Una delgada del cráneo ventana Técnica para la crónica de dos fotones En vivo Imágenes de la microglía murina en los modelos de la neuroinflamación

En pacientes adultos infectados con VIH, la neuroinflamación interfiere con la señalización sináptica normal, lo que provoca déficits neurocognitivos que incluyen dificultades con la abstracción, la fluidez verbal, la atención, el aprendizaje de información nueva y la memoria. La proteína Tat del VIH induce la secreción de moléculas inflamatorias, que pueden imitar la disfunción sináptica observada en pacientes con VIH. Se utilizan ratones adultos que expresan GFP en células mononucleares, incluidas las microglías, para investigar la neuroinflamación inducida por la proteína Tat del VIH mediante microscopía de dos fotones con cráneo delgado.

Las respuestas de las microglías tras la inyección de tat pueden visualizarse in vivo. Las imágenes resultantes muestran acortamiento y engrosamiento de los procesos microgliales y la formación de estructuras similares a copas fagocíticas, así como el tráfico de monocitos periféricos en microvasos cerebrales. Hola, soy Dan Marker del laboratorio de Harris Galbard y del Centro para el Desarrollo Neural y las Enfermedades en la Universidad de Rochester.

Hola, soy EF Trombley del Laboratorio de Esca en el Departamento de Neurobiología y Anatomía de la Universidad de Rochester. Hola, soy Shain Luu, también del Laboratorio Albas. Hoy les mostraremos un procedimiento para la imagenología de dos fotones utilizando una preparación de cráneo delgado.

Utilizamos este procedimiento para estudiar la neuroinflamación crónica. Comencemos entonces con el experimento que se muestra aquí. Se utilizan OT que expresan GFP en linajes de células mononucleares, incluidas las microglías.

Pueden utilizarse diferentes cepas de ratones para satisfacer las necesidades de un proyecto específico. Comience a preparar un ratón anestesiado con una mezcla de fentanilo y midazolam para la cirugía. En primer lugar, asegúrese de que el animal ya no responda a estímulos dolorosos, como un pellizco en la cola.

Coloque el animal sobre una almohadilla térmica para prevenir la hipotermia postanestésica. Luego, cubra los ojos del animal con una pomada oftálmica protectora para mantenerlos húmedos. Todos los instrumentos quirúrgicos deben haber sido autoclavados o esterilizados con un esterilizador de perlas de vidrio; desinfecte además los instrumentos sumergiéndolos en etanol al 70%.

Con tijeras, retire el pelo del cuero cabelludo del animal, luego desinfecte el área utilizando una solución de yodo-povidona al 10 % y etanol al 70 %. Comience la cirugía usando tijeras pequeñas para realizar una incisión media en el cuero cabelludo, comenzando cuatro a cinco milímetros caudal al cráneo y avanzando hacia delante hasta la parte frontal de los ojos. Esta incisión debe ser lo suficientemente larga para que la piel no interfiera con la fijación con adhesivo de la placa que estabiliza la cabeza del ratón durante la imagenología de dos fotones.

A continuación, aplique etanol al 100 % al hisopo estéril para secar las membranas en la parte superior del cráneo. Retírelas utilizando pinzas finas. Si no se eliminan las membranas, la fijación de la placa craneal será inestable.

Bajo un microscopio estereoscópico, identifique el área que se va a adelgazar. Evite las áreas de interés ubicadas directamente sobre las suturas craneales, ya que el cráneo es menos estable en estas regiones y los vasos sanguíneos grandes y las meninges subyacentes interferirán con la imagen enviada a la ventana de visualización del área de interés. Luego, nuevamente con un hisopo de algodón, pruebe el cráneo utilizando una solución al 10% de cloruro férrico.

Coloque una capa delgada del pegamento perma bond, nueve 10, alrededor de los bordes de la ventana de observación debajo de la placa craneal. Luego coloque la placa sobre el área de interés en el cráneo del animal con una ligera presión para fijar el pegamento. Aplique una pequeña cantidad de acrílico alrededor del borde de la ventana de observación utilizando una jeringa.

Finalmente, aplique una pequeña cantidad de Tite 4 54 a los bordes de la ventana de observación para prevenir fugas. Atornille la placa craneal al soporte del animal y verifique la estabilidad bajo un microscopio estereoscópico; al tocar ligeramente con un par de pinzas, no debe haber movimiento del cráneo en relación con la placa craneal.

Coloque una gota de solución salina en la ventana de observación para asegurarse de que no haya fugas antes del adelgazamiento. Seque el cráneo utilizando una combinación de hisopos estériles y aire comprimido. Adelgace el cráneo usando una broca IRF 0 0 7 en un microtaladro.

A 4.000 RPM. Comience muy suavemente a adelgazar un área circular de dos a 2,5 milímetros de diámetro. Utilice únicamente movimientos ligeros de barrido, casi paralelos al cráneo.

No utilice presión directa hacia abajo. Detenga la perforación cada 20 a 30 segundos para eliminar el polvo óseo utilizando aire comprimido. Estas pausas durante la perforación permiten que el cráneo se enfríe, evitando daños por calor en el tejido cerebral subyacente.

A medida que avanza la perforación, observe la transición hacia la capa ósea más húmeda y espinosa denominada Diplo. Una vez alcanzada esta capa, tenga especial cuidado con la perforadora. Verifique ocasionalmente el grosor del cráneo colocando solución salina sobre la zona delgada y observando bajo el microscopio estereoscópico.

La solución salina facilitará aún más la disipación del calor. A medida que el cráneo se adelgaza, se hacen visibles los vasos sanguíneos más pequeños. Utilice una microhoja dental para lograr el adelgazamiento final bajo solución salina.

La microhoja proporciona una retroalimentación táctil mucho mayor sobre la estabilidad del cráneo. Esto permite preparaciones mucho más delgadas que con el torno por sí solo. El grosor óptimo del cráneo para la obtención de imágenes es de 10 a 30 micrómetros.

Todo el proceso de adelgazamiento normalmente tarda entre 15 y 30 minutos. Verifique varias veces el grosor del cráneo bajo fluorescencia epiluminiscencia mientras realiza una ventana craneal delgada. La nitidez y la profundidad de las microglías y la vasculatura visibles indican adecuadamente cuándo la ventana está lista para la adquisición de imágenes.

Una vez que la ventana esté lista, utilice una pipeta de vidrio de un milímetro de diámetro para colocar una pequeña gota de pegamento acrílico Cy sobre la zona del cráneo delgada y baje cuidadosamente un trozo de cubreobjetos sobre ella. Luego, presione suavemente contra el cráneo para expulsar cualquier exceso de pegamento, evitando la formación de burbujas entre este y el cubreobjetos, ya que podrían obstruir la vista. Una vez seco, use una microhoja para retirar cuidadosamente cualquier pegamento que quede encima del cubreobjetos, en preparación para la imagenología de dos fotones.

Cubra la ventana cortical de cráneo delgado con solución salina y localice el área de interés bajo fluorescencia epi. Para permitir la obtención de imágenes posterior del área, tome una fotografía utilizando una cámara fotográfica para imágenes. Aquí se muestra el uso de un microscopio personalizado de dos fotones con un láser de ti-safiro sintonizado a 920 nanómetros.

La fluorescencia se detecta utilizando un tubo fotomultiplicador o PMT en modo de detección de campo completo y un filtro de emisión de 5 81 80. Se utiliza una lente de inmersión en agua de 20x durante toda la sesión de adquisición de imágenes. Establezca la potencia máxima del láser del objetivo entre 50 y 65 milivatios.

A continuación, seleccione un área de interés, ya sea la capa cortical uno o dos hasta 150 micrómetros por debajo de la superficie de la cáscara. Para facilitar la reimagen, tome fotografías del mismo campo de visión con un aumento digital de uno x, dos x y tres x. Los vasos sanguíneos pueden servir como puntos de referencia para localizar fácilmente el mismo campo de visión durante sesiones posteriores de imagen.

Con un aumento de tres x, adquiera múltiples Zacks con 80 a 90 pasos Z cada uno y un paso de 0,69 micrómetros cada cinco minutos durante hasta 30 minutos. Esto permite un buen muestreo de la morfología y el comportamiento de las microglías a lo largo del tiempo entre las adquisiciones de Zacks; verifique el nivel de salino y la profundidad de la anestesia. Si es necesario, se puede administrar una dosis de refuerzo de un tercio de la dosis original del cóctel anestésico durante el procedimiento para prevenir la deposición de tat en la jeringa y la aguja durante los días previos a la inyección.

Siliconizó el revestimiento interno de una aguja de calibre 35 y de una jeringa de volumen micro de 10 microlitros retirando la solución de acondicionamiento hasta que llenó tanto la aguja como la jeringa. Deje que la solución repose durante cinco minutos a temperatura ambiente, luego vacíe la solución de la jeringa, retire el émbolo y permita que la jeringa y la aguja se sequen completamente. Finalmente, lave la jeringa y la aguja cuidadosamente con agua desionizada.

Una vez silanizado, una jeringa y una aguja pueden utilizarse durante más de seis meses antes de que sea necesario un nuevo silanizado. En el día de la inyección, coloque una pequeña gota de la solución de TAT sobre un portaobjetos de vidrio silanizado. Utilizando una punta de pipeta silanizada, cargue la cantidad deseada de solución en la jeringa de volumen micro a partir de esta gota.

Utilizando una broca, realice una craneotomía pequeña de 0,5 milímetros de diámetro, tres milímetros hacia la región rostral o lateral respecto a la ventana cortical de cráneo delgado donde se han obtenido imágenes de dos fotones. Para lograrlo, adelgace cuidadosamente el cráneo. Luego, use un par de pinzas afiladas para retirar la capa delgada de hueso.

Utilice un micromanipulador para alinear la aguja calibrada de 35 y la jeringa con la craneotomía. Luego, avance cuidadosamente la aguja hasta una profundidad de 700 a 900 micrómetros por debajo de la superficie de la lámina. Administre tres microlitros a 80 nanolitros por minuto utilizando una bomba de jeringa controlada por microprocesador.

Esta figura muestra microglía marcada con GFP visualizada mediante imágenes de dos fotones tras el implante de la ventana cortical de cráneo delgado, aproximadamente a 50 micrómetros por debajo de la superficie de la capa. Las secciones individuales de dos fotones obtenidas el día cero, entre 15 y 30 minutos después del implante de la ventana cortical de cráneo delgado, así como las obtenidas siete y 17 días después, demuestran que las ventanas permanecen transparentes mientras la microglía sigue activada en ausencia de agresiones inflamatorias. Esto resalta la utilidad de este método para investigar tanto las interacciones normales como inflamatorias entre células inmunitarias efectoras y otros tipos celulares neuronales.

In vivo, las proyecciones Z tomadas a las seis y 24 horas posteriores a la inyección de la neurotoxina del VIH, TAT, muestran cambios morfológicos evidentes de microglía activada. Esto demuestra aún más nuestra capacidad para estudiar en tiempo real los cambios morfológicos de la microglía en modelos agudos y crónicos de neuroinflamación. Acaban de ver cómo preparar una ventana de cráneo delgado y utilizarla para estudiar la neuroinflamación al realizar este procedimiento.

Es importante recordar que debe tomarse su tiempo al manipular el cráneo para prevenir cualquier daño causado por la preparación misma. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.