Generación de transgénicos C. elegans Por la transformación biolística
August 23rd, 2010
Gusanos transgénicos se utilizan comúnmente en C. elegans La investigación. Descrito es un protocolo simple, pero eficaz, para introducir transgenes en los gusanos usando bombardeo biolística con partículas de oro recubiertas de ADN. El esfuerzo que implica y los resultados de los bombardeos se comparan favorablemente con microinyección para la generación de animales transgénicos.
El objetivo general de este procedimiento es generar gusanos transgénicos a través de la transfección biótica o de genes de fuego. Primero se cultivan grandes cantidades de gusanos, luego se recubren las partículas de oro con ADN, y los gusanos son bombardeados, transgénicos, progenie, luego aislados y rescatados, y se establecen nuevas líneas transgénicas. Hola, soy Daniel Owa, del laboratorio del Dr. Alfred Fisher en el Departamento de Medicina de la Universidad de Pittsburgh.
Hoy te mostraremos un procedimiento para generar gusanos transgénicos. Utilizamos este procedimiento para estudiar la regulación génica por factores de transcripción. Así que comencemos.
La preparación del plato de huevo comienza vertiendo una mezcla de agar al 2% en medio NGA suplementado con nistatina y micina estreptocócica. En placas de 10 a 50 centímetros deje que las placas se sequen a temperatura ambiente. A continuación, autoclave, 400 mililitros de medios LB en una botella de 500 mililitros y 40 mililitros de medios LB en un matraz de 250 mililitros.
También autoclave una botella vacía de 500 mililitros durante 20 minutos. Una vez esterilizado en autoclave, agregue estreptomicina a los 40 mililitros de medio LB hasta una concentración final de 200 microgramos por mililitro. A continuación, inocule con la cepa de E. coli.
OP 50 guión uno. Deje que el cultivo crezca durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, coloque las yemas de 10 huevos de gallina en la botella estéril de 500 mililitros.
Lleve el volumen a 400 mililitros con medio LB y agite para formar una solución uniforme. Incubar la solución a 60 grados centígrados durante una hora. Una vez que la mezcla de yo lb haya alcanzado la temperatura ambiente, agregue los 40 mililitros de cultivo ELI a la botella y agite.
A continuación, pipetee de cinco a ocho mililitros de cultivo en las placas de NGA preparadas. Déjalos secar durante la noche a temperatura ambiente al día siguiente. Vierta el líquido restante y seque durante una noche adicional a temperatura ambiente.
En este punto, las placas se pueden almacenar a cuatro grados centígrados durante uno o dos meses o sembrar inmediatamente con gusanos. Para expandir una población de DP 38 CL contra la que se tenía una concentración de E. coli OP de 50 a seis centímetros de placas NGA que contenían gusanos DP 38 recientemente inexistentes e incubarlos. Las lombrices utilizan una solución alcalina de hipoclorito para aislar los huevos de las lombrices DP 38.
El procedimiento se describe en el protocolo adjunto. Una vez que se hayan aislado los huevos, resus, suspenderlos en albahaca o M nueve tampones. Agregue más de 10,000 huevos a cada plato de huevos preparado de 10 centímetros y permita que los gusanos crezcan a 20 grados centígrados durante siete a 10 días.
Una vez que los gusanos han comenzado a limpiar la comida, los platos están listos para ser bombardeados. Para recubrir las partículas de oro con ADN Para el bombardeo, agregue 60 miligramos de partículas de oro a un tubo de 1,7 mililitros. Luego agregue 70%etanol y deje que el oro se remoje durante 15 minutos.
Gira el tubo brevemente para pellets las partículas de oro. Decantar el etanol. A continuación, lave las partículas de oro tres veces con agua estéril.
Vuelva a suspender el oro en un mililitro de glicerol estéril al 50%. La solución de stock de partículas de oro se puede almacenar durante meses a cuatro grados centígrados. A continuación, recoja los gusanos flotándolos desde las placas de huevos con albahaca s o tampones de línea M.
Luego transfiéralos a un tubo cónico de 50 mililitros. Deja que los gusanos se asienten en el fondo del tubo. A continuación, aspire todos menos dos o tres mililitros del tampón del tubo utilizando el tampón restante.
Transfiera los gusanos a una placa NGA de 10 centímetros sin manchas que haya sido llamada en hielo de manera uniforme. Distribuye los gusanos por todo el plato. Luego deje que el plato se seque completamente sobre hielo.
Esto evitará que las lombrices se aglomeren durante el proceso de secado. Es importante que los gusanos estén distribuidos uniformemente y que la placa esté completamente seca antes del procedimiento de bombardeo. Para preparar las partículas de oro recubiertas de ADN, agregue 50 microlitros de partículas de oro resuspendidas a un tubo de 1,7 mililitros.
Gira las partículas de oro y retira el supinado. A continuación, añada una mezcla de 10 a 15 microgramos de ADN purificado, circular o linealizado de interés y 20 microlitros de esperma de 0,1 molares recién preparados. Finalmente, mientras el vórtice en el tubo tenía suavemente 50 microlitros de cloruro de calcio de 2,5 molares, incubar la mezcla en hielo durante 30 minutos con mezclas periódicas para mantener las partículas de oro en suspensión.
Después de 30 minutos, gire la mezcla de partículas de oro. Aspire brevemente el lavado sobrenadante con 300 microlitros de etanol al 70%, seguido de un mililitro de etanol al 100% y finalmente vuelva a suspender las partículas de oro recubiertas de ADN en 170 microlitros de etanol al 100%. Para cada bombardeo, enjuague siete macro portadores que contendrán las partículas de oro en dos propanol y luego déjelas secar a temperatura ambiente.
Vortex, la mezcla de oro y ADN. A continuación, pipetee 20 microlitros en el centro de cada macroportador. Deja que el etanol se evapore.
Inserte el disco de ruptura en el adaptador Hector y asegure el adaptador en el aparato de bombardeo. A continuación, coloque los siete soportes de macros en el soporte y utilice la herramienta suministrada para asentarlos. A continuación, coloque una pantalla de parada Hector y la parte inferior en el soporte.
Dale la vuelta al soporte de modo que el lado con manchas doradas de los portadores macro quede hacia abajo. Y colócalo en el segundo estante desde la parte superior. Alinee los orificios en la parte superior del soporte del portador de macros con las salidas del adaptador Hector.
Retire la tapa de la placa NGA recubierta de gusanos y colóquela en el estante más bajo de la cámara de bombardeo. Abra completamente la perilla de caudal de vacío y mantenga presionado el botón de aspiradora hasta que la cámara alcance 26 pulgadas de mercurio. Luego cambie a la posición de retención Para mantener el vacío, mantenga presionado el botón de disparo hasta que el disco se rompa.
Esto ocurrirá cuando la presión alcance 1, 350 PSI y puede tardar de cinco a 20 segundos. Suelte el botón, libere el vacío de la cámara cambiando a la posición de ventilación y retire la placa. Apague la aspiradora en helio.
Luego presione disparar varias veces hasta que la línea de helio esté despejada y el indicador de helio lea. Zero PSI finalmente apague el sistema PDS 1000. Ahora que los gusanos se han transformado, pueden recuperarse e incubarse después del bombardeo.
Coloque el plato a 20 grados centígrados durante 20 minutos. A continuación, flotar los gusanos de la placa con 10 mililitros de albahaca S o tampón M nine inoculado, placas NGA manchadas de 2010 centímetros con 0,5 mililitros de las lombrices en tampón. A continuación, deje las placas a temperatura ambiente durante aproximadamente dos semanas.
Cribar el rescate del fenotipo UNC 19 por el transgén y generar una línea individual a partir de cada placa de 10 centímetros que contenía los gusanos rescatados. El éxito del protocolo en lo que respecta a la obtención de animales transgénicos depende del transgén en particular. Para los transgenes promotores GFP Reporter, hemos obtenido hasta 20 líneas.
Un resultado más típico es de tres a 10 líneas. Hasta el 30% de las líneas transgénicas son líneas integradas, pero esto es aleatorio y realizaremos múltiples bombardeos en un solo día si se desea particularmente una línea integrada. Se muestra una placa representativa de 10 centímetros de 19 gusanos mutantes rescatados por bombardeo transgénico.
Los gusanos rescatados pueden ser identificados por su mayor tamaño y su movilidad muy mejorada en relación con los no transformados. En uno 19 mutantes. El aislamiento de gusanos rescatados transformados con un transgén GFP lejano da como resultado la expresión de GFP.
Este transgén expresa GFP fuertemente en el intestino y la hipodermis de los gusanos transgénicos. Este transgén en particular está integrado en el cromosoma del gusano y el 100% de la progenie expresa el transgén. Acabamos de mostrarte cómo realizar un bombardeo bioholístico de la elegancia marina al realizar este procedimiento.
Es importante cultivar muchas lombrices y usar permisos frescos. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.
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Descripción general
Este artículo describe un protocolo para generar gusanos transgénicos utilizando bombardeo biolístico con partículas de oro recubiertas de ADN. El método se presenta como una alternativa simple y efectiva a la microinyección para crear C. elegans transgénicos.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Genética
- Organismos transgénicos
Fundamentos
- Los gusanos transgénicos son esenciales para estudiar la función de los genes.
- El bombardeo biolístico es un método para introducir ADN en las células.
- C. elegans es un organismo modelo ampliamente utilizado en la investigación biológica.
- La microinyección es un método tradicional para generar animales transgénicos.
Propósito del estudio
- Proporcionar un protocolo para generar C. elegans transgénicos.
- Comparar la efectividad del bombardeo biolístico con la microinyección.
- Facilitar estudios sobre la regulación génica por factores de transcripción.
Métodos utilizados
- Cultivar grandes cantidades de C. elegans.
- Recubrimiento de partículas de oro con ADN.
- Bombardeo de gusanos con partículas de oro recubiertas de ADN.
- Aislamiento y rescate de progenie transgénica para establecer nuevas líneas.
Principales resultados
- El protocolo genera gusanos transgénicos con éxito.
- Los resultados del bombardeo se comparan favorablemente con los de la microinyección.
- Se pueden establecer nuevas líneas transgénicas de manera eficiente.
- Este método mejora el estudio de la regulación génica.
Conclusiones
- El bombardeo biolístico es un método efectivo para crear C. elegans transgénicos.
- Este enfoque puede simplificar la investigación transgénica en neurociencia.
- El protocolo puede adaptarse para varios estudios genéticos.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Biolistic transformation of C. elegans enables rapid generation of transgenic lines, supporting high-throughput gene function studies and pathway interrogation in early discovery. This method reduces operator skill barriers and increases throughput compared to microinjection, facilitating scalable target validation and mechanistic de-risking. The approach enhances predictive confidence at key inflection points in genetic and functional genomics pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables efficient creation of transgenic lines for functional gene analysis and pathway mapping.
- Supports biological de-risking by allowing direct assessment of gene localization and regulatory effects.
- Facilitates rapid hypothesis testing and target validation in disease-relevant genetic backgrounds.
- Provides integrated and extrachromosomal transgene options for flexible experimental design.
Screening & Assay Development
- Generates validated transgenic models for downstream phenotypic or reporter-based assays.
- Improves reproducibility and standardization by producing multiple independent lines per transformation.
- Enables scalable preparation of assay-ready biological systems for compound or genetic screening.
- Reduces technical variability compared to microinjection, supporting reliable assay development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling in vivo validation of gene function.
- Supports continuity from genetic discovery to preclinical model development in a vertebrate-relevant system.
- Facilitates risk-adjusted advancement by providing robust genetic models for mechanistic studies.
Pipeline & Workflow Integration
Biolistic transformation positions C. elegans as a versatile platform from early discovery through preclinical validation, bridging genetic hypothesis testing and functional model generation.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis-driven gene function studies and pathway elucidation.
- Screening: Delivers reproducible, assay-ready transgenic lines for high-content or phenotypic screening.
- Analytics: Enables quantitative readouts such as reporter expression and phenotypic rescue for comparative analysis.
- Translational Research: Provides in vivo genetic validation supporting biomarker and target continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, operator-independent workflow for repeated transgenic model generation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene function studies.
- Operational Value: Standardizes transgenic workflows, improving reproducibility and throughput.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio progression.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing robust genetic models for target validation.
Implementation Considerations
- Requires basic molecular biology expertise and access to a biolistic delivery system.
- Needs infrastructure for culturing and screening large populations of C. elegans.
- Demands cross-team standardization for reproducible transgene integration and expression analysis.
- Adaptable to various genetic constructs and reporter systems within the C. elegans model.
- Transformation efficiency and integration rates may vary by transgene and require empirical optimization.
