Name: Imagen de una sola molécula de transporte nuclear (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Aprende a visualizar el transporte de moléculas individuales a través de los complejos de poro nuclear mediante microscopía de fluorescencia. Este método permite analizar la dinámica de importación y exportación en células HeLa con alta resolución espacial.

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Este proyecto fue financiado por la Beca de Investigación de la capacidad de mejora (Bowling Green State University).

<ol><li>Ma, J., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Snapshots+of+Three-Dimensional+Distribution+of+Transient+Interactions+in+Nuclear+Pore+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Snapshots of Three-Dimensional Distribution of Transient Interactions in Nuclear Pore Complex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Sarma, A., Goryaynov, A., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Imaging+of+the+Calcium-Regulated+Nuclear+Pore+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Imaging of the Calcium-Regulated Nuclear Pore Permeability.</a> , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Yang, W., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+single+molecules+transiting+through+nuclear+pore+complexes+using+narrow-field+epifluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing single molecules transiting through nuclear pore complexes using narrow-field epifluorescence microscopy.</a> Methods. 39, 316-328 (2006).</li>
<li>Yang, W., Gelles, J., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+single-molecule+translocation+through+nuclear+pore+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Imaging of single-molecule translocation through nuclear pore complexes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12887-12892 (2004).</li>
</ol>

Se debe tener cuidado para asegurar un adecuado colocalización de moléculas de NE y solo durante el experimento. También es importante proporcionar una relación señal ruido, sobre todo cuando la señal es baja debido a un etiquetado deficiente o photobleaching. Precisión de localización está limitada por el ruido de fondo (que surge de la fluorescencia fuera de foco, el ruido CCD de lectura, los factores de la corriente oscura y otros).

imagen de una sola molécula de transporte nuclear

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

La utilidad de los enfoques de una sola molécula de microscopía de fluorescencia se ha demostrado ser de una gran disponibilidad en la comprensión de las reacciones biológicas en la última década. La investigación de las interacciones moleculares con alta resolución temporal y espacial profunda dentro de las células se ha mantenido un reto debido a las señales de por sí débil que surgen a partir de moléculas individuales. Obras recientes de Yang et al. demostrado que estrecha el campo de microscopía de epifluorescencia permite la visualización de transporte nucleocytoplasmic en el nivel de una sola molécula. Por el enfoque de una sola molécula, la cinética importantes, como el tiempo de transporte nuclear y la eficiencia, para las moléculas de carga depende de la señal e independientes se han obtenido. Aquí se describe un protocolo para el abordaje metodológico, con una mejor resolución espacio-temporal de 0,4 nm y 12 ms. La resolución mejorada que nos permitió la captura de transporte activo y eventos transitorios pasiva difusión a través de los complejos de poro nuclear (NPC) en semi-células intactas. Esperamos que este método es utilizado en el esclarecimiento de otros eventos de unión y el tráfico dentro de las células.

Microscopía de una sola molécula approch proporcionan nuevos conocimientos sobre el transporte nuclear.

Imagen de una sola molécula de transporte nuclear

Se ha demostrado que la utilidad de los enfoques de microscopía de fluorescencia de molécula única resulta de gran provecho para comprender las reacciones biológicas a lo largo de...

La envoltura nuclear de la célula contiene aproximadamente 2000 complejos de poros nucleares que permiten el transporte de moléculas solubles en agua, como ARN, ribosomas, ciertas proteínas, carbohidratos y moléculas de señalización. Al añadir moléculas de carga marcadas a células permeabilizadas, puede visualizarse el movimiento de moléculas individuales a través del poro nuclear mediante microscopía de fluorescencia. Se requieren imágenes de lapso de tiempo para determinar la localización, así como las características espaciotemporales, como el tiempo de transporte, la eficiencia de importación y exportación, y la frecuencia de entrada. Hola, soy Alex ov, estudiante de doctorado del laboratorio de microscopía de molécula individual del Departamento de Biología de la Universidad Estatal de Bowling Green.Soy Asha P Shema, estudiante de maestría, también del laboratorio de microscopía de molécula individual. Soy Juma, investigador posdoctoral aquí en el laboratorio de microscopía de molécula individual.Hoy les mostraremos un procedimiento de imagen individual de moléculas para el transporte nuclear a través de los complejos PO nucleares en células helo. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la translocación de diversas moléculas a través del complejo PO nuclear. Así que comencemos.Para preparar las proteínas para el experimento de transporte nuclear, transforme convencionalmente JM 1 0 9 E coli que expresan los genes responsables de la producción de las proteínas de carga nuclear, crezca las células en medio LB e induzca con IPTG. Una vez que las células estén en fase logarítmica con una densidad óptica de 0,7 a 0,8, centrifugue el cultivo a 6.000 ×g durante 15 minutos a cuatro grados Celsius, deseche el sobrenadante y pese el botón celular. Luego, resuspenda las células en 10 mililitros de medio Celtic B por gramo para extraer proteínas adecuadas para purificación por afinidad y análisis.A continuación, agregue la cantidad adecuada de cóctel de proteasas en el ADN del entresuela uno y etanol beta-me captado. Agite la mezcla en la oscuridad sobre hielo durante 30 minutos. Luego, centrifugue a 25.000 × g durante 20 minutos a cuatro grados Celsius.Tras la centrifugación, transfiera el sobrenadante a un nuevo frasco en preparación para la cromatografía. Coloque 400 microlitros de NTA de níquel y acetona en cuatro tubos de microcentrífuga. Centrifugue a 16.000 × g durante tres minutos.Deseche el sobrenadante. A continuación, agregue 400 microlitros de tampón de lisis y lavado. Repita los pasos de lavado anteriores tres veces tras el lavado final.Re-suspenda el NTA de níquel en tampón de lisis y agregue los cuatro tubos al frasco que contiene el sobrenadante celular. Agite lentamente la mezcla resultante en un recipiente oscuro sobre hielo durante 60 minutos mientras se agita la mezcla. Prepare una columna cromatográfica de ecno pack envolviéndola en papel de aluminio para evitar el blanqueo por luz de las proteínas fluorescentes.También coloque 12 tubos de recolección en un soporte debajo de la columna. Una vez que la mezcla haya agitado durante 60 minutos, cargue 10 mililitros de la mezcla de níquel NTA de SNA y deje que pase completamente. Comience a recolectar las fracciones.A continuación, agregue 10 mililitros de tampón de lavado de lisis. Deje que pase completamente. Luego agregue 10 mililitros de tampón IZO y deje que pase.Continúe recolectando fracciones. A continuación, pase 0.5 mililitros de tampón de elución y permita que atraviese la columna, repitiendo el paso con tampón de elución hasta haber recolectado las 12 fracciones. Para determinar qué fracción proporciona la mayor concentración de la proteína, corra cuatro microlitros de cada fracción en un gel de PAGE y tiña con azul de Comassie.De acuerdo con los procedimientos estándar, combine las fracciones más concentradas y añada 500 microlitros a un filtro nano step con un tamaño de poro de 10 kilodaltons que haya sido previamente lavado con tampón elucian. Concentre la proteína centrifugando a 16.000 × g durante cinco minutos. Descarte el tampón, agite la fracción proteica restante y añada otros 500 microlitros al filtro de centrifugación.Una vez más, repita para todas las fracciones seleccionadas. A continuación, lleve el volumen final de la proteína concentrada a aproximadamente 50 microlitros con tampón eluyente. Luego, mientras agita suavemente con una micropipeta recolectando desde la superficie del filtro, continúe realizando intercambio iónico y columnas de exclusión por tamaño para obtener una proteína altamente pura y determine la concentración final de proteína.A continuación, marque las moléculas de carga con un colorante orgánico reactivo auxiliar en exceso, como Alexa 555 o Alexa 647 maide. Esto se realiza porque la fluorescencia verde intrínseca de la GFP no puede utilizarse para la imagen individual de moléculas en el transporte nuclear debido a su pobre estabilidad fotográfica y al solapamiento espectral con la autofluorescencia celular. La proteína marcada debe dividirse en varias fracciones de 25 microlitros y almacenarse a menos 80 grados Celsius un día antes de los experimentos. Coloque un cubreobjetos autoclaveado en una placa de Petri estéril de 35 milímetros y agregue mediante pipeta nueve mililitros de DMEM sobre él.A continuación, pipete un mililitro de cultivo celular y dispénselo uniformemente sobre el cubreobjetos en el que las células, previamente modificadas genéticamente para expresar una proteína de membrana pobre marcada con GFP, fueron cultivadas. Incube las placas en un incubador con dióxido de carbono durante 12 horas.El día del experimento, comience preparando las cámaras de flujo. A continuación, retire el portaobjetos recubierto con células del incubador, seque el portaobjetos y luego colóquelo utilizando pegamento de grasa al vacío. En un marco de aluminio fabricado en casa, es esencial asegurarse de que las células no se sequen durante la preparación.Utilizando una jeringa plástica de 10 mililitros, agregue dos líneas de silicona en ambos lados de un cubreobjetos con pinzas. Tome el pequeño cubreobjetos preparado con las dos líneas de silicona aplicadas y colóquelo invertido sobre la portaobjetos recubierto de células, presionando suavemente para formar la cámara de flujo. Si se preparan dos cámaras separadas sobre un mismo portaobjetos recubierto de células, es fundamental asegurar un buen cierre para prevenir la contaminación cruzada.Aplique varias líneas de grasa de silicona entre las cámaras, desde la parte superior hasta la inferior del portaobjetos, para sellarlas separadamente. Asimismo, coloque varias líneas de grasa en los lados externos de las cámaras. Añada DMEM a la cámara de flujo para evitar que las células se sequen.A continuación, utilizando un hisopo con punta de algodón, lave la parte inferior del portaobjetos dos veces con agua y luego dos veces con etanol al 100%. Coloque el portaobjetos en el microscopio. Lave dos veces con 25 microlitros de tampón de transporte, añadiéndolo a la cámara de flujo y retirándolo por capilaridad.Utilizando un pequeño trozo de papel de filtro aplicado al lado de salida, permeabilice las células una vez durante aproximadamente dos minutos con 25 microlitros de digitonina; la permeabilización debe monitorearse en tiempo real utilizando campo brillante. Finalmente, lave las células con 25 microlitros de tampón de transporte, suplementado con 1,5 % de polivinilpirrolidona o PVP para prevenir la hinchazón osmótica de los núcleos. Coloque las células permeabilizadas en el microscopio e identifique un anillo fluorescente verde brillante.Luego, enfoque el ecuador de la célula y capture una imagen antes de agregar moléculas fluorescentes de carga. Elimine cualquier autofluorescencia seleccionando la región del envoltorio nuclear e iluminando con el láser de helio-neón de 633 nanómetros hasta que se haya fotoblanqueado completamente. Por lo general, se requiere más de dos minutos.Agregue la muestra de dextrano marcada diluida en tampón de transporte con 1,5 % de PVP a la cámara de flujo en un volumen de 25 microlitros y hágala circular por la cámara aplicando una mecha de papel de filtro. Se debe tener cuidado al agregar las proteínas de carga de importación y las células permeabilizadas, ya que el enfoque puede interrumpirse fácilmente con cualquier movimiento brusco. Active el obturador óptico a aproximadamente cinco hercios para evitar el fotoblanqueo y permitir que una nueva porción de moléculas individuales no fotoblanqueadas se acerque al envoltorio nuclear.Debe adquirirse una serie de vídeos de la translocación de moléculas individuales tan pronto como se añadan las moléculas de muestra para poder capturar la translocación a través de los complejos de poros nucleares. Utilice el láser de helio-neón de 633 nanómetros para iluminar las trayectorias de transporte de las moléculas translocantes realizadas correctamente. Este protocolo permite la recopilación de una serie de imágenes que demuestran la translocación de moléculas individuales de carga que interactúan con el complejo de poros nucleares.En perme, las células HeLa Pom1 21. Al rastrear las trayectorias espaciales de moléculas individuales de dextrano en tránsito, pueden distinguirse los pasos finos de la difusión a través del envoltorio nuclear. Aquí se muestra un evento de citoplasma a núcleo, en el cual una sola molécula de dextrano, mostrada como un punto rojo, partió del citoplasma, interactuó con el envoltorio nuclear representado como la línea de píxeles verde y terminó en el núcleo.La molécula de dextrano comenzó en el citoplasma, interactuó con el envoltorio nuclear y regresó al citoplasma. En este ejemplo, la molécula de dextrano comenzó en el núcleo, interactuó con el envoltorio nuclear y regresó al núcleo. Y aquí, la molécula de dextrano comenzó en el núcleo, interactuó con el envoltorio nuclear y terminó en el citoplasma.Al rastrear las trayectorias espaciales de moléculas individuales de dextrano transmembranales, pueden distinguirse los pasos finos de la difusión a través de la envoltura nuclear. Las trayectorias del evento mostradas como líneas azules y puntos abiertos fueron determinadas y superpuestas con la envoltura nuclear representada como una línea negra. Las líneas verde y roja representan una distancia de 100 nanómetros desde la envoltura nuclear en el lado citoplasmático y nuclear, respectivamente.Acabamos de mostrarle cómo visualizar la translocación de moléculas individuales a través del complejo del poro nuclear con una resolución de 10 nanómetros a 400 microsegundos. Durante este procedimiento, es importante recordar la necesidad de obtener una relación señal-ruido lo más alta posible y tener mucho cuidado al realizar el experimento de molécula individual, ya que el enfoque puede interrumpirse fácilmente. Eso es todo.Gracias por ver el video y buena suerte con sus experimentos.

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Investigación

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Biología

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