Name: Volumen fijo o fijado a presión: un modelo murino de shock hemorrágico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 31 s
Description: Aprende a inducir shock hemorrágico en ratones mediante cateterización quirúrgica para estudiar respuestas inmunológicas y función de órganos post-trauma. Este modelo permite monitoreo fisiológico continuo y controlado.

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Fuente de Financiamiento / Número de Biología Molecular del shock hemorrágico GM053789

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Los experimentos con animales fueron supervisados ​​y realizados de acuerdo con las directrices y normas establecidas por el Cuidado de Animales institucional y el empleo y la conducta de Investigación y Cumplimiento de la Universidad de Pittsburgh, un AALAS plenamente acreditado / institución AALAC. Las fuentes animales incluyen Jackson Laboratories y Laboratorios Charles Rivers. Todos los animales se someten garantía de salud amplia a través de cada proveedor, así como la Universidad de Pittsburgh programas internos de vigilancia de la salud de los animales. Esta investigación se lleva a cabo de acuerdo con los directores de gobierno de los EE.UU. para el uso de animales vertebrados. El programa está registrado con el USDA, y tiene una carta de garantía con la Oficina de Servicios de Salud Pública de Protección de los Animales de Laboratorio.

<table border="1"><tbody><tr><th> Instrumento </th><th> Fabricante </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Dumonts (SS/45 ángulo 0.2x0.12mm punta, longitud 13,5 cm) </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11203-25 </td></tr><tr><td> Tijeras quirúrgicas (recta de 12 cm) </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 14068-12 </td></tr><tr><td> Hemostatos (curvo 12,5 cm) </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 13009-12 </td></tr><tr><td> Microtijeras (primavera de tijera recta de 8 cm) </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 15000-00 </td></tr><tr><td> Fórceps (0,8 mm de punta, curvas a 10 cm) </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11050-10 </td></tr><tr><td> sutura carrete 6-0 </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 18020-60 </td></tr><tr><td> sutura 4-0 PDSII </td><td> Penn Vet </td><td> ETHZ304H </td></tr><tr><td> gasa 4x4 </td><td> se pueden comprar a través de cualquier proveedor mundial </td><td></td></tr><tr><td> algodón punta del aplicador </td><td> se pueden comprar a través de cualquier proveedor mundial </td><td></td></tr><tr><td> 30G aguja </td><td> se pueden comprar a través de cualquier proveedor mundial </td><td></td></tr><tr><td> 23G aguja </td><td> se pueden comprar a través de cualquier proveedor mundial </td><td></td></tr><tr><td> 3cc jeringa </td><td> se pueden comprar a través de cualquier proveedor mundial </td><td></td></tr><tr><td> 5cc jeringa </td><td> se pueden comprar a través de cualquier proveedor mundial </td><td></td></tr><tr><td> 10cc jeringa </td><td> se pueden comprar a través de cualquier proveedor mundial </td><td></td></tr><tr><td> Tubo cónico de 50 cc </td><td> se pueden comprar a través de cualquier proveedor mundial </td><td></td></tr><tr><td> 1cc jeringa w / 25G aguja </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-826-88 </td></tr><tr><td> De polietileno de 10 tubos de 100 `(PE-10) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 a 170-12P </td></tr><tr><td> De polietileno de 50 tubos de 100 `(PE-50) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 a 170-12B </td></tr><tr><td> Llave de 3 vías </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9779127 </td></tr><tr><td> almohadilla azul quirúrgica </td><td> Fisher Scientific </td><td> 50-7105 </td></tr><tr><td> Apósitos estériles de campo </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9517505 </td></tr><tr><td> rollos de cinta de 1 &quot; </td><td> Corporate Express </td><td> MMM26001 </td></tr><tr><td> recta frascos de boca ancha lado (se usa como tope para cono de la nariz) </td><td> VWR </td><td> 159000-058 </td></tr><tr><td> bandeja de acero inoxidable de 8 &quot;x 11&quot; </td><td> VWR </td><td> 62687-049 </td></tr><tr><td> macho-macho de bloqueo leur de 3 vías </td><td> VWR </td><td> 20068-909 </td></tr><tr><td> esterilización bolsa de 3 &quot;x 8&quot; </td><td> VWR </td><td> 24008 </td></tr><tr><td> esterilización bolsa de 5 &quot;x 10&quot; </td><td> VWR </td><td> 24010 </td></tr><tr><td> Microscopio salvaje M650 w / pluma de pie </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> Leica IC D cámara digital / imagen en vivo </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> Digi-Med BPA-400 analizador y un integrador de sistemas </td><td> Micro-Med </td><td> SYS-400 </td></tr><tr><td> TXD-310 (Digi-Med transductor) </td><td> Micro-Med </td><td> TXD-300 </td></tr><tr><td> Computadora </td><td> Dell </td><td></td></tr><tr><td> Caliente cordón esterilizador de instrumentos </td><td> VWR </td><td> 18000-45 </td></tr><tr><td> Oster A5 Clippers w. tamaño de la hoja 40 </td><td> VWR </td><td> 10749-020 </td></tr><tr><td> circulación heating cojín 18x26 </td><td> Harvard </td><td> py872-5272 </td></tr><tr><td> termómetro rectal </td><td> Kent Científico </td><td> RET-3 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><th> Reactivo </th><th> Concentración </th><th> Fabricante </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> El pentobarbital sódico (solución de sodio Nembutol) </td><td> 70mg/kg </td><td> Ovación </td><td></td></tr><tr><td> Buprenorfina HCl </td><td> 0.1mg/kg </td><td> Bedford Laboratorios </td><td></td></tr><tr><td> Lactato de Ringer 250cc de inyección IV bolsa </td><td> Baxter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Aerrane (isoflurano) </td><td> El 99,9% </td><td> NLS Sanidad Animal </td><td> 105996 </td></tr><tr><td> Heparina sódica </td><td> 1000U </td><td> Abraxis </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro de sodio bacteriostático </td><td> 0,9% </td><td> Hospira </td><td></td></tr><tr><td> El alcohol etílico </td><td> 70% </td><td> Fármaco-AAPER </td><td></td></tr><tr><td> Triadine povidona yodada (Betadine) </td><td></td><td> Tríada desechables </td><td></td></tr></tbody></table>

volumen fijo o fijado a presión: un modelo murino de shock hemorrágico

Fixed Volume or Fixed Pressure: A Murine Model of Hemorrhagic Shock

Es de conocimiento común que la pérdida severa de sangre y una lesión traumática puede dar lugar a una cascada de señalización de eventos perjudiciales a menudo resulta en la mortalidad. 1, 2, 3, 4, 5 Estos eventos de señalización también puede conducir a sepsis y / o disfunción orgánica múltiple (MOD ). 6, 7, 8, 9 Es fundamental entonces para investigar las causas de la función inmune suprimido y en detrimento de las cascadas de señalización a fin de desarrollar formas más efectivas de ayudar a los pacientes que sufren de lesiones traumáticas. 10 Este choque hemorrágico presión fija (SA) procedimiento, aunque técnicamente difícil, es un excelente recurso para la investigación de estas condiciones fisiopatológicas. 11, 12, 13 Avances en la evaluación de los sistemas biológicos, es decir, la biología de sistemas han permitido a la comunidad científica para comprender mejor las complejas redes fisiológicas y los patrones de comunicación celular. 14 El shock hemorrágico ha demostrado ser una herramienta vital para revelar los patrones de comunicación celular y su relación con la función inmune. 15, 16, 17, 18 Este procedimiento se puede dominar! Este procedimiento también se puede utilizar como una cantidad fija o un enfoque de presión fija. Se adaptó esta técnica en el modelo murino para mejorar la investigación en la función inmune innata y adaptativa. 19, 20, SA Debido a su pequeño tamaño en ratones 21 presenta retos únicos. Sin embargo, debido a las cepas de ratones disponibles, esta especie representa un recurso sin precedentes para el estudio de las respuestas biológicas. El modelo SA es un importante modelo para el estudio de los patrones de comunicación celular y las respuestas de los sistemas tales como sistemas mediadores hormonales e inflamatorios, y señales de peligro, es decir, DAMP y upregulation PAMP, ya que provoca respuestas distintas que se diferencian de otras formas de shock. 22, 23 , 24, 25 El desarrollo de cepas transgénicas murino y la inducción de agentes biológicos para inhibir la señalización específica han presentado valiosas oportunidades para esclarecer aún más nuestra comprensión de los de arriba a abajo la regulación de la transducción de señales después de una pérdida severa de sangre, es decir, SA y el trauma 26, 27 , 28, 29, 30. Existen numerosos métodos de resucitación (R) en asociación con la SA y el trauma. 31, 32, 33, 34 Un método de resucitación de volumen fijo de solución de Ringer lactato únicamente (LR), equivalente a tres veces el volumen de sangre derramada, se utiliza en este modelo para estudiar los mecanismos endógenos como la lesión de órganos a distancia y la inflamación sistémica. método 35, 36, 38 Este de la reanimación ha demostrado ser eficaz en la evaluación de los efectos de la SA y el trauma 38, 39.

El modelo de shock hemorrágico ha sido un recurso confiable y reproducible para facilitar la identificación y comprensión de las cascadas de señalización asociados con la inflamación y daño de órganos diana tras un traumatismo. Este artículo proporciona una descripción paso a paso de los aspectos quirúrgicos y mecánicos asociados con el procedimiento experimental de choque hemorrágico en ratones.

Volumen fijo o fijado a presión: un modelo murino de shock hemorrágico

Esly conocimiento general que la pérdida grave de sangre y las lesiones traumáticas pueden provocar una cascada de eventos de señalización perjudiciales que, a menudo, resultan en la muerte. 1, ...

Para caracterizar las respuestas inmunológicas al shock hipovolémico, se realiza un procedimiento quirúrgico en el que se disecan y cateterizan los vasos de un ratón. Mientras se monitorea la fisiología del animal mediante grabación digital y observación física, se induce un shock hemorrágico para imitar una experiencia traumática tras el shock inducido. El ratón es resucitado, se retira el catéter y se permite que el animal se recupere.A continuación, se puede estudiar al ratón para evaluar cambios en la función de órganos, patrones de comunicación celular y expresión genética mediante diversas técnicas como citometría de flujo, hematología, inmunotransferencias, inmunohistoquímica o microarreglos de chips genéticos. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que este modelo de choque hemorrágico con volumen fijo o presión fija permite al investigador controlar el grado de choque mientras monitorea continuamente y registra con precisión las fluctuaciones fisiológicas. Este método específico de choque hemorrágico mejora la capacidad del investigador para estudiar y comprender la función inmunológica antes de la cirugía.Asegúrese de tener a mano el siguiente equipo y materiales estériles. Seis suturas cero, algodón, aplicadores con punta de gasa masculina, masculina, llaves de paso de tres vías, transductores, trozos de 18 pulgadas de tubo PE 50 y trozos de cinco pulgadas de tubo PE 10. Las herramientas quirúrgicas que necesitará son llaves de paso de tres vías, una jeringa de 1 cc, una jeringa de 10 cc, una aguja de calibre 23, una aguja de calibre 30,5, tijeras microquirúrgicas, pinzas finas, un paquete quirúrgico, pinzas, hemostatos y tijeras quirúrgicas.Los materiales adicionales son solución de Ringer con lactato y alcohol para preparación. Una tabla metálica, un campo estéril, guantes estériles, Betadine, solución salina estéril, solución salina heparinizada y anestesia. El día de la cirugía, prepare el catéter para el miembro inferior derecho, que se utilizará para medir la presión arterial, utilizando guantes estériles.Agarre con ambas manos la parte media de un trozo de tubo de PE 10 estéril de cinco pulgadas y estírelo aproximadamente una pulgada para facilitar la inserción del catéter. Con las tijeras estériles, corte el tubo por la mitad, formando un bisel en el extremo estirado. Luego, inserte una aguja de calibre 30 en el extremo romo del tubo de PE 10 sin estirar.Utilizando una toallita con alcohol, esterilice la parte superior de un vial estéril de 10 cc que contenga la solución salina heparinizada. Llene una jeringa de un cc con 0,6 a 0,7 centímetros cúbicos de la solución de heparina. Coloque una aguja de calibre 30 y un catéter en el extremo de una llave de tres vías que esté directamente opuesta al extremo macho.Llene la aguja de la llave de paso de calibre 30 y el tubo de polietileno con la solución de heparina, asegurándose de que no haya burbujas de aire. Elimine las burbujas de aire golpeando suavemente, luego retire la aguja de calibre 30 del sistema de tres vías y aspire el líquido del sistema de tres vías de regreso hacia la jeringa de un centímetro cúbico para eliminar cualquier burbuja atrapada en el sistema de tres vías, y vuelva a colocar la aguja con el tubo conectado. Aproximadamente 0,1 centímetros cúbicos de la mezcla deben permanecer en la jeringa.Para configurar el catéter de reflexión en la pierna izquierda, siga el procedimiento descrito anteriormente, omitiendo la llave de paso de tres vías. Primero, limpie la bolsa de solución de Ringer con lactato con alcohol. Luego, conecte un transductor estéril a una máquina de presión arterial y frecuencia cardíaca según las especificaciones del fabricante.A continuación, conecte una llave de paso de tres vías a ambos extremos del transductor y colóquelo horizontalmente sobre la superficie del banco. Llene una jeringa de 10 cc con solución de Ringer lactato y conéctela a la llave de tres vías. Introduzca una aguja de calibre 23 en ambos extremos de un trozo de 18 pulgadas de tubo estéril PE 50.Conecte un extremo del tubo de PE a la llave de tres vías con la jeringa de 10 cc conectada. Luego, llene la llave de tres vías y el conjunto de PE 50 con solución de Ringer lactato. Asegúrese de eliminar todas las burbujas de aire como antes.A continuación, vuelva a conectar el tubo en T al transductor y llénelo. Añada un segundo tubo en T con ringer lactato. Finalmente, conecte la llave de paso metálica macho-macho con cierre de seguridad al aguja de calibre 23 del tubo de polietileno 50 para su fijación al catéter del miembro inferior derecho.Los instrumentos ya están listos para su uso en los procedimientos quirúrgicos y experimentales para disecar y canular los vasos del ratón, a fin de prepararlo para la inducción de shock. Comience colocando un ratón anestesiado con pentobarbital sódico sobre la placa quirúrgica de metal. En posición supina, inmovilice al animal mediante la técnica de cinta con lazo suelto, que consiste en envolver ligeramente tiras delgadas de cinta alrededor de cada una de las extremidades por debajo del orificio y adherirlas a la tabla, utilizando una afeitadora Osteo 5 con hoja tamaño 40, afeite las áreas abdominales e inguinales del animal.Luego, utilizando gasa, limpie el área con Betadine y alcohol para esterilizarla. Coloque un cono nasal con un centímetro cúbico de flúor sobre la nariz del ratón. Una vez que la respiración del animal comience a disminuir, pruebe la profundidad de la anestesia utilizando el reflejo de retirada por extensión del miembro.Coloque un apósito estéril sobre el animal durante todo el procedimiento para ayudar a mantener la esterilidad. Luego, realice una pequeña incisión de cuatro a cinco milímetros en la piel paralela al músculo oblicuo interno izquierdo del abdomen y al músculo transverso del abdomen izquierdo. Tenga cuidado de no dañar los músculos circundantes ni tocar los nervios.Utilice un fórceps de Dumont para agarrar el tejido en la conexión abdominal y separe el tejido adiposo de los músculos abdominales oblicuos y transversos. Con el otro par de fórceps de Als, realice una disección roma a lo largo de los músculos abdominales, separando cuidadosamente la fascia y el tejido adiposo. Justo debajo de este tejido adiposo, al igual que con la vena y la arteria femoral, y junto al nervio femoral sin tocarlo, separe el nervio femoral agarrando el tejido adiposo que se encuentra adyacente a él.Extraiga este tejido lateralmente desde la vena y la arteria. El nervio que está incrustado en este tejido seguirá al ser jalado lateralmente. Coloque la otra punta de Dumont hacia abajo contra la arteria y ábrala y ciérrela.Disecar cuidadosamente la fascia. Los vasos son muy superficiales, así que asegúrese de no profundizar en los músculos subyacentes. Una vez que el nervio esté separado, mantenga el Dumont cerrado e insértelo dorsalmente a los vasos.Al aparecer la punta del dumont en el otro lado de la vena, ábrala para diseccionar romo la fascia. Mantenga el dumont dorsal al vaso y tome la primera sutura. Luego, tire de la sutura hacia atrás a través de la abertura hecha entre los vasos y los músculos subyacentes.Coloque un total de 360 puntos alrededor de la sutura de la vena y la arteria. Uno de ellos debe estar más próximo al nudo del músculo abdominal; sin embargo, déjelo suelto y sujételo con una pinza hemostática. El borde cóncavo de la pinza hemostática debe apoyarse sobre la cavidad abdominal del animal.La sutura dos es la más distal en ubicación. Amarre inmediatamente esta sutura para ligar los vasos y sujétela con una pinza hemostática con el lado cóncavo hacia abajo; las suturas distal y proximal se utilizan para tensar los vasos y evitar la pérdida de sangre, además de levantarlos ligeramente para facilitar la inserción del catéter. La sutura tres debe colocarse entre las suturas distal y proximal.Para el soporte del catéter, ate un nudo suelto que se utilizará para asegurar el catéter dentro del vaso después de la inserción. Una vez que las suturas estén firmes, identifique la arteria por la pared gruesa del vaso y su color blanco. Con las tijeras microquirúrgicas, realice una pequeña incisión en la parte superior de la arteria, cerca de la sutura distal, de modo que quede una cantidad suficiente de arteria para la inserción inicial del catéter.Coloque un extremo del dumont dentro de la luz del vaso arterial y ciérrelo sobre la pared del vaso para abrir el orificio mientras sostiene la pared arterial. Introduzca el catéter en la luz mientras tira del vaso sobre el catéter. Sujete ligeramente el punto medio del sutura de soporte para mantener el catéter en su lugar.Luego, suelte el hemostato proximal para aflojar la sutura proximal y reabrir la sutura alrededor de los vasos. En este momento, la presión arterial debería impulsar la sangre nuevamente hacia el catéter. Debe ser visible sangre pulsátil dentro del catéter.Sujete los vasos alrededor del catéter con una mano y use la otra para introducir el catéter en el vaso. De cuatro a cinco milímetros. La punta del catéter debe quedar justo debajo de los músculos oblicuo interno y transverso del abdomen.Conecte el animal a un analizador BPA 400 y lave las líneas arteriales. Coloque una o dos gotas de solución salina estéril en la abertura quirúrgica para mantener el tejido circundante húmedo durante los procedimientos de choque hemorrágico y resucitación para inducir el choque hemorrágico. Comience colocando el ratón anestesiado bajo una lámpara y sobre una almohadilla térmica circulante para ayudar a mantener la temperatura entre 36 y 37 grados Celsius.A continuación, utilice una jeringa para extraer aproximadamente la mitad del volumen sanguíneo del ratón durante un período de 15 minutos, con el fin de alcanzar una presión arterial media de 28 a 32 milímetros de mercurio. Después de 1,5 a tres horas, reanime al animal utilizando una bomba de jeringa para administrar solución de Ringer con lactato al triple del volumen extraído, a una velocidad constante durante 15 minutos. Una vez que el animal haya sido reanimado, retire el catéter y ligue los vasos sanguíneos.Utilizando tres suturas, tire del catéter ligeramente más allá de la sutura proximal y luego ate completamente esta sutura para prevenir la pérdida de sangre. El flujo colateral evita que las extremidades posteriores se vuelvan isquémicas. Finalmente, cierre ambas aberturas de las extremidades posteriores con un PDSI estéril de calibre cuatro cero.Suturo. Retire la cinta de bucle suelta y coloque al animal en una jaula limpia, que se mantendrá sobre una almohadilla térmica circulante durante varias horas. Posterior recuperación.Este diagrama representa una visión general del procedimiento de shock hemorrágico. Después de la canalización bilateral y la conexión inicial al monitor de presión arterial, se obtiene una línea base de presión arterial de cinco minutos. Una vez registrada una presión arterial confiable, se induce el shock extrayendo sangre a través del catéter femoral para alcanzar una presión arterial de 28 más o menos dos milímetros de mercurio; la extracción de sangre debe realizarse durante un período de 15 minutos.Después de la inducción del shock, se produce un período de shock de dos horas y media durante el cual se realiza un monitoreo constante de la presión arterial en los animales. Tras el período de shock, se lleva a cabo una reanimación controlada utilizando una bomba de jeringa que infunde de vuelta al animal un volumen tres veces mayor que el volumen sanguíneo extraído. Finalmente, el animal se vuelve a conectar a los monitores de presión arterial para obtener otra evaluación basal.Esto ocurre durante aproximadamente cinco a 10 minutos. Esta figura indica las respuestas proinflamatorias y antiinflamatorias asociadas con el shock hemorrágico. Ocurre una tormenta de citoquinas, en la cual citoquinas proinflamatorias y antiinflamatorias, junto con macrófagos, células T y una gran cantidad de otras respuestas fisiológicas, interactúan en un bucle de retroalimentación en un intento de devolver al organismo a condiciones homeostáticas y reparar órganos con déficit de oxígeno.Esta representación gráfica indica la función hepática en ratones de tipo salvaje sometidos a dos puntos temporales de shock hemorrágico en comparación con ratones control, el nivel de alanina aminotransferasa o LT se muestra en el gráfico A y el nivel de aspartato aminotransferasa o ST se muestra en el gráfico B. Las enzimas hepáticas se midieron utilizando un analizador de química sanguínea a partir de plasma sanguíneo. Estas imágenes de microscopía de fluorescencia muestran tejido pulmonar en ratones de tipo salvaje que han sido sometidos a shock hemorrágico y ratones de control.La tinción de actina se muestra en verde y difusa. La tinción del núcleo se muestra en azul. La expresión de iNOS se muestra en rojo, como puede observarse aquí.Los ratones con shock hemorrágico presentan una infiltración distinta de iNOS, que se muestra en rojo, en el epitelio bronquial y el endotelio vascular del tejido pulmonar. Esta tinción está ausente en los ratones control que se sometieron a un procedimiento simulado. Estas micrografías muestran secciones de tejido hepático de ratones sometidos a shock hemorrágico o ratones control que fueron fijados en paraformaldehído y teñidos con hematoxilina o eosina.La sección de tejido de los ratones sometidos a choque hemorrágico mostró tejido necrótico como resultado de la circulación y oxigenación agotadas, lo cual no se observó en los ratones que se sometieron al procedimiento simulado. Al intentar esta técnica, es muy importante recordar ser muy paciente y meticuloso con la técnica quirúrgica y la hemorragia. Tenga en cuenta que este modelo puede combinarse con otros modelos traumáticos, como fractura bilateral del fémur, fractura simulada y trauma de tejidos blandos, con el fin de responder preguntas relacionadas con la inmunología de los traumatismos múltiples.

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