JoVE Encyclopedia of Experiments
Investigación sobre el cáncer
0 vistas • 3:31 min • April 30th, 2023
- A veces, una célula madre o progenitora sufre mutaciones, dando lugar a una célula madre leucémica. En estas células, ciertas proteínas están reguladas al alza, y el uso de compuestos anticancerígenos contra dichas proteínas puede ayudar a controlar el crecimiento de las células. El efecto de estos compuestos anticancerígenos se puede analizar mediante el ensayo de UFC mediante el seguimiento del número y el tamaño de las colonias formadas.
Comience tomando células progenitoras de un ratón leucémico y diluyéndolas en un medio de cultivo adecuado. Agregue esta suspensión celular junto con el compuesto anticancerígeno apropiado a la metilcelulosa que contiene citocinas específicas del ratón y viértala en una placa de Petri. Incuba esta mezcla hasta que aparezcan las colonias. La metilcelulosa es una matriz semisólida químicamente inerte que impide la migración celular, mientras que las citocinas estimulan a las células progenitoras para que se diferencien y formen colonias que contengan una progenie reconocible.
A continuación, tiñe las colonias con cloruro de yodonitrotetrazolio, o INT, e incuba durante la noche hasta que las colonias se vuelvan de color marrón rojizo oscuro. Las enzimas mitocondriales reducen el INT de color amarillo a un colorante formazano de color marrón rojizo. Finalmente, identifique y cuente las colonias presentes en el plato. En el siguiente protocolo, realizaremos un ensayo de UFC para probar el efecto de los compuestos anticancerígenos en las células YFP positivas.
- Primero, descongele la metilcelulosa con citocinas para ratones a temperatura ambiente. A continuación, alícuota 3 mililitros de metilcelulosa en un tubo FACS. Añadir 100 microlitros de la suspensión celular con los inhibidores adecuados a 3 mililitros de metilcelulosa. A continuación, agita la suspensión en alto durante 10 a 30 segundos.
Después de que la mayoría de las burbujas de aire escapen, use una jeringa de 1 mililitro para colocar 1 mililitro del medio en tres placas replicadas. Coloque las placas en una placa de Petri grande junto con una placa abierta que contenga agua estéril. Luego cubra la placa de Petri grande e incube las células a 37 grados centígrados.
Prepare la tinción de cloruro de yodonitrotetrazolio disolviendo 10 miligramos de cloruro de yodonitrotetrazolio en 10 mililitros de agua. Filtro: esterilice la solución de tinción con una jeringa Luer-Lok equipada con un filtro de 0,2 micrómetros.
En la campana de cultivo de tejidos, agregue 100 microlitros de la solución de tinción gota a gota alrededor de la placa CFU. A continuación, incubar las placas durante la noche a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo celular. Finalmente, después de que las colonias hayan adquirido un color marrón rojizo oscuro, use un fondo blanco en la campana de cultivo de tejido estéril para tomar fotos de la placa de UFC teñida.