Visualización de la célula a célula de Transmisión del VIH utilizando clones fluorescente del VIH y la microscopía confocal en vivo

Este procedimiento utiliza imágenes de células vivas para visualizar la transferencia de VIH marcado con GFP a través de sinapsis virológicas entre células T CAT portadoras de VIH y células T primarias no infectadas. El ensayo de transferencia célula a célula comienza con la transfección de células T CAT con VIH gag IG FP, un clon fluorescente infeccioso del VIH-1. Las células T CAT transfectadas que expresan VIH gag IG FP se mezclan entonces con células T primarias no infectadas marcadas con C-M-T-M-R y se colocan en una cámara de imagen, donde puede observarse la transferencia de VIH marcado con GFP a través de la sinapsis virológica.

Los datos resultantes se analizan mediante software de análisis de imágenes para revelar los detalles de la transferencia del VIH a través de las sinapsis virológicas de linfocitos T. Hola, me llamo Benjamin Dale del laboratorio de Ben Chen en el Departamento de Medicina de la Escuela de Medicina Mount Sinai. Mi nombre es Greg McNerney, del laboratorio del Dr. Thomas Huser en el Centro NSF para Biopotonica en el Centro Médico UC Davis.

Y yo soy Deanna Thompson, también del laboratorio del Dr. Thomas Huser. Hoy les mostraremos un procedimiento para visualizar la transferencia célula a célula del VIH-1 utilizando microscopía confocal en vivo. En este procedimiento, las células Jurkat son transfectadas con un clon molecular infeccioso del VIH, únicamente personal de laboratorio capacitado que trabaje en instalaciones certificadas de bioseguridad.

Salas de cultivo de tejidos de nivel dos positivo o de nivel de bioseguridad tres pueden llevar a cabo el protocolo mostrado aquí. Trabajar con VIH infeccioso en instalaciones de imagen debe ser aprobado por la oficina local de bioseguridad institucional. Mantenga las células de gato temblorosas que se utilizarán como células donantes a una concentración entre dos veces 10 a la quinta y ocho veces 10 a la quinta células por mililitro.

En la cultura de células de gato jerk, una concentración celular superior a ocho veces 10 a la quinta células por mililitro provoca una reducción en la eficiencia de transducción. Para comenzar el procedimiento, transfecte cinco veces 10 a la sexta células de gato jerk con el plásmido viral HIV gag IGFP utilizando el método de nucleofección amax según se describe en el protocolo escrito adjunto, y permita que las células se recuperen durante la noche. Los linfocitos mononucleares periféricos se purifican a partir de capas leucocitarias de sangre humana completa mediante centrifugación en gradiente de densidad FICO.

Los linfocitos T CD4 positivos primarios se purifican a partir de los linfocitos mononucleares de sangre periférica mediante selección negativa utilizando un kit de aislamiento de células T CD4 positivas. Las células T CD4 positivas seleccionadas negativamente se recogen de una columna magnética y se cultivan en nuestro medio PMI con 10 % de FPS, suplementado con 10 unidades por mililitro de IL-2 humana recombinante. También se pueden alícuotar los linfocitos T CD4 positivos primarios aislados y congelarlos con la ayuda de recipientes criogénicos para congelación. Los recipientes de congelación se colocan en un congelador a -70 grados Celsius durante un mínimo de tres a cuatro horas.

A continuación, las células se transfieren a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo. Ahora que las células jerk han sido transfectadas y se han aislado las células T primarias diana CD4 positivas, continúe con la limpieza y etiquetado de las células al día siguiente de la transfección. Las células jerk ya expresan el constructo fluorescente infeccioso de VIH.

Al manipular muestras infecciosas, usamos una bata de laboratorio con cierre frontal y dos pares de guantes. Elimine los restos celulares de las células transfectadas mediante centrifugación sobre un medio de alta densidad de empaquetamiento fial. Primero, dispense 1,5 mililitros de fial pack en el fondo de un tubo cónico de 15 mililitros.

Luego, superponga suavemente el material del gradiente con las células transfectadas de sombrero de convulsión en un volumen de cinco mililitros de nuestro medio PMI. En este punto, las células transfectadas de sombrero de convulsión son capaces de producir VIH infeccioso. Por lo tanto, todas las puntas de pipeta que entren en contacto con las células que expresan VIH deben desinfectarse con una solución de lejía al 10 %.

Antes de desechar en un recipiente dentro de la cabina de seguridad biológica, tape el tubo y rocíe el exterior del tubo con una solución de etanol al 70 %, luego séquelo con una toalla de papel seca. Centrifugue las células a 400 G durante 20 minutos a temperatura ambiente con el freno desactivado. Tras la centrifugación, utilice una pipeta para retirar cuidadosamente las células de la interfase con el medio y transfiera las células a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. Diluya las células con nuestro medio PMI hasta un volumen total de 15 mililitros y centrifugue a 300 G durante 10 minutos.

A temperatura ambiente, suspendemos el precipitado en tres mililitros de medio de cultivo jerk hat y transferimos a una poceta de dos centímetros de una placa de seis pocetas. Coloque la placa en el incubador de cultivo de tejidos hasta que esté lista para usar al día siguiente. Por la tarde del mismo día, etiquete las células T primarias CD4 positivas utilizadas como células diana para distinguirlas de las células donantes. Primero, precipite cuatro veces 10 de las seis células T primarias CD4 positivas mediante centrifugación a 400 G durante 10 minutos.

Luego lave las células con cinco mililitros de PBS y resuspenda. Suspender en dos mililitros de PBS, añadir el marcador fluorescente naranja para células hasta una concentración final de 1,5 micromolar e incubar a 37 grados Celsius durante minutos. Cuando finalice la incubación de las células, añadir ocho mililitros de medio completo Chica y centrifugar a 400 G durante 10 minutos.

Re-suspender las células en tres mililitros de medio completo suplementado con 10 unidades por mililitro de IL-2 y colocarlas en el incubador de cultivo de tejidos durante la noche. Tras la incubación nocturna, las células donadoras y las células diana están listas para el experimento de transferencia célula a célula. Antes de montar el experimento de transferencia célula a célula, preparar la cámara de imagen para amortiguar la plataforma frente a las fluctuaciones de temperatura en la habitación.

Y para bloquear la luz ambiental del cuarto, se coloca una gran cubierta negra sobre todo el sistema de calentamiento del microscopio, creando una cámara de aire aislada alrededor del sistema. La cámara de imagen se mantiene a una temperatura estable de 37 grados Celsius mediante un calentador termostático con una punta de termopar tipo T colocada junto a la muestra para realimentación de temperatura. Precalentar durante 30 minutos antes de montar la muestra.

La imagen confocal por disco giratorio con un microscopio óptico invertido se utiliza para crear imágenes confocales tridimensionales de la transferencia de VIH de célula a célula. Todo el hardware y la adquisición, incluyendo una plataforma Z, son controlados por el software MetaMorph o MetaMorph IQ versión 1.8. El escaneo se realiza mediante una unidad confocal de disco giratorio CSU10 que utiliza simultáneamente más de 800 puntos confocales para aumentar considerablemente la velocidad de escaneo, complementando así su rapidez. La CSU10 se combina con una cámara altamente sensible de dispositivo acoplado por carga con multiplicación electrónica para permitir imágenes rápidas con poca luz, lo que reduce tanto el fotoblanqueo como la fototoxicidad.

La fuente de luz de fluorescencia es un láser de gas iónico de argón-kriptón de múltiples longitudes de onda. Se utiliza un filtro óptico sintonizable And or Oko o A OTF para seleccionar las longitudes de onda deseadas, que aquí son 488 nanómetros y 568 nanómetros, mientras se controla su potencia para reducir aún más el fotoblanqueo y prolongar el tiempo de adquisición de imágenes. El A OTF obtura rápidamente el láser tras cada exposición de 15 a 30 milisegundos cuando la cámara no está adquiriendo imágenes, evitando así la exposición innecesaria mientras las imágenes se transfieren desde la cámara E-M-C-C-D al ordenador.

La luz láser se incorpora al sistema de disco giratorio mediante un espejo dicróico cuádruple de bandas 405, 488, 568 y 647. La emisión fluorescente se separa por longitud de onda utilizando un espejo dicróico largo paso de 560 nanómetros con un divisor de imagen. El canal verde se filtra usando un filtro de paso de banda de 525/50 nanómetros y el canal rojo se filtra usando un filtro de paso de banda de 609/54 nanómetros. Los dos canales se proyectan uno al lado del otro sobre la cámara E-M-C-C-D.

Mientras la cámara de imagen se calienta, prepare las células para el experimento de transferencia de célula a célula. Utilice un hemocitómetro para contar las células ette que expresan HIV gag IGFP. Coloque el hemocitómetro en una placa de Petri para evitar la exposición directa a las células que expresan el virus.

Lave las células con dióxido de carbono, medio independiente y resuspenda en medio de imagenología de células vivas a una concentración de uno a tres veces 10⁷ células por mililitro. El uso de medio independiente de dióxido de carbono elimina la necesidad de una cámara ambiental de dióxido de carbono. Para la imagenología.

Las células también cuentan, lavan y resuspenden los linfocitos T primarios marcados CD4 positivos como se acaba de mostrar para las células dur hat. A continuación, inicie la transferencia célula a célula mezclando 20 microlitros de células dur hat transfectadas con HIV gag IGFP con 40 microlitros de linfocitos T primarios marcados CD4 positivos y cargue 50 microlitros en una cámara microscópica EBD tratada para cultivo de tejidos y permeable al gas. Selle la cámara con tapones y asegure los tapones envolviendo la interfaz de la cámara de tapones EBIT D con paraform.

Limpie la cámara de imagen con una toallita química humedecida con etanol al 70 % y déjela secar al aire brevemente en la campana. Transporte la cámara de imagen sellada dentro de un recipiente cerrado para evitar exposiciones accidentales. Si la cámara se cae durante el transporte inmediatamente después de cargar la cámara de imagen IBD con células, monte el dispositivo en el microscopio.

Tome imágenes de pares de células utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 60 x 1,42 NA, ya que la alta apertura numérica mejora considerablemente la resolución y maximiza la velocidad de adquisición por pilas de imágenes 3D. Recorte la región de grabación de la cámara de los CD de EM hasta abarcar únicamente el área inmediata de un par de células. Además, un paso Z grande entre 0,45 y 0,75 micrómetros también puede ayudar a acelerar la adquisición bajo estas condiciones.

Las imágenes se registran continuamente a intervalos de 20 a 60 minutos. La obtención de imágenes repetidas del mismo punto de la muestra puede prolongarse hasta seis horas con un fotoblanqueamiento mínimo. Cada segmento de datos consta de decenas de miles de imágenes que pueden ocupar un total de cinco a 20 gigabytes.

Para facilitar el transporte y el análisis de los archivos grandes, cada archivo se divide y se exporta como segmentos de archivo TIFF de un gigabyte. Para analizar las imágenes adquiridas, utilice cualquiera de varios programas de software de análisis de imágenes. Consulte el protocolo escrito adjunto para obtener detalles sobre el análisis de imágenes, incluyendo la corrección del blanqueo de intensidad y el seguimiento automático y manual de los puntos de gag.

En un período de 10 a 15 minutos después de la mezcla, se pueden visualizar células de gato que expresan IGFP del gen gag del VIH y que se adhieren a células T primarias positivas para CD4 mediante imágenes. Estos conjugados permiten evaluar el movimiento de los puntos de gag en células infectadas, así como en células diana. Tras la sinapsis, entre 30 minutos y tres horas, se puede observar el movimiento de los puntos de gag-IGFP hacia las células diana marcadas con rastreador celular.

Acabamos de mostrarle cómo visualizar la transferencia de célula a célula del VIH entre linfocitos T. Al realizar estos procedimientos, es muy importante recordar observar todas las precauciones de nivel de bioseguridad dos más o de nivel de bioseguridad tres al manipular muestras que han estado en contacto con células que expresan VIH. También recuerde utilizar células JCA bien mantenidas y ADN libre de endotoxinas para optimizar la transfección.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.