Name: Imagen de una sola molécula de transporte nuclear (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Aprende a visualizar el transporte de moléculas individuales a través de los complejos de poro nuclear mediante microscopía de fluorescencia. Este método permite analizar la dinámica de importación y exportación en células HeLa con alta resolución espacial.

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Este proyecto fue financiado por la Beca de Investigación de la capacidad de mejora (Bowling Green State University).

<ol><li>Ma, J., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Snapshots+of+Three-Dimensional+Distribution+of+Transient+Interactions+in+Nuclear+Pore+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Snapshots of Three-Dimensional Distribution of Transient Interactions in Nuclear Pore Complex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Sarma, A., Goryaynov, A., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Imaging+of+the+Calcium-Regulated+Nuclear+Pore+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Imaging of the Calcium-Regulated Nuclear Pore Permeability.</a> , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Yang, W., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+single+molecules+transiting+through+nuclear+pore+complexes+using+narrow-field+epifluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing single molecules transiting through nuclear pore complexes using narrow-field epifluorescence microscopy.</a> Methods. 39, 316-328 (2006).</li>
<li>Yang, W., Gelles, J., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+single-molecule+translocation+through+nuclear+pore+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Imaging of single-molecule translocation through nuclear pore complexes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12887-12892 (2004).</li>
</ol>

Se debe tener cuidado para asegurar un adecuado colocalización de moléculas de NE y solo durante el experimento. También es importante proporcionar una relación señal ruido, sobre todo cuando la señal es baja debido a un etiquetado deficiente o photobleaching. Precisión de localización está limitada por el ruido de fondo (que surge de la fluorescencia fuera de foco, el ruido CCD de lectura, los factores de la corriente oscura y otros).

imagen de una sola molécula de transporte nuclear

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

La utilidad de los enfoques de una sola molécula de microscopía de fluorescencia se ha demostrado ser de una gran disponibilidad en la comprensión de las reacciones biológicas en la última década. La investigación de las interacciones moleculares con alta resolución temporal y espacial profunda dentro de las células se ha mantenido un reto debido a las señales de por sí débil que surgen a partir de moléculas individuales. Obras recientes de Yang et al. demostrado que estrecha el campo de microscopía de epifluorescencia permite la visualización de transporte nucleocytoplasmic en el nivel de una sola molécula. Por el enfoque de una sola molécula, la cinética importantes, como el tiempo de transporte nuclear y la eficiencia, para las moléculas de carga depende de la señal e independientes se han obtenido. Aquí se describe un protocolo para el abordaje metodológico, con una mejor resolución espacio-temporal de 0,4 nm y 12 ms. La resolución mejorada que nos permitió la captura de transporte activo y eventos transitorios pasiva difusión a través de los complejos de poro nuclear (NPC) en semi-células intactas. Esperamos que este método es utilizado en el esclarecimiento de otros eventos de unión y el tráfico dentro de las células.

Microscopía de una sola molécula approch proporcionan nuevos conocimientos sobre el transporte nuclear.

Imagen de una sola molécula de transporte nuclear

Se ha demostrado que la utilidad de los enfoques de microscopía de fluorescencia de molécula única resulta de gran provecho para comprender las reacciones biológicas a lo largo de...

La envoltura nuclear de la célula contiene aproximadamente 2000 complejos de poros nucleares que permiten el transporte de moléculas solubles en agua, como ARN, ribosomas, ciertas proteínas, carbohidratos y moléculas de señalización. Al añadir moléculas de carga marcadas a células permeabilizadas, puede visualizarse el movimiento de moléculas individuales a través del poro nuclear mediante microscopía de fluorescencia. Se requieren imágenes de lapso de tiempo para determinar la localización, así como las características espaciotemporales, como el tiempo de transporte, la eficiencia de importación y exportación, y la frecuencia de entrada. Hola, soy Alex ov, estudiante de doctorado del laboratorio de microscopía de molécula individual del Departamento de Biología de la Universidad Estatal de Bowling Green.Soy Asha P Shema, estudiante de maestría, también del laboratorio de microscopía de molécula individual. Soy Juma, investigador posdoctoral aquí en el laboratorio de microscopía de molécula individual.Hoy les mostraremos un procedimiento de imagen individual de moléculas para el transporte nuclear a través de los complejos PO nucleares en células helo. Utilizamos este procedimiento

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Research

Investigación

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Biology

Biología

Aquí se describe la instrumentación y métodos para la detección de moléculas de proteína única etiquetados con fluorescencia que interaccionan con una sola molécula de ADN suspendido entre dos microesferas ópticamente atrapados.

Combinando Manipulación sola molécula y de imagen para el estudio de las interacciones proteína-ADN

Se describe un procedimiento para la detección de elementos químicos presentes in situ en células humanas, así como su cuantificación en vitro . El método es adecuado para cualquier tipo de células y es particularmente útil para los análisis químicos cuantitativos en las células siguiendo en vitro exposición de nanopartículas de óxido de metal.

In Situ Detección y cuantificación de la célula de las nanopartículas de óxido de Metal usando análisis de microsonda Nuclear

Este protocolo describe un método para medir sensitivamente la tasa de transporte nucleocitoplasmático dentro de las neuronas motoras NSC-34 células mediante la cuantificación del cambio en tiempo real en la importación nuclear de una proteína NLS-NES-GFP.

Ensayo para medir el transporte nucleocitoplasmático en tiempo real dentro de las células NSC-34 similares a neuronas motoras

Este protocolo describe un nuevo método que permite la visualización cuantitativa de la formación de complejos de proteínas SNARE, basado en la transferencia de energía de resonancia Förster y toda la vida de la fluorescencia microscopía de imágenes.

Visualizar el lazo intracelular del tráfico de por vida de fluorescencia microscopía de imágenes

Aquí ilustramos cómo sola molécula de microscopía de localización foto-activado puede llevarse a cabo en la terminal del nervio motor de un vivo Drosophila melanogaster tercer instar de la larva.

En Vivo Una sola molécula de seguimiento en la Terminal presináptica del nervio Motor del Drosophila

Describimos métodos de fotoactivación de fluorescencia para analizar el transporte axonal de neurofilamentos en axones mielinados individuales de nervios periféricos de ratones transgénicos que expresan una proteína neurofilament fotoactivable.

Imágenes y análisis del transporte de neurofilamento en el nervio tibial de ratón extirpado

Los métodos actuales describen un enfoque no ratiométrico para imágenes de calcio subcompartimentales de alta resolución in vivo en Caenorhabditis elegans utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente fácilmente disponibles.

Imágenes subcelulares del manejo neuronal del calcio in vivo

Este protocolo describe cómo configurar y realizar análisis automatizados de manera eficiente de datos de imágenes de células vivas obtenidos a partir del seguimiento del transporte nucleocitoplasmático a través de herramientas optogenéticas.

Uso de las herramientas de optogenética LEXY y LINuS y análisis automatizado de imágenes para cuantificar la dinámica de transporte nucleocitoplasmático en células vivas

Este protocolo presenta un flujo de trabajo eficiente para la microscopía de localización de moléculas individuales de núcleos aislados de Arabidopsis, utilizando aislamiento, fijación y marcaje optimizados para lograr una visualización nanométrica fiable de la cromatina y la ARN polimerasa II. Este enfoque puede adaptarse fácilmente a otras proteínas asociadas a la cromatina o modificaciones de histonas para imágenes de alta resolución.

Un protocolo simplificado para microscopía de localización de molécula única en núcleos de Arabidopsis

Función de la membrana de proteínas está regulada por la composición lipídica de la membrana celular. Este artículo detalla cómo video-para formar un parche a través de electrodos de dos capas de parches, así como el uso de canales de gramicidina como reporteros de propiedades de la membrana alterado.

Métodos de una sola molécula para vigilar los cambios en las propiedades elásticas bicapa

Aprende a visualizar el transporte de moléculas individuales a través de los complejos de poro nuclear mediante microscopía de fluorescencia. Este método permite analizar la dinámica de importación y exportación en células HeLa con alta resolución espacial.

Imagen de una sola molécula de transporte nuclear

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