadante y vuelva a girar la placa.
A continuación, retire el sobrenadante con una aspiradora y lave los pocillos recubiertos de virus con PBS. Retire el PBS con la aspiradora. Añada las células de ratón c-Kit+ previamente cultivadas a los pocillos recubiertos de virus. Después de la centrifugación, incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. 48 horas después de la transducción, granular las células mediante centrifugación y resuspenderlas en el tampón FACS número 1.