Name: Una delgada del cráneo ventana Técnica para la crónica de dos fotones En vivo Imágenes de la microglía murina en los modelos de la neuroinflamación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Aprende a preparar una ventana de cráneo adelgazado para imaginar microglía murina mediante microscopía de dos fotones transcraneal. Este método permite estudiar la neuroinflamación crónica y la activación microglial en respuesta a la proteína Tat del VIH-1 en modelos in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Damos las gracias a Emily A. Kelly para el diseño de la placa con la cabeza. Estamos muy agradecidos por el apoyo de premios NIH a HAG: PO1 MH64570, RO1 MH56838, RO1 MH078989, R21 MH03851 y el generoso apoyo del Fondo de Geoffrey Waasdorp Neurología Pediátrica, sin la cual este trabajo no habría sido posible. AKM es financiado por el NIH (EY019277), la Fundación de Whitehall, la Alfred P. Sloan Foundation y un premio de su carrera en las ciencias biomédicas del Fondo Burroughs Wellcome. MET es financiado por una Fonds de la recherche en santé du Québec (FRSQ) Premio formación postdoctoral. DFM es un aprendiz en el Programa Científico de formación de médicos, financiado por el NIH T32 GM07356 y AI049815 T32.

1. Preparación de los animales de la Imagen <ol><li> En nuestros experimentos, el uso de adultos CX 3 CR1 ratones GFP / + que expresan GFP en linajes de células mononucleares, incluyendo microglia. 4 cepas diferentes de ratones puede ser utilizado para satisfacer las necesidades de un proyecto específico. </li><li> Anestesiar a los ratones con una inyección intraperitoneal de un cóctel de tres fármacos que consta de 0,05 mg / kg de fentanilo, 5,0 mg / kg de midazolam, y 0,5 medetomidina mg / kg. 5 Preparación quirúrgica para TSCW se inicia después de que el animal ya no responde a estímulos dolorosos, como una pizca de cola. A lo largo de la cirugía y la obtención de imágenes, mantener al animal en una almohadilla de calefacción para evitar la hipotermia post-anestesia. Si es necesario, una dosis de refuerzo de un tercio de la dosis original del cóctel anestésico se puede dar a restaurar el original plano anestésico. </li><li> Cubrir los ojos del animal con un ungüento oftálmico de protección para mantener los ojos húmedos durante la anestesia, que suprime reflejos del animal parpadea. Quitar el pelo del cuero cabelludo de los animales utilizando una navaja de afeitar, tijeras, tijeras, o los métodos químicos. Desinfectar el cuero cabelludo con un 10% de solución de povidona yodada y el 70% de etanol. Todos los instrumentos quirúrgicos deben ser esterilizados en autoclave, esterilizado con un esterilizador de bolas de cristal, o desinfectada con etanol al 70%. </li><li> Hacer una incisión en el cuero cabelludo con unas tijeras pequeñas, a partir de 4-5 mm de caudal en el cráneo y el avance hacia el frente de los ojos. Es importante que esta incisión ser lo suficientemente larga que la piel no va a interferir con el pegado de la placa de la cabeza que se utiliza para estabilizar la cabeza del ratón durante dos fotones magnética (Figura 1). Identificar el área a ser diluido con un microscopio de disección. Evite las áreas de interés directamente ubicado sobre las suturas craneales, como el cráneo es menos estable en estas áreas y los grandes vasos subyacentes y las meninges puede interferir con las imágenes. </li><li> Aplicar el 100% de etanol, seguido de 10% de solución de cloruro férrico con un hisopo de algodón estéril para secar las membranas en la parte superior del cráneo y raspar a la basura con unas pinzas finas o una hoja de afeitar. Si no se retiran los resultados de las membranas en la unión inestable la placa de la cabeza. </li><li> Coloque una capa delgada de la Permabond 910 pegamento alrededor de los bordes de la ventana de visualización por debajo de la placa de cabeza. Coloque la placa de la cabeza recubierta con pegamento sobre el área de interés en el cráneo del animal con una ligera presión (Figura 1). Es importante que la placa de la cabeza sólo está pegada a los huesos del cráneo. Cualquier piel o las membranas que se encuentran atrapados entre la placa de la cabeza y el cráneo disminuye la estabilidad del vínculo. Aplique una pequeña cantidad de acrilato de alrededor de la ventana de visualización con una jeringa al instante de bonos de la cola. Por último, aplique una pequeña cantidad de Loctite 454 a los bordes de la ventana de visualización para evitar fugas. </li><li> Atornille la placa de la cabeza a la titular de los animales (Figura 1) y comprobar la estabilidad de la placa de la cabeza con un alcance de la disección por la ligera sondeo con un par de pinzas. No debe haber movimiento de la cabeza en relación con la placa de la cabeza. Coloque una gota de solución salina en la ventana de visualización para garantizar que no haya fugas. </li></ol> 2. Preparación de la ventana del cráneo Diluido cortical <ol><li> En preparación para el adelgazamiento del cráneo, seca el cráneo usando una combinación de hisopos de algodón estériles y aire comprimido. Inicialmente delgada del cráneo con una broca de estériles IRF 007 en un simulacro de Microtorque II fijó en 4.000 rpm. Muy suavemente, comienza una zona de adelgazamiento mm 2-2.5 diámetro circular del cráneo. Use movimientos de barrido sólo la luz casi paralelo al cráneo, el uso sin presión a la baja directa. Detener la perforación cada 20-30 segundos para eliminar el polvo de hueso con el aire comprimido. Estas interrupciones en la perforación permiten que el cráneo que se enfríe para que no haya daños inducidos por el calor en el tejido cerebral subyacente. <ol class="lalpha"><li> A medida que la perforación avanza, el aviso de la transición a la capa de hueso esponjoso húmedo (es decir, el "diploe"). Una vez que esta capa se llega a tener cuidado extra con el taladro. </li></ol></li><li> De vez en cuando ver la delgadez de la cabeza mediante la colocación de solución salina en el área adelgazada y ver bajo el microscopio de disección. Solución salina también permitirá la disipación del calor. A medida que el cráneo se adelgaza, pequeños vasos se hace visible. </li><li> Use un MicroBlade dental estéril para alcanzar la final de adelgazamiento en solución salina, como el MicroBlade proporciona información mucho más táctil sobre la estabilidad del cráneo. Esto permite una preparación mucho más delgado que con el ejercicio solo. Desde nuestra experiencia, el grosor del cráneo óptima es de 10-30 micras. <ol class="lalpha"><li> Es importante comprobar la delgadez de la calavera bajo epifluorescencia varias veces durante los primeros intentos de hacer una ventana de cráneo fino. La nitidez y la profundidad de la microglia y los vasos visibles dará una buena indicación en cuanto a cuando la ventana está listo para la imagen. </li></ol></li><li> Una vez que la ventana esté listo, pegar un pedazo rectangular de medida de # 0 cubreobjetos wi ª dimensión de menos de 2 mm en cada lado de la ventana. El uso de un 1,0 mm de diámetro pipeta de vidrio, coloque una pequeña gota de pegamento de cianoacrilato en el área del cráneo adelgazado y cuidadosamente más abajo en la pequeña pieza de cubreobjetos, a continuación, presione suavemente contra el cráneo para expulsar el exceso de cantidad de la cola. Es importante evitar la formación de burbujas entre el vidrio y el pegamento ya que el aire atrapado hará que el área por debajo de convertirse ópticamente opaco. El pegamento de cianoacrilato se utiliza debido a que permanece transparente cuando se seca y también evita que los huesos y la regeneración de membrana manteniendo la cabeza debajo de la ventana delgada y traslúcida. Si hay algún tipo de pegamento en la parte superior de la cubierta de vidrio, utilizar el MicroBlade a extráigala con cuidado una vez que el cristal de la cubierta está en su lugar y la cola se seque. </li><li> Un analgésico (por ejemplo, buprenorfina 2 mg / kg por vía subcutánea) se administra inmediatamente después de la cirugía y volver a administrarse a cualquier signo de dolor, incluyendo la renuencia a moverse, comer o beber, pérdida de peso, salivación, piloerección, sonidos respiratorios, etc </li></ol> 3. De dos fotones de imágenes <ol><li> En la preparación de dos fotones de imágenes, cubrir el TSCW con solución salina y localizar el área de interés en epifluorescencia (Figura 2). Para habilitar imagen posterior de la zona, tomar una fotografía con una cámara fotográfica. </li><li> De dos fotones de imágenes, se utiliza una medida de dos fotones con un microscopio 6 Ti: Sapphire láser sintonizado a 920 nm. La fluorescencia es detectada mediante el uso de un tubo fotomultiplicador en el modo de detección de todo el campo y un filtro de emisión de 580/180. 20 veces el lente de inmersión en agua (0,95 NA) se utiliza a lo largo de la sesión de imágenes. La potencia máxima de la potencia del láser en el objetivo se encuentra entre 50 y 65 mW. </li><li> Seleccione un área de interés en las capas corticales I y II (hasta 150 m por debajo de la superficie pial). Para facilitar la re-imagen, tomar fotografías de un mismo campo de visión a 1X, 2X, 3X y zoom digital. Los vasos sanguíneos pueden servir como puntos de referencia para encontrar fácilmente el mismo campo de visión durante las sesiones de formación de imágenes posteriores. En virtud de un zoom de 3X, varios z-series con 80-90 Z-pasos en cada pila y un paso m 0,69 se puede adquirir cada 5 minutos durante 30 minutos, lo que permite una buena muestra de la morfología de la microglia y comportamiento en el tiempo ( Figura 3). Entre las adquisiciones de z-pilas, se debe verificar el nivel de solución salina en los TSCW, así como la profundidad de los animales de la anestesia. </li></ol> 4. La inyección de la neurotoxina del VIH-1, Tat <ol><li> En primer lugar, silanizar el revestimiento interior de una aguja de calibre 35 y 10 l jeringa microvolumen para prevenir la deposición Tat. Retirar la solución silanización (Sigmacote) hasta que se llene la aguja y la jeringa. Permita que la solución reposar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Vaciar la solución de la jeringa, retire el émbolo y permita que la jeringa y la aguja se seque por completo. Por último, lavar la jeringa y la aguja a fondo con agua destilada. </li><li> Realizar una craneotomía pequeño de 0,5 mm de diámetro o 3 mm rostral y lateral a la TSCW donde dos fotones imágenes se han obtenido, con una broca pequeña y cuidadosamente adelgazamiento del cráneo, hasta un par de pinzas con puntas afiladas pueden eliminar la capa diluida de los huesos con facilidad. Nosotros usamos una jeringa de 10 l microvolumen equipado con aguja de calibre 35 controlado por una bomba de jeringa Ultramicropump III montado en un micromanipulador de 3 ejes y después de alinear la punta de la aguja de la craneotomía, es cuidado a una profundidad de 700 a 900 micras por debajo de la superficie pial en 3 l Tat 1-72 (u otros agentes pro-inflamatorios) o solución salina (o de control del vehículo) se entrega el 80 nL / min. </li></ol> 5. Animal de Vivienda <ol><li> Si el animal va a ser fotografiada varias veces en un solo día, cubrir el área abierta del cráneo con una mezcla de ungüento oftálmico y vaselina para evitar molestias o daños en el cráneo entre las sesiones de formación de imágenes. Desconecte el puente de apoyo de la pequeña cabeza de la placa (ver Figura 1 B) y colocar el animal en una jaula con comida caliente y agua de fácil acceso. Todos los animales deben ser alojados individualmente después de la cirugía en todo momento. Una vez que las sesiones de formación de imágenes de un animal están completos para un día determinado, retire con cuidado toda la cabeza de la placa y la sutura de la piel sobre el cráneo por el n º 6 o menos de sutura. Una vez más, la casa de los animales por separado con los alimentos de fácil acceso y el agua entre los días experimentales. Compruebe los animales diariamente para detectar cualquier signo de estrés, dolor o infección. </li></ol> 6. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Estabilización de animales para la cirugía y de dos fotones magnética (A) y el diseño de la placa de la cabeza (B). <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. GFP-etiquetados microglia visualiza con epifluorescencia. jove_content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. GFP-etiquetados microglia visualiza con dos fotones de imagen después de la implantación de la TSCW, a unos 50 m por debajo de la superficie pial. El single de dos fotones secciones tomadas de 15-30 minutos después de la implantación de la TSCW (día 0), así como 7 y 17 días después, demuestran que las ventanas se mantiene claro, mientras que la microglía permanecer inactiva en ausencia de insultos inflamatoria. El z-proyecciones tomadas 6 y 24 horas post-inyección de la neurotoxina del VIH tat impresionante exposición cambios morfológicos de la microglía activada. Barra de escala: 10 micras.

<ol><li>Mostany, R., &amp, P. ortera-C. ailliau, C, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J Vis Exp. 12, (2008).</li>
<li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4, (2009).</li>
<li>Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature Protoc. 5, 213-21 (2010).</li>
<li>Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+fractalkine+receptor+CX%283%29CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol Cell Biol. 20, 4106-41 (2000).</li>
<li>Mrsic-Flogel, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+regulation+of+eye-specific+responses+in+visual+cortex+during+ocular+dominance+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity.</a> Neuron. 54, 961-96 (2007).</li>
<li>Majewska, A., Yiu, G., &amp, Y. uste, R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+custom-made+two-photon+microscope+and+deconvolution+system%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">A custom-made two-photon microscope and deconvolution system.</a> Pflugers Arch. 441, 2-3 (2000).</li>
<li>Sharer, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+of+HIV-1+infection+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22A+review.+J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pathology of HIV-1 infection of the central nervous system.</a> A review. J Neuropathol Exp Neurol. 51, (1992).</li>
<li>Everall, I. P., Aliberti, J., &amp, B. alcerzyk, M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+density+in+the+superior+frontal+and+temporal+gyri+does+not+correlate+with+the+degree+of+human+immunodeficiency+virus-associated+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+%28Berl%22%5BJournal%5D)">Neuronal density in the superior frontal and temporal gyri does not correlate with the degree of human immunodeficiency virus-associated dementia.</a> Acta Neuropathol (Berl. 88, 538-53 (1994).</li>
<li>Masliah, E., Banati, R. B., &amp, Q. uinlan, M, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+injury+is+a+pathological+substrate+for+human+immunodeficiency+virus-related+cognitive+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Dendritic injury is a pathological substrate for human immunodeficiency virus-related cognitive disorders.</a> Ann Neurol. 42, 963-96 (1997).</li>
<li>Everall, I. P., Banati, R. B., &amp, U. pender, B, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+synaptic+density+is+reduced+in+mild+to+moderate+human+immunodeficiency+virus+neurocognitive+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cortical synaptic density is reduced in mild to moderate human immunodeficiency virus neurocognitive disorder.</a> Brain Pathol. 9, (1999).</li>
<li>Glass, J. D., Fedor, H., Wesselingh, S. L., &amp, M. cA. rthur, C, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+in+the+brain%3A+correlations+with+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical quantitation of human immunodeficiency virus in the brain: correlations with dementia.</a> Ann Neurol. 38, (1995).</li>
<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, (2000).</li>
</ol>

Existe un creciente consenso de que el sustrato real para el VIH-1 déficits neurocognitivos asociados (mano) es la destrucción de la arquitectura sináptica, presumiblemente causada por mediadores pro-inflamatorios liberados por el VIH-1 fagocitos mononucleares infectadas. Activación de la microglia, células gigantes multinucleadas, y gliosis debido a la hipertrofia astrocíticos se consideran características no específicas del VIH-1 infección y la inflamación en el sistema nervioso central 7. Por el contrario, la gravedad de la pre-mortem, la enfermedad neurológica se ha relacionado con pérdida de la complejidad sináptica, así como la carga de macrófagos en el sistema nervioso central 8,9,10,11. Sin embargo, la interacción dinámica entre la microglía, periféricos macrófagos infiltrantes, y de las neuronas en pacientes con la mano, simplemente no puede ser modelado utilizando procesos convencionales estáticos obtenidos de estudios convencionales de inmunohistoquímica. Estudios recientes de nuestro laboratorio han sugerido que al menos algunas de estas interacciones entre las células mononucleares periféricas y centrales y de las neuronas puede ser modelada en parte por la inyección estereotáxica de la epidemia del VIH-1 proteína Tat 1-72 en el parénquima cerebral (Lu, Marker, Tremblay, Qi, y Gelbard, datos no publicados). Por lo tanto, decidió aplicar en vivo imágenes de dos fotones para examinar la interacción entre los macrófagos derivados de monocitos, microglia residente del cerebro y las neuronas, en un modelo animal manejable pequeño para neuroSIDA. Mientras que las preparaciones abierta de cráneo o adelgazado cráneo-pagar un único examen de la arquitectura cortical por un breve período de tiempo (horas), los investigadores interesados ​​en el curso temporal de los eventos subaguda no puede utilizar estos preparados sin artefacto activar microglia / macrófagos debido a la manipulación quirúrgica de la ventana de la bóveda craneal. Aquí se demuestra de una manera simple de evitar estas limitaciones, pegando un pequeño trozo de cubreobjetos de cristal sobre el área del cráneo adelgazado la prevención de la bóveda craneal de la regeneración en el TSCW, así como el mantenimiento de la translucidez de ≥ 3 semanas. Además, demuestran que esta técnica nos permite monitorear el comportamiento de los monocitos periféricos de entrar en la microvasculatura cerebral, así como la microglía del cerebro reside en respuesta a la inyección estereotáxica de VIH Tat 1-72 en la corteza de ratones heterocigotos para CX 3 CR 1 / GFP ( para identificar las células mononucleares de linaje). Esta técnica se puede adaptar fácilmente para su uso en ratones con diferentes fondos genéticos, por ejemplo, nosotros usamos heterocigotos CX 3 CR 1 / GFP X Thy-1 YFP 12 ratones para investigar las interacciones entre los derivados de los monocitos macrófagos, microglia residente cerebro y las neuronas en en modelos in vivo de la neuroinflamación relevantes a mano. Nuestra preparación TSCW permite a los investigadores para estudiar interacciones célula-célula entre la periferia y sistema nervioso central que pueden ocurrir en períodos de semanas, en la que puede ser el animal repetidamente la imagen antes y después del tratamiento experimental. Por lo tanto, cada animal puede servir como su propio control. Una advertencia para este modelo TSCW es que las células diana objeto de la investigación deben ser modificados genéticamente para expresar mejor las proteínas fluorescentes (eXFP) o tener una etiqueta con un tinte fluorescente, sin violación mecánica de la bóveda craneal, y que la expresión eXFP debe ser lo suficientemente robusta como para permitir que la arquitectura celular que se visualizan después de las sesiones de imágenes repetidas durante un período de semanas.

<table><tbody><tr><td>Citrato de fentanilo</td><td>Hospira Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de midazolam</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de medetomidina (Domitor)</td><td>Pfizer Pharma GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Almohadillas térmicas</td><td>Beyond Bodi Heat</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pomada oftálmica de tobramicina y dexametasona (TobraDex)</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de povidona-yodo al 10%</td><td>Betadine Puredue Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de cloruro férrico al 10%</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3120-32</td><td></td></tr><tr><td>Metil cianoacrilato 910</td><td>Permabond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cianoacrilato 454</td><td>Loctite</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Material para dentaduras TEETS con metacrilato de metilo reticulante</td><td>Co-Oral-lte Dental Mfg CO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de pieza de mano Microtorque II</td><td>Pearson Assessments</td><td>R14-0002</td><td></td></tr><tr><td>Brocas IRF 007</td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-07</td><td></td></tr><tr><td>Microhoja flexible Norland de radio completo</td><td>Salvin Dental</td><td>BLAD-NORLAND-69</td><td></td></tr><tr><td>Cianoacrilato</td><td>The Original Superglue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio #0</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63750-01</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de volumen microlitro de 10 &amp;mu;l</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>ILS010LT</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicroPump III</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>UMP3-1</td><td></td></tr><tr><td>Aguja NanoFil de calibre 35</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>NL35BL-2</td><td></td></tr><tr><td>Molinillo de bolas, brocas de carburo #1/4</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501860</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-100</td><td></td></tr><tr><td>Tubo fotomultiplicador</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>HC125-02</td><td></td></tr><tr><td>Láser de Ti:Zafiro Mai-Tai</td><td>Newport Corp.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

una delgada del cráneo ventana técnica para la crónica de dos fotones en vivo imágenes de la microglía murina en los modelos de la neuroinflamación

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Tradicionalmente, en la neurociencia, en vivo imágenes de dos fotones de la murino sistema nervioso central o bien implicó el uso de 1,2 abierto el cráneo o calavera adelgazado tres preparaciones. Mientras que la técnica del cráneo abierto es muy versátil, no es el óptimo para el estudio de la microglía, ya que es invasivo y puede causar la activación de la microglia. Aunque el enfoque adelgazado-cráneo es mínimamente invasiva, los repetidos re-adelgazamiento de cráneo requiere para obtener imágenes de crónica aumenta el riesgo de lesión de los tejidos y la activación de la microglia y permite un número limitado de sesiones de la imagen. Aquí les presentamos una crónica delgada del cráneo método de la ventana de control microglia murina in vivo durante un período prolongado de tiempo, usando la microscopía de dos fotones. Demostramos cómo preparar una estable y accesible, adelgazada-cráneo ventana cortical (TSCW) con un cubreobjetos se ponga de lo que queda transparente a lo largo de tres semanas de observación intermitente. Esta preparación es mucho más TSCW inmunológicamente inerte con respecto a la activación de la microglia que craneotomía abierta o el cráneo repetidas adelgazamiento y permite un número arbitrario de sesiones de imágenes durante un período de semanas. Preparamos TSCW en CX 3 CR1 GFP / + ratones de 4 a visualizar microglia con aumento de proteína verde fluorescente para ≤ 150 m bajo la superficie pial. También mostramos que esta preparación se puede utilizar en combinación con inyecciones cerebrales estereotáctica de la proteína Tat del VIH-1 neurotóxicos, al lado del TSCW, que es capaz de inducir microgliosis duradero. Por lo tanto, este método es muy útil para examinar los cambios en la morfología y motilidad de la microglia en el tiempo en el cerebro que viven en los modelos de trastorno neurocognitivo asociado VIH (mano) y otras enfermedades neurodegenerativas con un componente neuroinflamatorios.

Se describe un método para visualizar repetidamente microglia murina y los monocitos circulantes<em&gt; In vivo</em&gt; Más de horas, días o semanas con transcraneal microscopia de dos fotones. Demostramos cómo preparar una ventana adelgazado-cráneo que permite la observación de la microglía en reposo intermitente que puede ser activada por inyección estereotáxica adyacentes del Tat del VIH-1 proteína reguladora.

Una delgada del cráneo ventana Técnica para la crónica de dos fotones En vivo Imágenes de la microglía murina en los modelos de la neuroinflamación

Tradicionalmente, en neurociencia, las imágenes de dos fotones in vivo del sistema nervioso central murino han implicado el uso de cráneo abierto1,2 o...

En pacientes adultos infectados con VIH, la neuroinflamación interfiere con la señalización sináptica normal, lo que provoca déficits neurocognitivos que incluyen dificultades con la abstracción, la fluidez verbal, la atención, el aprendizaje de información nueva y la memoria. La proteína Tat del VIH induce la secreción de moléculas inflamatorias, que pueden imitar la disfunción sináptica observada en pacientes con VIH. Se utilizan ratones adultos que expresan GFP en células mononucleares, incluidas las microglías, para investigar la neuroinflamación inducida por la proteína Tat del VIH mediante microscopía de dos fotones con cráneo delgado.Las respuestas de las microglías tras la inyección de tat pueden visualizarse in vivo. Las imágenes resultantes muestran acortamiento y engrosamiento de los procesos microgliales y la formación de estructuras similares a copas fagocíticas, así como el tráfico de monocitos periféricos en microvasos cerebrales. Hola, soy Dan Marker del laboratorio de Harris Galbard y del Centro para el Desarrollo Neural y las Enfermedades en la Universidad de Rochester.Hola, soy EF Trombley del Laboratorio de Esca en el Departamento de Neurobiología y Anatomía de la Universidad de Rochester. Hola, soy Shain Luu, también del Laboratorio Albas. Hoy les mostraremos un procedimiento para la imagenología de dos fotones utilizando una preparación de cráneo delgado.Utilizamos este procedimiento para estudiar la neuroinflamación crónica. Comencemos entonces con el experimento que se muestra aquí. Se utilizan OT que expresan GFP en linajes de células mononucleares, incluidas las microglías.Pueden utilizarse diferentes cepas de ratones para satisfacer las necesidades de un proyecto específico. Comience a preparar un ratón anestesiado con una mezcla de fentanilo y midazolam para la cirugía. En primer lugar, asegúrese de que el animal ya no responda a estímulos dolorosos, como un pellizco en la cola.Coloque el animal sobre una almohadilla térmica para prevenir la hipotermia postanestésica. Luego, cubra los ojos del animal con una pomada oftálmica protectora para mantenerlos húmedos. Todos los instrumentos quirúrgicos deben haber sido autoclavados o esterilizados con un esterilizador de perlas de vidrio; desinfecte además los instrumentos sumergiéndolos en etanol al 70%.Con tijeras, retire el pelo del cuero cabelludo del animal, luego desinfecte el área utilizando una solución de yodo-povidona al 10 % y etanol al 70 %. Comience la cirugía usando tijeras pequeñas para realizar una incisión media en el cuero cabelludo, comenzando cuatro a cinco milímetros caudal al cráneo y avanzando hacia delante hasta la parte frontal de los ojos. Esta incisión debe ser lo suficientemente larga para que la piel no interfiera con la fijación con adhesivo de la placa que estabiliza la cabeza del ratón durante la imagenología de dos fotones.A continuación, aplique etanol al 100 % al hisopo estéril para secar las membranas en la parte superior del cráneo. Retírelas utilizando pinzas finas. Si no se eliminan las membranas, la fijación de la placa craneal será inestable.Bajo un microscopio estereoscópico, identifique el área que se va a adelgazar. Evite las áreas de interés ubicadas directamente sobre las suturas craneales, ya que el cráneo es menos estable en estas regiones y los vasos sanguíneos grandes y las meninges subyacentes interferirán con la imagen enviada a la ventana de visualización del área de interés. Luego, nuevamente con un hisopo de algodón, pruebe el cráneo utilizando una solución al 10% de cloruro férrico.Coloque una capa delgada del pegamento perma bond, nueve 10, alrededor de los bordes de la ventana de observación debajo de la placa craneal. Luego coloque la placa sobre el área de interés en el cráneo del animal con una ligera presión para fijar el pegamento. Aplique una pequeña cantidad de acrílico alrededor del borde de la ventana de observación utilizando una jeringa.Finalmente, aplique una pequeña cantidad de Tite 4 54 a los bordes de la ventana de observación para prevenir fugas. Atornille la placa craneal al soporte del animal y verifique la estabilidad bajo un microscopio estereoscópico; al tocar ligeramente con un par de pinzas, no debe haber movimiento del cráneo en relación con la placa craneal.Coloque una gota de solución salina en la ventana de observación para asegurarse de que no haya fugas antes del adelgazamiento. Seque el cráneo utilizando una combinación de hisopos estériles y aire comprimido. Adelgace el cráneo usando una broca IRF 0 0 7 en un microtaladro.A 4.000 RPM. Comience muy suavemente a adelgazar un área circular de dos a 2,5 milímetros de diámetro. Utilice únicamente movimientos ligeros de barrido, casi paralelos al cráneo.No utilice presión directa hacia abajo. Detenga la perforación cada 20 a 30 segundos para eliminar el polvo óseo utilizando aire comprimido. Estas pausas durante la perforación permiten que el cráneo se enfríe, evitando daños por calor en el tejido cerebral subyacente.A medida que avanza la perforación, observe la transición hacia la capa ósea más húmeda y espinosa denominada Diplo. Una vez alcanzada esta capa, tenga especial cuidado con la perforadora. Verifique ocasionalmente el grosor del cráneo colocando solución salina sobre la zona delgada y observando bajo el microscopio estereoscópico.La solución salina facilitará aún más la disipación del calor. A medida que el cráneo se adelgaza, se hacen visibles los vasos sanguíneos más pequeños. Utilice una microhoja dental para lograr el adelgazamiento final bajo solución salina.La microhoja proporciona una retroalimentación táctil mucho mayor sobre la estabilidad del cráneo. Esto permite preparaciones mucho más delgadas que con el torno por sí solo. El grosor óptimo del cráneo para la obtención de imágenes es de 10 a 30 micrómetros.Todo el proceso de adelgazamiento normalmente tarda entre 15 y 30 minutos. Verifique varias veces el grosor del cráneo bajo fluorescencia epiluminiscencia mientras realiza una ventana craneal delgada. La nitidez y la profundidad de las microglías y la vasculatura visibles indican adecuadamente cuándo la ventana está lista para la adquisición de imágenes.Una vez que la ventana esté lista, utilice una pipeta de vidrio de un milímetro de diámetro para colocar una pequeña gota de pegamento acrílico Cy sobre la zona del cráneo delgada y baje cuidadosamente un trozo de cubreobjetos sobre ella. Luego, presione suavemente contra el cráneo para expulsar cualquier exceso de pegamento, evitando la formación de burbujas entre este y el cubreobjetos, ya que podrían obstruir la vista. Una vez seco, use una microhoja para retirar cuidadosamente cualquier pegamento que quede encima del cubreobjetos, en preparación para la imagenología de dos fotones.Cubra la ventana cortical de cráneo delgado con solución salina y localice el área de interés bajo fluorescencia epi. Para permitir la obtención de imágenes posterior del área, tome una fotografía utilizando una cámara fotográfica para imágenes. Aquí se muestra el uso de un microscopio personalizado de dos fotones con un láser de ti-safiro sintonizado a 920 nanómetros.La fluorescencia se detecta utilizando un tubo fotomultiplicador o PMT en modo de detección de campo completo y un filtro de emisión de 5 81 80. Se utiliza una lente de inmersión en agua de 20x durante toda la sesión de adquisición de imágenes. Establezca la potencia máxima del láser del objetivo entre 50 y 65 milivatios.A continuación, seleccione un área de interés, ya sea la capa cortical uno o dos hasta 150 micrómetros por debajo de la superficie de la cáscara. Para facilitar la reimagen, tome fotografías del mismo campo de visión con un aumento digital de uno x, dos x y tres x. Los vasos sanguíneos pueden servir como puntos de referencia para localizar fácilmente el mismo campo de visión durante sesiones posteriores de imagen.Con un aumento de tres x, adquiera múltiples Zacks con 80 a 90 pasos Z cada uno y un paso de 0,69 micrómetros cada cinco minutos durante hasta 30 minutos. Esto permite un buen muestreo de la morfología y el comportamiento de las microglías a lo largo del tiempo entre las adquisiciones de Zacks; verifique el nivel de salino y la profundidad de la anestesia. Si es necesario, se puede administrar una dosis de refuerzo de un tercio de la dosis original del cóctel anestésico durante el procedimiento para prevenir la deposición de tat en la jeringa y la aguja durante los días previos a la inyección.Siliconizó el revestimiento interno de una aguja de calibre 35 y de una jeringa de volumen micro de 10 microlitros retirando la solución de acondicionamiento hasta que llenó tanto la aguja como la jeringa. Deje que la solución repose durante cinco minutos a temperatura ambiente, luego vacíe la solución de la jeringa, retire el émbolo y permita que la jeringa y la aguja se sequen completamente. Finalmente, lave la jeringa y la aguja cuidadosamente con agua desionizada.Una vez silanizado, una jeringa y una aguja pueden utilizarse durante más de seis meses antes de que sea necesario un nuevo silanizado. En el día de la inyección, coloque una pequeña gota de la solución de TAT sobre un portaobjetos de vidrio silanizado. Utilizando una punta de pipeta silanizada, cargue la cantidad deseada de solución en la jeringa de volumen micro a partir de esta gota.Utilizando una broca, realice una craneotomía pequeña de 0,5 milímetros de diámetro, tres milímetros hacia la región rostral o lateral respecto a la ventana cortical de cráneo delgado donde se han obtenido imágenes de dos fotones. Para lograrlo, adelgace cuidadosamente el cráneo. Luego, use un par de pinzas afiladas para retirar la capa delgada de hueso.Utilice un micromanipulador para alinear la aguja calibrada de 35 y la jeringa con la craneotomía. Luego, avance cuidadosamente la aguja hasta una profundidad de 700 a 900 micrómetros por debajo de la superficie de la lámina. Administre tres microlitros a 80 nanolitros por minuto utilizando una bomba de jeringa controlada por microprocesador.Esta figura muestra microglía marcada con GFP visualizada mediante imágenes de dos fotones tras el implante de la ventana cortical de cráneo delgado, aproximadamente a 50 micrómetros por debajo de la superficie de la capa. Las secciones individuales de dos fotones obtenidas el día cero, entre 15 y 30 minutos después del implante de la ventana cortical de cráneo delgado, así como las obtenidas siete y 17 días después, demuestran que las ventanas permanecen transparentes mientras la microglía sigue activada en ausencia de agresiones inflamatorias. Esto resalta la utilidad de este método para investigar tanto las interacciones normales como inflamatorias entre células inmunitarias efectoras y otros tipos celulares neuronales.In vivo, las proyecciones Z tomadas a las seis y 24 horas posteriores a la inyección de la neurotoxina del VIH, TAT, muestran cambios morfológicos evidentes de microglía activada. Esto demuestra aún más nuestra capacidad para estudiar en tiempo real los cambios morfológicos de la microglía en modelos agudos y crónicos de neuroinflamación. Acaban de ver cómo preparar una ventana de cráneo delgado y utilizarla para estudiar la neuroinflamación al realizar este procedimiento.Es importante recordar que debe tomarse su tiempo al manipular el cráneo para prevenir cualquier daño causado por la preparación misma. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

a-thin-skull-window-technique-for-chronic-two-photon-vivo-imaging

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

En este material de vídeo y complementaria, se muestra un protocolo para la...

Imagen crónica de la corteza visual del ratón usando una preparación de Diluido-cráneo

Se presenta un método para formar una ventana de imagen en el cráneo del ratón que se extiende milímetros y es estable durante meses sin inflamación del cerebro. Este método es muy adecuado para estudios longitudinales de flujo de sangre, la dinámica celular, y células / estructura vascular utilizando microscopía de dos fotones.

Un pulido y reforzado Diluido cráneo-Ventana para a largo plazo de imágenes del cerebro de ratón

Fuente: Bisht, K., et al. Mapeo cerebral preciso para realizar imágenes repetitivas in vivo de la dinámica neuroinmune en ratones. J. Vis. Exp. (2020)Este video demuestra imágenes de fluorescencia de la dinámica neuroinmune en un ratón transgénico con un implante de cráneo. La estabilidad vascular y neuronal se visualiza junto con los cambios dinámicos de la microglía, lo que refleja las respuestas inmunitarias a la actividad neuronal.

Imágenes de fluorescencia de la dinámica neuroinmune mediante un implante de cráneo

Fuente: Maruoka, H., et. al. Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos. J. Vis. Exp.  (2022) Este video muestra un procedimiento de microscopía de dos fotones para obtener imágenes de la actividad neuronal y la dinámica microglial en un ratón despierto durante la estimulación visual, destacando los transitorios de calcio y las interacciones celulares.

Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en un ratón despierto

Fuente: Kamei, R., et. al., Imágenes crónicas de dos fotones in vivo de la microglía en el hipocampo del ratón. J. Vis. Exp. (2022)El video demuestra la configuración y el proceso de obtención de imágenes para la microscopía de dos fotones in vivo de la dinámica microglial en el hipocampo CA1 (Cornu ammonis 1) y la circunvolución dentada, lo que garantiza una alineación óptica óptima y una evaluación de la integridad estructural.

Imágenes in vivo de dos fotones de la dinámica microglial en el hipocampo del ratón

Trauma cerebral aguda es una lesión grave que no tiene un tratamiento adecuado hasta la fecha. Multiphoton microscopía permite estudiar longitudinalmente el proceso de desarrollo trauma cerebral agudo y en la exploración de estrategias terapéuticas en los roedores. Dos modelos de trauma cerebral agudo estudiado con imágenes in vivo de dos fotones de cerebro se demuestran en este protocolo.

Trauma cerebral aguda en ratones seguido de Longitudinal dos fotones de imágenes

Este protocolo describe una técnica crónica de implantación de ventanas craneales que se puede utilizar para imágenes longitudinales de estructuras neuro-glio-vasculares, interacciones y función en condiciones saludables y enfermas. Sirve como una alternativa complementaria al enfoque de imagen transcraneal que, aunque a menudo se prefiere, posee algunas limitaciones críticas.

Mapeo cerebral preciso para realizar imágenes in vivo repetitivas de dinámica neuroinmunitaria en ratones

Aquí se presenta un protocolo para la implantación de una ventana craneal crónica para la obtención de imágenes longitudinales de células cerebrales en ratones despiertos y con la cabeza restringida.

Implantación de una ventana craneal para imágenes repetidas in vivo en ratones despiertos

Este artículo describe un método para la observación crónica in vivo de la microglía en reposo en el hipocampo de ratón CA1 utilizando cirugía controlada con precisión y microscopía de dos fotones.

In vivo Imágenes crónicas de dos fotones de microglia en el hipocampo del ratón

Aquí, describimos un protocolo que combina la inyección de virus adenoasociados con la implantación de ventana craneal para obtener imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos.

Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos

Este estudio demuestra la administración de una lesión cerebral traumática repetitiva a ratones y la implantación simultánea de una ventana craneal para la posterior obtención de imágenes intravitales de un EGFP expresado por neuronas mediante microscopía de dos fotones.

Imágenes intravitales de la expresión de proteínas fluorescentes en ratones con una lesión cerebral traumática de cráneo cerrado y ventana craneal utilizando un microscopio de dos fotones

Aprende a preparar una ventana de cráneo adelgazado para imaginar microglía murina mediante microscopía de dos fotones transcraneal. Este método permite estudiar la neuroinflamación crónica y la activación microglial en respuesta a la proteína Tat del VIH-1 en modelos in vivo.

Una delgada del cráneo ventana Técnica para la crónica de dos fotones En vivo Imágenes de la microglía murina en los modelos de la neuroinflamación (Video) | JoVE Journal

Una delgada del cráneo ventana Técnica para la crónica de dos fotones En vivo Imágenes de la microglía murina en los modelos de la neuroinflamación

Explorar más videos