Name: Visualización de la célula a célula de Transmisión del VIH utilizando clones fluorescente del VIH y la microscopía confocal en vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Aprende a visualizar la transmisión del VIH entre células T mediante microscopía confocal en vivo con clones fluorescentes. Este método permite estudiar la formación de sinapsis virológicas y analizar la dinámica de transferencia viral en tiempo real.

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Esta revisión fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones, AI074420-02, Burroughs Premio al Investigador Wellcome, Hirschl Premios Científicos de Carrera de BKC y por el Centro NSF para Biofotónica Ciencia y Tecnología, Acuerdo de Cooperación PHY012099, y un Sistema de Salud de UCD Premio de Investigación de TH UCD CTSC CNRR ULRR024146.

Este método se utilizó en la investigación publicada en <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/323/5922/1743">ciencia Hübner et al 323:. 1743 hasta 1747 (2009)</a> . 1. Información general De célula a célula propagación del VIH fue descrito utilizando células infectadas por el VIH Jurkat como donantes de células CD4 y primaria de los linfocitos T como las células aceptor 1,2,3. En estos estudios, se detectó el virus en las células fijadas mediante la tinción de anticuerpos. Para realizar el seguimiento de la transferencia de virus de célula a célula en las células vivas, que explotan un clon recombinante, infecciosos molecular del VIH, llamada Gag del VIH-iGFP 4. Lleva la proteína verde fluorescente (GFP) que se inserta en el interior de la proteína Gag entre los dominios de MA y CA. Este clon molecular del VIH mantiene infectividad, sin necesidad de virus ayudante. Las partículas de virus a partir de este clon se estequiométricamente cargado con la proteína fluorescente verde, que proporciona una señal fuerte de fluorescencia de supervisar montaje viral y la transferencia entre las células. Cuando se utiliza junto con un material inerte de células de seguimiento de los tintes fluorescentes, las células receptoras pueden ser discriminados a partir de células de donantes de entrada, y permitiendo a visualizar la Transmisión del VIH de una célula T infectada a una de las células T infectadas 5. La formación de sinapsis virológicas y la transferencia de virus a partir de una célula a otra puede ser observado en las células vivas, mientras que se cultivan en un sobre cerrado, permeables a los gases de cámara de imagen. (Día 1) 2. Preparación del VIH Gag-iGFP transfectadas las células Jurkat T <ol><li> Preparar el CD4 + T línea celular Jurkat (ATCC, Manassas, VA) con cuidado el mantenimiento de las células a una concentración entre 2 x x 10 5 y 8 10 5 células / ml en Jurkat medios de cultivo (RPMI 1640, 10% de suero fetal bovino, 100 unidades / ml de penicilina, estreptomicina y 100 mg / mL). La clave del éxito: la cultura de las células Jurkat en concentraciones de más de 8 x 10 5 células / ml se traducirá en una reducción en la eficiencia de transfección. Nota: La transfección de VIH Gag-iGFP ADN proviral en las células T, como se describe a continuación, los resultados en la producción de un competente para la replicación del virus de inmunodeficiencia humana. Por lo tanto, todos los procedimientos deben ser realizados únicamente por personal calificado de laboratorio en función del nivel de bioseguridad 2 + o de bioseguridad de nivel 3 (BL2 + / BL3) salas de cultivo de tejidos. Trabajar con el VIH infeccioso en los centros de formación de imágenes deben ser aprobados por la oficina local institucional de bioseguridad. </li><li> Transfectar las Jurkats con el plásmido viral, VIH Gag-iGFP utilizando el método de nucleofection Amaxa (Lonza, Walkersville, MD). Pellet 5 x 10 6 células por centrifugación durante 10 minutos a 150 x g. Aspirar el sobrenadante y lavar las células en solución salina estéril tamponada de fosfato (PBS). Centrifugar las células y resuspender el precipitado a 97 l de pre-calentado, V nucleofector solución que contiene suplemento del fabricante. Agregue tres L de endotoxinas VIH Gag-iGFP plásmido (1 mg / l) a la suspensión celular y mezclar suavemente. La transferencia de la suspensión celular a una cubeta y nucleofect mediante el programa S-18. Inmediatamente la transferencia de las células a 3 ml de los medios de comunicación precalentado Jurkat cultura sin antibióticos. </li><li> Para preparar las células CD4 + objetivo de las sinapsis virológicas, se obtienen las células mononucleares de sangre periférica buffy abrigos mediante el uso de un estándar de Ficoll-Paque (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) de protocolo. Células T CD4 + son entonces seleccionados negativamente con un kit de aislamiento magnético de grano (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Estos pueden ser criogénicamente almacenaron en N2 líquido en alícuotas de 5 x 10 6 células/500 l de los medios de congelación (90% fetal bovino serum/10% DMSO). Descongelado CD4 + células T primarias son cultivadas en RPMI 10% FBS, suplementado con 10 unidades / ml de IL-2. </li></ol> (Día 2) 3. La recuperación de células vivas de Jurkats transfectadas con el VIH Gag-iGFP y tinción de las células diana con tintes fluorescentes <ol><li> Permitir que las células Jurkat a recuperarse de la noche a la mañana transfección. A continuación, retire los restos celulares por centrifugación en un material de Ficoll Hypaque gradiente de densidad. Prescindir de 1,5 ml de Ficoll-Paque de la parte inferior de un tubo cónico de 15 ml. Suavemente superposición de este material con el gradiente de Jurkats transfectadas en un volumen de 5 ml de RPMI. Centrifugar las células a 400 xg durante 20 min a temperatura ambiente con el freno de apagado. Retire con cuidado las células de la interfaz de los medios de comunicación / Ficoll con una pipeta. Transferirlos a un nuevo tubo de 15 mL cónico. Diluir las células con RMPI a un volumen total de 15 ml y centrifugar a 300 xg durante 10 min. Resuspender el sedimento en 3 ml de medio de cultivo Jurkat en 2 cm y (6 y placa) y el retorno de las células en el tejido incubadora de cultivo. </li><li> Para distinguir las células diana de las células del donante en experimentos de transferencia de célula a célula que prelabel las células CD4 + blanco con tintes fluorescentes. CD4 + en las células T primarias están etiquetados, incluso lación antes de su uso. Hemos tenido un excelente éxito de etiquetado células T con las dos CellTracker y tintes CellTrace (Invitrogen, Carlsbad, CA). Mientras que la concentración de colorante y los tiempos de incubación debe ser optimizado en función del medio de contraste y tipo de células empleadas, un protocolo de representante de los siguientes. Pellet 4 x 10 6 células CD4 + T cells principal girando a 400 xg durante 10 min. Se lavan las células con 5 ml de PBS y resuspender en 2 ml de PBS. Añadir CellTracker Orange (CMTMR, Invitrogen, Carlsbad, CA) a una concentración final de 1,5 M y se incuba a 37 ° C durante 20 min. Añadir 8 ml de los medios de comunicación Jurkat completa y centrifugar a 400 xg durante 10 min. Resuspender las células en 3 ml de medio completo suplementado con 10 unidades / ml de IL-2 y el lugar en el cultivo de tejidos incubadora durante la noche. </li></ol> (Día 3) 4. Monitoreo de la célula a célula de Transmisión del VIH Gag-iGFP utilizando imágenes de células vivas Nosotros usamos el VIH iGFP Gag-las células Jurkat transfectadas 48 horas después de la transfección. Sin embargo, hemos utilizado con éxito células a las 24 horas, y tan tarde como 72 horas después de la transfección. <ol><li> Aproximadamente 48 horas después de la transfección, el VIH iGFP Gag-Jurkats expresa se ​​cuentan, se lava con CO 2-medios de comunicación independientes (Invitrogen, Carlsbad, CA), y se resuspendió en células vivas imágenes de los medios de comunicación (CO 2 medios de comunicación independientes, el 10% de suero fetal bovino, 100 U / ml de penicilina, estreptomicina y 100 mg / ml, 10 unidades / mL de IL-2) a una concentración de 3.1 x 10 7 células / ml. </li><li> De manera similar, lavar y volver a suspender la etiqueta principal CD4 + células T en una concentración de 1.3 x 10 7 células / ml en los medios de comunicación en vivo de células de imagen. </li><li> Mezclar el VIH Gag-iGFP transfectadas con CD4 Jurkats primaria + células T en una proporción de 1:2 o 1:3 y de carga en un cultivo de tejidos tratados, permeables al gas, microcámara (ibidi, Verona, WI). Por ejemplo, mezcla de 20 l de VIH iGFP Gag-Jurkats transfectadas con 40 l de la etiqueta principal CD4 + T cells. Carga de 50 l de esta mezcla en una cámara de ibidi y sellar la cámara con tapones. Asegurar los tapones, envolviendo el cable / interface ibidi cámara con parafilm. </li></ol> 5. Consideraciones para las plataformas de microscopía: spinning disco microscopía confocal Después de cargar una cámara de imágenes ibidi con las células, inmediatamente montar el dispositivo en un microscopio invertido óptico (Olympus IX71, Center Valley, PA). La cámara de ibidi deben ser transferidos al microscopio sólo por personal de laboratorio BL2 +-experto provisto de prendas de seguridad adecuadas. A pesar de células vivas, imágenes comúnmente utiliza cámaras de incubación cara a mantener la estabilidad del medio ambiente 37 º C, esto se logró mediante un calentador termostático sencilla y económica (ASI 400, Nevtek, Williamsville, VA), junto con una punta de tipo T termopar montado al lado de la muestra de retroalimentación temperatura adecuada. Hemos encontrado el uso de CO 2-medios de comunicación independientes que nos permite mantener la viabilidad celular alta, evitando el uso de una cámara de CO 2. Para amortiguar la plataforma contra las fluctuaciones de temperatura en la habitación y para bloquear la luz fondo de la sala, un gran velo negro se monta sobre el conjunto microscopio / calentador de configuración de la creación de una bolsa de aire con aislamiento de todo el sistema. Esto reduce en gran medida las variaciones de temperatura y asociados relacionados con la temperatura de la muestra la deriva, sino que requiere de pre-calentamiento durante 30 minutos antes de montar la muestra. 6. Adquisición de Datos, transferencia y procesamiento de imágenes Las imágenes se tomaron usando un aceite de 60x 1.42 NA objetivo de inmersión (UPlanApo N, Olympus), como la apertura numérica (NA) mejora notablemente la resolución. Para crear imágenes en 3D confocal, la exploración se realiza por una unidad de disco giratorio confocal (CSU-10, Yokagawa, Japón) que a la vez utiliza&gt; 800 puntos confocal para aumentar drásticamente la velocidad de barrido. Para complementar su velocidad, la CSU-10 se combina con una alta sensibilidad de electrones multiplicando acusado dispositivo de acoplamiento (EMCCD, ixon + 897, Tecnologías de Andor, Irlanda) para permitir que la cámara de imagen rápido, con poca luz que reduce tanto photobleaching y fototoxicidad. La fuente de luz de fluorescencia es un multi-longitud de onda ArKr iones de gas láser (Innova 70C, coherente, Santa Clara), donde la longitud de onda deseada (488 nm) y la potencia del láser mide justo antes de que el objetivo del microscopio (&lt;1 mW) son seleccionados por un acústico- óptica filtro sintonizable (AOTF), (Tecnologías de Andor). Para reducir aún más photobleaching y extender el tiempo de imagen total, el AOTF rápidamente (microsegundos) corta el rayo láser cada vez que la cámara está inactiva (10-20 ms), mientras que la imagen recién adquirida se entrega desde el CCD (15-30 ms de exposición) a la computadora. La luz del láser se acopla al sistema de disco giratorio con un cuádruple banda 405/488/568/647 espejo dicroico (Semrock, Rochester, NY). Emisión de fluorescencia se filtra utilizando un filtro de banda 525/50 (Semrock) dentro de una rueda de filtros (Ludl productos electrónicos, Hawthorne, NY) montado bntre la cámara EMCCD y la unidad de giro del disco confocal. Todo el hardware y la adquisición, incluyendo un z-etapa (Mad Laboratorios City, Madison, WI), están controlados por el iQ Andor v1.8 software. Para maximizar la velocidad de adquisición de alrededor de 1,2 a 1,9 segundos montones de imágenes en 3D, que los cultivos de la región de grabación de la cámara del EMCCD está abajo a la zona inmediata de la célula-pair. Por otra parte, a expensas de alguna información en z, z un gran paso entre 0,45-0,75 m se puede utilizar para acelerar la adquisición. Imagen bajo estas condiciones pueden durar hasta 6 horas - con continuos segmentos de un minuto 20-60 - con photobleaching mínimo. En total, cada segmento de datos por lo general ocupa 5.20 Gb de espacio, mientras decenas de miles de imágenes son tomadas. Para facilitar el transporte y el análisis de los grandes archivos de datos, cada conjunto de adquisición de las necesidades que se descompone y se exporta como un archivo TIFF Gb segmentos de la imagen utilizando el software v1.8 iQ Andor. A partir de aquí, muchos paquetes de software excelentes que están disponibles para el análisis de imagen, como Metamorph, Volocity y ImageJ (se recomienda su variación Fiji). Cuando los dos marcadores fluorescentes deben ser seguidos, que al mismo tiempo grabar tanto de ellos sin disminuir la velocidad de adquisición mediante el uso de un &quot;modo de pantalla dividida.&quot; Ambos marcadores son excitados por dos líneas diferentes ArKr láser a la vez (a menudo 488 nm y 568). Se inserta directamente delante de la cámara EMCCD es una imagen de separación (OptoSplit II, Cairn, Kent, Reino Unido) que separa las dos imágenes diferentes. Cada imagen es independiente filtrado con filtros de fluorescencia (Semrock) y proyectada de lado a lado de la cámara a la vez la creación de la &quot;pantalla dividida&quot; efecto. Esto requeriría entonces de cultivo manual y alineación de las imágenes más adelante en el procesamiento de imágenes. 7. Consideraciones para el procesamiento de imágenes y análisis de datos Por lo general el análisis de imágenes con Volocity (PerkinElmer, Waltham, MA) en ordenadores Macintosh (Apple, Inc). Girar imágenes de microscopía confocal láser de disco primero se ajusta en su intensidad para corregir photobleaching, entonces deconvolved con Volocity. Mediciones de la intensidad y el seguimiento de los puntos lagrimales Gag se realiza con el módulo de cuantificación Volocity. Para los conjuntos de imágenes en movimiento con respecto a una sinapsis pre-formado debe ser calculada, un algoritmo de rastreo automático que se utiliza el botón de pistas sináptica a lo largo de toda la secuencia. La inspección manual de las regiones de interés definidas por el software autotracking se deben realizar para confirmar que el software se ha seguido correctamente el objeto deseado. Para los objetos donde el contraste con los objetos que lo rodean es demasiado débil, el seguimiento manual puede llevarse a cabo en un fotograma a fotograma. El paquete de software Volocity permite la exportación de ubicación XYZ, el volumen y la señal integrada en los objetos deseados. La distancia de la sinapsis y la velocidad del objeto seguido se calculan mediante la normalización de los movimientos en el centro del botón sináptico. 8. Resultados representante Entre 10 y 15 minutos de la mezcla se debe ser capaz de visualizar el VIH iGFP Gag-que expresan las células Jurkat adherirse a células CD4 + en las células T primarias. Imágenes de estos conjugados, uno puede evaluar los movimientos de los puntos lagrimales Gag en las células infectadas, así como en las células diana después de synaspe. Se puede observar el movimiento de los puntos lagrimales Gag-iGFP en las células diana poco después de las sinapsis se forman.

<ol><li>Blanco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+level+of+coreceptor-independent+HIV+transfer+induced+by+contacts+between+primary+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">High level of coreceptor-independent HIV transfer induced by contacts between primary CD4 T cells.</a> J Biol Chem. 279, 51305-51314 (2004).</li>
<li>Sourisseau, M., Sol-Foulon, N., Porrot, F., Blanchet, F., Schwartz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inefficient+human+immunodeficiency+virus+replication+in+mobile+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Inefficient human immunodeficiency virus replication in mobile lymphocytes.</a> J Virol. 81, 1000-1012 (2007).</li>
<li>Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+cell+to+cell+transfer+across+an+Env-induced%2C+actin-dependent+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse.</a> J Exp Med. 199, 283-293 (2004).</li>
<li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV-1%29+Gag+localization+and+oligomerization+monitored+with+live+confocal+imaging+of+a+replication-competent%2C+fluorescently+tagged+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1.</a> J Virol. 81, 12596-12607 (2007).</li>
<li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3D+video+microscopy+of+HIV+transfer+across+T+cell+virological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3D video microscopy of HIV transfer across T cell virological synapses.</a> Science. 323, 1743-1747 (2009).</li>
</ol>

Se describe aquí un método sencillo para visualizar la Transmisión del VIH de célula a célula. Una investigación reciente de nuestro laboratorio y otros sugieren que esto puede ser el modo predominante de propagación del VIH entre las células T. El método aquí descrito utiliza una forma recombinante del VIH, llamada Gag del VIH-iGFP, que lleva una etiqueta codificada genéticamente la proteína fluorescente verde en el núcleo estructural de proteínas Gag,. Debido a los altos niveles de GFP se produce en cada partícula de virus, este clon competente para la replicación del VIH permite a los investigadores hacer un seguimiento de partículas individuales de virus en tiempo real. Este virus debe ser especialmente útil en los estudios relativos a la transferencia de montaje y de célula a célula del VIH. La transferencia del VIH de célula a célula de transferencia es muy eficiente. Durante tres horas de co-cultivo, se ve rutina virus trasladado a un 20-30% de las células T primarias evaluadas por citometría de flujo. Eficiencias similares son cualitativamente visto en imágenes de células vivas. Infectadas por virus las células T comienza la formación de las sinapsis con las células no infectadas principal T casi inmediatamente después de la iniciación del co-cultivo. Interesantes, no todas las principales células T son capaces de interactuar con las células Jurkat infectadas por el VIH a pesar de las interacciones forzadas con pinzas láser (observaciones no publicadas, GM). VIH Gag-iGFP sin duda será útil para determinar subconjuntos de células T que son más susceptibles a la transferencia de células de las células, tanto in vitro como in vivo.

<table><tbody><tr><td>Células T Jurkat</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capa leucocitaria de sangre total</td><td>Centro de Sangre de Nueva York</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino fetal</td><td>Hyclone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema Nucleofector y Solución V</td><td>Lonza Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kits EndoFree Maxi Prep</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plásmido HIV Gag-iGFP</td><td>Laboratorio Chen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de aislamiento de células T CD4+</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tinciones Celltracker/CellTrace</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medio independiente de CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámaras de imagen</td><td>Ibidi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido Olympus IX-71</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objetivo de inmersión en aceite PlanApo N 1.42NA 60X</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Láser de gas iónico Innova 70C ArKr</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unidad confocal de disco giratorio tipo Nipkow CSU-10</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Divisor de haz dicróico Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5</td><td>Semrock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro de banda pasante 525/50</td><td>Semrock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara electrónica de acoplamiento de carga con multiplicación iXon+ 897</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calefactor termostático ASI 400</td><td>Nevtek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualización de la célula a célula de transmisión del vih utilizando clones fluorescente del vih y la microscopía confocal en vivo

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Mediante la fusión de la proteína verde fluorescente a las proteínas de su favorito, los biólogos tienen ahora la posibilidad de estudiar vivos complejos procesos celulares mediante microscopía de fluorescencia de vídeo. Para seguir los movimientos de la inmunodeficiencia humana proteína central del virus en la célula a célula de transmisión del virus de inmunodeficiencia humana, tenemos buenas prácticas agrarias de etiquetado de la proteína Gag en el contexto de un clon infeccioso molecular del VIH, llamada Gag del VIH-iGFP. Estudiamos este clon viral mediante microscopía confocal de vídeo. En el experimento visualizado siguiente, transfectar una línea humana de células T por el VIH Gag-iGFP, y usamos la etiqueta fluorescente CD4 + en las células no infectadas T como las células diana para el virus. Utilizando las diferentes etiquetas fluorescentes se pueden seguir fácilmente la producción viral y el transporte intercelular a través de estructuras llamadas sinapsis virológicas. Simples cámaras de gas permeable imágenes nos permiten observar con el microscopio de las sinapsis en vivo confocal de minutos a días. Estos métodos pueden ser utilizados para rastrear proteínas víricas a medida que avanzan en la de una célula a otra.

Este experimento visualizado es una guía para la utilización de un clon de fluorescencia molecular del VIH para vivir experimentos de imagen confocal.

Visualización de la célula a célula de Transmisión del VIH utilizando clones fluorescente del VIH y la microscopía confocal en vivo

Al fusionar la proteína fluorescente verde con sus proteínas de interés, los biólogos ahora tienen la capacidad de estudiar procesos celulares complejos en vivo utilizando...

Este procedimiento utiliza imágenes de células vivas para visualizar la transferencia de VIH marcado con GFP a través de sinapsis virológicas entre células T CAT portadoras de VIH y células T primarias no infectadas. El ensayo de transferencia célula a célula comienza con la transfección de células T CAT con VIH gag IG FP, un clon fluorescente infeccioso del VIH-1. Las células T CAT transfectadas que expresan VIH gag IG FP se mezclan entonces con células T primarias no infectadas marcadas con C-M-T-M-R y se cargan en una cámara de imagen, donde puede observarse la transferencia de VIH marcado con GFP a través de la sinapsis virológica.Los datos resultantes se analizan mediante software de análisis de imágenes para revelar los detalles de la transferencia del VIH a través de las sinapsis virológicas de linfocitos T. Hola, me llamo Benjamin Dale del laboratorio de Ben Chen en el Departamento de Medicina de la Escuela de Medicina Mount Sinai. Mi nombre es Greg McNerney, del laboratorio del Dr. Thomas Huser en el Centro NSF para Biopotonica del Centro Médico de la uc Davis.Y yo soy Deanna Thompson, también del laboratorio del Dr. Thomas Huser. Hoy les mostraremos un procedimiento para visualizar la transferencia célula a célula del VIH-1 utilizando microscopía confocal en tiempo real. En este procedimiento, las células Jurkat son transfectadas con un clon molecular infeccioso del VIH, solo personal de laboratorio capacitado que trabaje en instalaciones certificadas de bioseguridad.Salas de cultivo de tejidos de nivel dos positivo o de nivel de bioseguridad tres pueden llevar a cabo el protocolo mostrado aquí. Trabajar con VIH infeccioso en instalaciones de imagen debe ser aprobado por la oficina local de bioseguridad institucional. Mantenga las células de gato temblorosas que se utilizarán como células donadoras a una concentración entre dos veces 10 a la quinta y ocho veces 10 a la quinta células por mililitro.En la cultura de células de gato jerk, una concentración celular superior a ocho veces 10 a la quinta células por mililitro provoca una reducción en la eficiencia de transducción. Para comenzar el procedimiento, transfecte cinco veces 10 a la sexta células de gato jerk con el plásmido viral HIV gag IGFP utilizando el método de nucleofección amax según se describe en el protocolo escrito adjunto, y permita que las células se recuperen durante la noche. Los linfocitos mononucleares de sangre periférica se purifican a partir de capas buffy de sangre humana total mediante centrifugación en gradiente de densidad FICO.Los linfocitos T CD4 positivos primarios se purifican a partir de las células mononucleares de la sangre periférica mediante selección negativa utilizando un kit de aislamiento de linfocitos T CD4 positivos. Las células T CD4 positivas seleccionadas negativamente se recogen de una columna magnética y se cultivan en nuestro PMI con 10 % de FPS, suplementado con 10 unidades por mililitro de IL-2 recombinante humana. También se pueden alícuotar los linfocitos T CD4 positivos primarios aislados y congelarlos con la ayuda de recipientes criogénicos para congelación. Los recipientes de congelación se colocan en un congelador a menos 70 grados Celsius durante un mínimo de tres a cuatro horas.A continuación, las células se transfieren a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo. Ahora que las células jerk están transfectadas y que se han aislado las células T primarias diana CD4 positivas, continúe con la limpieza y la marcación de las células al día siguiente de la transfección. Las células jerk ya expresan el constructo fluorescente infeccioso de VIH.Al manipular muestras infecciosas, usamos una bata de laboratorio con cierre frontal y dos pares de guantes. Elimine los restos celulares de las células transfectadas mediante centrifugación sobre un medio de alta densidad fial pack. Primero, dispense 1,5 mililitros de fial pack en el fondo de un tubo cónico de 15 mililitros.Luego, superponga suavemente el material del gradiente con las células transfectadas de sombrero de convulsión en un volumen de cinco mililitros de nuestro medio PMI. En este punto, las células transfectadas de sombrero de convulsión son capaces de producir VIH infeccioso. Por lo tanto, todas las puntas de pipeta que entren en contacto con las células que expresan VIH deben desinfectarse con una solución de lejía al 10 %.Antes de desechar en un recipiente dentro de la cabina de seguridad biológica, tape el tubo y rocíe el exterior del tubo con una solución de etanol al 70 %, luego séquelo con una toallita seca. Centrifugue las células a 400 G durante 20 minutos a temperatura ambiente con el freno desactivado. Tras la centrifugación, utilice una pipeta para retirar cuidadosamente las células de la interfase con el medio y transfiera las células a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. Diluya las células con nuestro medio PMI hasta un volumen total de 15 mililitros y centrifugue a 300 G durante 10 minutos.A temperatura ambiente, suspendemos el precipitado en tres mililitros de medio de cultivo jerk hat y transferimos a una poceta de dos centímetros de una placa de seis pocetas. Coloque la placa en el incubador de cultivo de tejidos hasta que esté lista para su uso al día siguiente. Por la tarde del mismo día, etiquete las células T primarias CD4 positivas utilizadas como células diana para distinguirlas de las células donantes. Primero, precipite cuatro veces 10 de las seis células T primarias CD4 positivas mediante centrifugación a 400 G durante 10 minutos.Luego lave las células con cinco mililitros de PBS y resuspenda en dos mililitros de PBS. Añada el marcador fluorescente naranja para células hasta una concentración final de 1,5 micromolar e incube a 37 grados Celsius durante minutos. Cuando finalice la incubación de las células, añada ocho mililitros de medio completo de chica y centrifugue a 400 G durante 10 minutos.Re-suspender las células en tres mililitros de medio completo suplementado con 10 unidades por mililitro de IL-2 y colocarlas en el incubador de cultivo de tejidos durante la noche. Tras la incubación nocturna, las células donadoras y las células diana están listas para el experimento de transferencia célula a célula. Antes de montar el experimento de transferencia célula a célula, preparar la cámara de imagen para amortiguar la plataforma frente a las fluctuaciones de temperatura en la habitación.Y para bloquear la luz ambiental del cuarto, se coloca una gran cubierta negra sobre todo el conjunto del microscopio y el sistema de calentamiento, creando una cámara de aire aislada alrededor del sistema. La cámara de imagen se mantiene a una temperatura estable de 37 grados Celsius mediante un calentador termostático con una punta de termopar tipo T colocada junto a la muestra para retroalimentación de temperatura. Precalentar durante 30 minutos antes de montar la muestra.La imagen confocal por disco giratorio con un microscopio óptico invertido se utiliza para crear imágenes confocales tridimensionales de la transferencia de VIH de célula a célula. Todo el hardware y la adquisición, incluyendo una plataforma Z, son controlados por el software Andor IQ versión 1.8. El escaneo se realiza mediante una unidad confocal de disco giratorio CSU10 que utiliza simultáneamente más de 800 puntos confocales para aumentar considerablemente la velocidad de escaneo, complementando así su rapidez. La CSU10 se combina con una cámara altamente sensible de dispositivo acoplado por carga con multiplicación electrónica para permitir imágenes rápidas con poca luz, lo que reduce tanto el fotoblanqueo como la fototoxicidad.La fuente de luz de fluorescencia es un láser de gas iónico de argón-criptón de múltiples longitudes de onda. Se utiliza un filtro óptico sintonizable And or Oko o A OTF para seleccionar las longitudes de onda deseadas, que aquí son 488 nanómetros y 568 nanómetros, mientras se controla su potencia para reducir aún más el fotoblanqueo y prolongar el tiempo de adquisición de imágenes. El A OTF obtura rápidamente el láser tras cada exposición de 15 a 30 milisegundos cuando la cámara no está adquiriendo imágenes, evitando así la exposición innecesaria mientras las imágenes se transfieren desde la cámara E-M-C-C-D al ordenador.La luz láser se incorpora al sistema de disco giratorio mediante un espejo dicróico cuádruple de bandas de 405, 488, 568 y 647. La emisión fluorescente se separa por longitud de onda utilizando un espejo dicróico largo paso de 560 nanómetros con un divisor de imagen. El canal verde se filtra usando un filtro de paso de banda de 525/50 nanómetros y el canal rojo se filtra usando un filtro de paso de banda de 609/54 nanómetros. Los dos canales se proyectan uno al lado del otro sobre la cámara E-M-C-C-D.Mientras la cámara de imagen se calienta, prepare las células para el experimento de transferencia de célula a célula. Utilice un hemocitómetro para contar las células ette que expresan HIV gag IGFP. Coloque el hemocitómetro en una placa de Petri para evitar la exposición directa a las células que expresan el virus.Lave las células con dióxido de carbono, medio independiente y resuspenda en medio de imagenología de células vivas a una concentración de uno a tres veces 10 de las siete células por mililitro. El uso de medio independiente de dióxido de carbono elimina la necesidad de una cámara ambiental de dióxido de carbono. Para la imagenología.Las células también cuentan, lavan y resuspenden los linfocitos T primarios marcados CD4 positivos como se acaba de mostrar para las células dur hat. A continuación, inicie la transferencia célula a célula mezclando 20 microlitros de células dur hat transfectadas con HIV gag IGFP con 40 microlitros de linfocitos T primarios marcados CD4 positivos y cargue 50 microlitros en una cámara microscópica EBD tratada para cultivo de tejidos y permeable al gas. Selle la cámara con tapones y asegure los tapones envolviendo la interfaz de la cámara con los tapones EBIT D con paraform.Limpie la cámara de imagen con una toallita química humedecida con etanol al 70 % y déjela secar al aire brevemente en la campana. Transporte la cámara de imagen sellada dentro de un recipiente cerrado para evitar exposiciones accidentales. Si la cámara se cae durante el transporte inmediatamente después de cargar la cámara de imagen IBD con células, monte el dispositivo en el microscopio.Tome imágenes de pares de células utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 60 x 1,42 NA, ya que la alta apertura numérica mejora considerablemente la resolución y maximiza la velocidad de adquisición por pilas de imágenes 3D. Recorte la región de grabación de la cámara de los CD de EM hasta abarcar únicamente el área inmediata de un par de células. Además, un paso Z grande entre 0,45 y 0,75 micrómetros también puede ayudar a acelerar la adquisición bajo estas condiciones.Las imágenes se registran continuamente a intervalos de 20 a 60 minutos. La obtención de imágenes repetidas del mismo punto de la muestra puede prolongarse hasta seis horas con un fotoblanqueamiento mínimo. Cada segmento de datos consta de decenas de miles de imágenes que pueden ocupar un total de cinco a 20 gigabytes.Para facilitar el transporte y el análisis de los archivos grandes, cada archivo se divide y se exporta como segmentos de archivo de imagen TIFF de un gigabyte. Para analizar las imágenes adquiridas, utilice cualquiera de varios programas de software de análisis de imágenes. Consulte el protocolo escrito adjunto para obtener detalles sobre el análisis de imágenes, incluyendo la corrección del blanqueo de intensidad y el seguimiento automático y manual de los puntos de gag.De 10 a 15 minutos después de la mezcla, se pueden visualizar células de gato que expresan IGFP del gen gag del VIH y que se adhieren a células T primarias positivas para CD4 mediante imágenes. Estos conjugados permiten evaluar el movimiento de los puntos de gag en células infectadas, así como en células diana. Tras la sinapsis, entre 30 minutos y tres horas, se puede observar el movimiento de los puntos de gag IGFP hacia las células diana marcadas con rastreador celular.Acabamos de mostrarle cómo visualizar la transferencia de VIH de célula a célula entre linfocitos T. Al realizar estos procedimientos, es muy importante recordar observar todas las precauciones de nivel de bioseguridad dos más o nivel de bioseguridad tres al manipular muestras que han estado en contacto con células que expresan VIH. También recuerde utilizar células JCA bien mantenidas y ADN libre de endotoxinas para optimizar la transfección.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Una técnica que combina en la tinción de tetrámero situ e hibridación in situ (ISTH) permite la visualización, la cartografía y el análisis de la proximidad espacial de virus específicos de células T CD8 + a sus infectados por el virus objetivos y la determinación de las relaciones cuantitativas entre estos efectores inmunes y los objetivos a los resultados de la infección.

Una técnica para visualizar simultáneamente específica para el virus las células CD8 + T y células infectadas por virus In situ</em

Hemos desarrollado un vector lentiviral que posee, además de la LTR-Tat respuesta, el elemento de respuesta Rev (RRE) que pueden regular la expresión del gen de una forma del VIH-1 Tat y Rev-dependiente. El vector permite la detección específica de la replicación del VIH en las células vivas a través de la expresión de GFP.

Marcado específico del VIH-1 células positivas utilizando un vector lentiviral Ap-dependientes que expresan la proteína verde fluorescente

En este artículo se describe un método para visualizar la formación de una sinapsis virológica de VIH-1 sobre de cristal inducido por el apoyo bicapas planas de reflexión total interna de fluorescencia (TIRF) microscopía. El método también se puede combinar con la tinción de inmunofluorescencia para detectar la activación y la redistribución de las moléculas de señalización que se producen durante el VIH-1 sobre inducida por la formación de sinapsis virológicas.

Imagen del VIH-1 sobre inducida sinapsis virológica y señalización en la bicapa lipídica sintéticas

La detección de ARN viral por fluorescencia<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación (FISH)

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

Fuente: Shah, R., et al. Imagen de fluorescencia multiplexada en célula individual para visualizar ácidos nucleicos y proteínas virales y monitorear la infección por VIH, HTLV, VHB, VHC, virus Zika e influenza. J. Vis. Exp. (2020)Este video demuestra la visualización simultánea de ADN, ARN y proteína de cápside del VIH-1 en linfocitos humanos infectados mediante hibridación de ADN ramificado e inmunofluorescencia, lo que permite un análisis detallado de las etapas de replicación viral dentro de...

Imágenes de fluorescencia multiplexadas de ácidos nucleicos virales y proteínas en linfocitos humanos infectados

Se describe un método de microscopía correlativa que combina alta velocidad de microscopía de luz fluorescente de células vivas 3D y la crio-tomografía electrónica de alta resolución. Se demuestra la capacidad del método correlativo por imágenes dinámicas, pequeñas partículas de VIH-1 que interactúan con las células HeLa de acogida.

Microscopía correlativa para el análisis estructural en 3D de Interacciones Dinámicas

Imágenes de células vivas de las infecciones por virus alphaherpes permite el análisis de los eventos dinámicos de transporte dirigido y propagación intercelular. A continuación, presentamos metodologías que utilizan cepas virales recombinantes que expresan proteínas de fusión fluorescentes para facilitar la visualización de los conjuntos virales durante la infección de las neuronas primarias.

Móvil en vivo de imágenes de Alphaherpes Virus Transporte anterógrada y Propagación

Aquí se presenta un protocolo para un enfoque de imágenes de fluorescencia, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA y protein (MICDDRP), un método capaz de la visualización simultánea de fluorescencia unicelular de proteínas virales y ácidos nucleicos de diferente tipo y varamiento. Este enfoque se puede aplicar a una amplia gama de sistemas.

Imágenes de fluorescencia multiplexada de una sola célula para visualizar ácidos nucleicos y proteínas virales y monitorear el VIH, el HTLV, el VHB, el VHC, el virus del Zika y la infección por influenza

Aquí, presentamos un protocolo en el cual las solas células se supervisan para los eventos agudos y la infección productiva HIV-1 en un dispositivo nanofluidic. Los datos de imágenes definen las interacciones virus-receptor huésped y la dinámica de la vía de señalización. Este es el primer método para el cultivo unicelular longitudinal nanofluídico de alto rendimiento y las imágenes para estudiar la cinética de señalización y las interacciones moleculares.

Caracterización Unicelular De La Afluencia De Calcio Y La Infección Por VIH-1 Utilizando Una Plataforma Optofluídica Multiparámetro

Aprende a visualizar la transmisión del VIH entre células T mediante microscopía confocal en vivo con clones fluorescentes. Este método permite estudiar la formación de sinapsis virológicas y analizar la dinámica de transferencia viral en tiempo real.

Visualización de la célula a célula de Transmisión del VIH utilizando clones fluorescente del VIH y la microscopía confocal en vivo (Video) | JoVE Journal

Visualización de la célula a célula de Transmisión del VIH utilizando clones fluorescente del VIH y la microscopía confocal en vivo

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