Name: Multicolor Time-lapse de imágenes de pez cebra transgénico: Visualización de células madre retinianas activado por la ablación selectiva de células neuronales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-20T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Aprende a realizar imágenes multicolor de tiempo real en pez cebra transgénico para estudiar la activación de células madre retinianas tras ablación neuronal selectiva. Este método permite visualizar la regeneración celular in vivo.

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Queremos agradecer a los Dres. Meera Saxena y Jonathan Mathias por sus valiosos comentarios sobre el manuscrito. Agradecemos a los Dres. Michael Parsons, Raymond Pamela, y Wong Rachel para proporcionar líneas transgénicas. Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por el protocolo aprobado IACUC MCG 07-12-003 * B. Este trabajo fue apoyado por el NIH R21 MH083614 y March of Dimes Premio Basilio O Conner Académico de inicio de JSM

<ol><li>Köster, R. W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+microscopy+of+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Time-lapse microscopy of brain development.</a> Methods Cell Biol. 76, 207-235 (2004).</li>
<li>Mumm, J. S., Williams, P. R., Godinho, L., Koerber, A., Pittman, A. J., Roeser, T., Chien, C. B., Baier, H., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+reveals+dendritic+targeting+of+laminated+afferents+by+zebrafish+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging reveals dendritic targeting of laminated afferents by zebrafish retinal ganglion cells.</a> Neuron. 52, 609-621 (2006).</li>
<li>Curado, S., Anderson, R. M., Jungblut, B., Mumm, J., Schroeter, E., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish%3A+a+new+tool+for+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> Dev Dyn. 236, 1025-1035 (2007).</li>
<li>Ren, J. Q., McCarthy, W. R., Zhang, H., Adolph, A. R., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+visual+responses+of+wild-type+and+hypopigmented+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioral visual responses of wild-type and hypopigmented zebrafish.</a> Vision Res. 42, 293-299 (2002).</li>
<li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+Coli+nitroreductase%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. Coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124, 218-229 (2007).</li>
<li>Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+cell+motility+and+actin+cytoskeleton+of+individual+neurons+and+neural+crest+cells+in%0A++zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in
 zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+zebrafish+embryonic+brain+by%0A++confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the zebrafish embryonic brain by
 confocal microscopy.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

JSM ha otorgado una patente sobre el uso del sistema de nitrorreductasa basado en la ablación de células en el pez cebra (Mumm JS, y Schroeter, EH ablación La ablación selectiva y regionales celular en el pez cebra de Patentes &quot;EE.UU. 7.514.595. 07 de abril 2009). Esta técnica es utilizado como la plataforma general para una empresa de servicios y herramientas de la biotecnología, Luminomics, Inc., que JSM fundó y sigue siendo una parte interesada pulg

En este vídeo, un resumen de las técnicas que utilizamos para la multicolor confocal de imágenes a intervalos de tiempo y la ablación de células específicas se proporciona. Contamos con time-lapse de imágenes para controlar el comportamiento de los múltiples tipos de células de interés en vivo, mientras que la ablación dirigida celda se utiliza para estudiar la función de circuitos neuronales y células específicas de los paradigmas de regeneración neuronal. Los ejemplos que se muestran destacan varias ventajas que se puede extraer de estos enfoques. Quizá lo más importante, time-lapse de imágenes proporciona un paradigma controlado internamente, fenómenos todos y cada uno observado puede relacionarse con estados previos. Esto permite que las comparaciones directas en lugar de inferir que se hizo a través de los puntos de tiempo experimental, por lo que los cambios relativos más fáciles de cuantificar y reducir experimental &quot;ruido&quot; asociado a las variaciones dentro de una población. Una ventaja de la imagen multicolor es la capacidad de visualizar los cambios en la interacción y / o tipos de células vecinas. Por ejemplo, utilizando una línea transgénica que las etiquetas de las células de Müller, que ahora caracterizan la respuesta de estas células madre potencial de lesión inducida por la pérdida de la discreta subpoblaciones de células retinianas. También hemos utilizado este enfoque para definir nuevos mecanismos de formación de circuitos neurales 2. Finalmente, además de los estudios de regeneración celular, recientemente hemos comenzado a utilizar el sistema de ablación por NTR basada en investigar el papel funcional de los subtipos neuronales tanto los circuitos neuronales discretos utilizando diversos paradigmas de comportamiento y ensayos electrofisiológicos. La única ventaja de emplear al pez cebra para tales estudios es que, debido a su capacidad de regeneración, los déficits inducidos son temporales. De este modo, mediante la correlación con los ensayos de imágenes con lapso de tiempo se pueden tipificar los mecanismos que conducen a la reinervación, así como la extensión de la reinervación necesarios para la recuperación funcional. Los métodos siempre se puede adaptar a muchas preguntas diferentes. Por ejemplo, los análisis similar de la ablación y la regeneración se puede aplicar a cualquier subtipo celular transgénica definible. En conjunto, estos estudios tienen el potencial para ampliar nuestra comprensión de la regeneración en el nivel de tipos de células individuales y en discreta nichos de células madre.

1. Reactivos: Danieau solución de: <ul><li> cloruro de sodio (Fisher, S271 1) </li><li> cloruro de potasio (Fisher, P217 500) </li><li> HEPES (Fisher, BP310500) </li><li> sulfato de magnesio (Fisher, M65 500) </li><li> nitrato de calcio (Fisher, C109500) </li><li> Penicilina-estreptomicina (Fisher, ICN1670049) </li></ul> Otros reactivos: <ul><li> Bajo agarosa fundido (Fisher, BP165-25) </li><li> Tricane metanosulfonato (Fisher, NC9435281) </li><li> N-feniltiourea (Fisher, NC9968868) </li><li> Metronidazol (Fisher, AC21034-1000) </li></ul> 2. Suministros: <ul><li> Profunda placas petri (Fisher Scientific / Corning, 08-772-32) </li><li> Dumont # 5 pinzas finas (Fisher, NC9404145) </li></ul> 3. Equipos: <ul><li> Ampliar estereoscopio (Olympus, SZ51) </li><li> Fluorescencia Estereoscopio Zoom (Olympus, SZX16) </li><li> Microscopio confocal (Olympus FV1000) </li><li> Digital calentador del bloque - Isotemp (Fisher, 11-715-125DQ) </li><li> Barnstead / Thermolyne Incubadora de sobremesa (Fisher, 11-702-4). </li></ul>

multicolor time-lapse de imágenes de pez cebra transgénico: visualización de células madre retinianas activado por la ablación selectiva de células neuronales

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

De alta resolución de imágenes a intervalos de tiempo de larvas de pez cebra de vida se puede utilizar para visualizar cómo se desarrollan los procesos biológicos (para revisión ver 1). Pescado compuesto transgénicos que expresan diferentes reporteros fluorescentes en los tipos de células vecinas proporcionar un medio para seguir las interacciones celulares 2 y / o respuestas a nivel de tejido de manipulaciones experimentales en el tiempo. En este vídeo, que muestran los métodos que se pueden utilizar para obtener imágenes de múltiples tipos de células en serie en la etiqueta transgénica pez sobre los cursos de tiempo que puede abarcar desde unos minutos hasta varios días. Las técnicas descritas son aplicables a cualquier estudio que busque relacionar el &quot;comportamiento&quot; de los tipos de células vecinas a través del tiempo, incluyendo: &quot;catch and release&quot; 1) serie de métodos para obtener imágenes de una gran cantidad de pescado en los días sucesivos, 2) métodos simplificados para la separación fluoróforos con la superposición de excitación / emisión perfiles (por ejemplo, las buenas prácticas agrarias y YFP), 3) el uso de hipopigmentadas líneas mutantes de extender la ventana de tiempo disponible para imágenes de alta resolución en las últimas etapas de larvas de desarrollo, 4) el uso de la membrana dirigido a los periodistas a revelar fluorescentes pequeños detalles morfológicos de las células individuales, así como los detalles celulares en poblaciones más grandes de las células, y 5) un método descrito anteriormente para químicamente inducida por la ablación de los tipos de células transgénicamente objetivo, es decir, nitrorreductasa (NTR) mediada la conversión de sustratos profármaco, como metronidazol (MTZ), a los derivados citotóxicos 3,5. Como ejemplo de estos enfoques, que se podrá visualizar la ablación y la regeneración de un subtipo de la retina neurona bipolar en cada pez durante varios días. Al mismo tiempo vamos a analizar varios otros tipos de células retinianas, incluyendo vecinos no atacaba las células bipolares y el potencial de estimular la degeneración de las células madre de la retina (es decir, las células de Mϋller). Esta estrategia está siendo aplicada en nuestro laboratorio para caracterizar las células y los tejidos a nivel (por ejemplo, el nicho de células madre) las respuestas a la pérdida selectiva y regeneración de los dirigidos tipos de células neuronales.

En este video, las técnicas para la multicolor confocal de imágenes a intervalos de tiempo y la ablación de células específicas se proporcionan. Time-lapse de imágenes se utiliza para controlar el comportamiento de los múltiples tipos de células de interés<em&gt; In vivo</em&gt;. La ablación dirigida celular facilita la función de estudio de circuitos neuronales y células específicas de los paradigmas regeneración neuronal.

Multicolor Time-lapse de imágenes de pez cebra transgénico: Visualización de células madre retinianas activado por la ablación selectiva de células neuronales

La obtención de imágenes de lapso de tiempo (time-lapse) de alta resolución de larvas de pez cebra vivas puede utilizarse para visualizar cómo se desarrollan los procesos biológicos (para una revisión, véase 1). El compuesto ...

La expresión de reporteros fluorescentes en animales transgénicos permite seguir las respuestas celulares a manipulaciones experimentales en modelos vivos de enfermedad. Aquí, se induce farmacológicamente la pérdida selectiva de células en peces cebra, mediante microscopía confocal multicolor de alta resolución. Se adquieren imágenes de las células diana y sus vecinas inmediatas antes, inmediatamente después y en intervalos de tiempo posteriores al tratamiento con fármacos. El análisis de imágenes demuestra la activación de poblaciones endógenas de células madre y la subsiguiente sustitución de las células diana durante la fase de recuperación.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología regenerativa, como cuáles son los mecanismos celulares y moleculares utilizados para regenerar tipos celulares específicos. Comience transfiriendo huevos transgénicos recolectados de apareamientos a una placa de Petri que contenga solución de 0,3 x danio a las 16 horas post fertilización. AÑADA PTU para inhibir la actividad de la tirosina ACE antes de cualquier evidencia de pigmentación en el tejido de interés. Si el embrión no es albino, incube los embriones a 28,5 grados Celsius.Una vez que los reporteros sean evidentes, coloque la placa de Petri bajo un microscopio estéreo de aumento fluorescente y seleccione según la expresión del transgén deseada. Antes de la obtención de imágenes, prepare una solución de montaje de agarosa de baja fusión al 0,5 % en medio para embriones y almacénela a 40 grados Celsius.Añada trica y PTU si es necesario. Mezcle suavemente y devuelva a 40 grados Celsius. Anestesie los peces colocándolos en medio embrionario que contenga trica.Durante aproximadamente tres minutos, los peces perderán la respuesta. Al tocar con una micropipeta, aspire individualmente cada pez hacia una punta de pipeta recortada, en un volumen de aproximadamente 30 microlitros de solución anestésica. A continuación, invierta la pipeta y permita que el pez se asiente en el fondo.Toque la punta con la solución de montaje y permita que la transferencia ocurra por gravedad. Tenga cuidado de no diluir el agro para que pueda reutilizarse. Deseche la solución anestésica restante del micropipeta.Luego, utilizando la misma punta, transfiera el pez a una placa de Petri. En aproximadamente 30 microlitros de solución de montaje, oriente suavemente el pez de manera que la región de interés quede centrada en la gota de aerosol. Asegúrese de que el pez permanezca en la orientación deseada hasta que el aerosol se solidifique.Se pueden montar varios peces en un solo plato de Petri si se desea. Después de que el agar se haya solidificado, transporte los peces al portaobjetos del microscopio confocal y agregue suavemente medio de embrión que contenga trica con o sin PTU al plato hasta que los peces queden completamente sumergidos. Abra el software de adquisición de imágenes y enfoque la región de interés para obtener una imagen óptima del detalle celular y/o molecular.Utilice objetivos de larga distancia de trabajo con altas aperturas numéricas en el software. Seleccione los filtros de flora adecuados de la lista giratoria. Haga clic en configuración espectral y realice ajustes en los rangos de emisión.Para obtener una separación limpia de las señales del reportero y maximizar las relaciones señal-ruido, seleccione el objetivo adecuado en el menú desplegable para asegurar que cualquier ajuste predefinido por el software se modifique correctamente. Para enfocar los láseres y establecer los niveles de potencia, seleccione una salida de la tabla de búsqueda que muestre la saturación de píxeles para cada canal.A continuación, ajuste la sensibilidad del detector para obtener la calidad de imagen deseada; aumente gradualmente la salida del láser hasta que la intensidad de la imagen sea aceptable. Evite la saturación de píxeles en la región de interés y mantenga los niveles de láser tan bajos como sea posible para reducir problemas de fotoblanqueo y fototoxicidad.Asegúrese de que cada línea láser produzca una señal detectable únicamente en el canal apropiado activando y desactivando manualmente los láseres mientras se monitorean todos los canales de imagen. Si no se observa diafonía, todos los canales pueden adquirirse simultáneamente. A continuación, encuadre el área de interés utilizando las funciones de zoom y rotación.Luego, configure la velocidad de escaneo y el tamaño de la imagen; usar velocidades de escaneo más rápidas minimiza el tiempo de permanencia del láser y aumenta la resolución temporal. Establezca el tamaño del paso en la dimensión Z según las necesidades del experimento. Aquí se utiliza un tamaño de paso de 10 micrones para obtener siete secciones ópticas de tejido retiniano.Una vez que se hayan determinado los ajustes adecuados, adquiera las imágenes de Zack y guárdelas. Luego, pase al siguiente pez. Se puede realizar un imagenado seriado con captura y liberación para rastrear los cambios celulares durante días sucesivos según las instrucciones del documento escrito adjunto.Al realizar un experimento de imágenes con múltiples marcadores, lo mejor es utilizar fluorocromos cuyos espectros estén bien separados; sin embargo, esto no siempre es práctico. Aquí mostramos un método sencillo de sustracción de imágenes utilizando el software de código abierto ImageJ para separar fluorocromos con perfiles de excitación y emisión superpuestos. En nuestro caso, GFP y YFP.Las técnicas de imagen con cronometraje descritas en este video se han utilizado para monitorear células madre retinianas marcadas con GFP durante la ablación y regeneración de neuronas bipolares retinianas. Para realizar la separación espectral, capture imágenes utilizando modos de adquisición secuencial y configuraciones variables de filtros de barrera, lo que permite adquirir por separado y separar parcialmente las fluorescencias superpuestas, respectivamente. Una vez adquiridas las imágenes, utilice la herramienta de importación ImageJ loci bio formas para abrir los archivos de imagen y comenzar la herramienta de importación. Arrastre el archivo de interés a la ventana de ImageJ.Divida los canales en pilas individuales utilizando la casilla de verificación dividir canales en la ventana de importación para iniciar el complemento alinear tres TP. Haga clic en complementos, luego en alinear pilas. A continuación, alinee tres tp.Las pilas deben alinearse para garantizar una sustracción adecuada. Seleccione la pila de referencia en el primer cuadro desplegable y la pila desalineada en el segundo. Marque las casillas usar origen relativo XY y usar origen relativo Z y haga clic en aceptar.Para iniciar el proceso de alineación, haga clic en el botón de registro de volumen. Aparecerá una nueva ventana que contiene los parámetros de alineación. Haga clic en aceptar.Esta sección ha sido optimizada por el distribuidor del complemento, por lo que no son necesarias modificaciones. Cuando finalice, aparecerá una ventana de pilas alineadas. Seleccione salida desde la ventana alineada para abrir la ventana de salida.Esta ventana también está optimizada y no requiere modificaciones. Haga clic en aceptar. Aparecerá una nueva pila en el área de trabajo con "alineado" añadido al final del título del archivo.Para eliminar la interferencia cruzada utilizando la calculadora de imágenes, haga clic en Procesar y luego en Calculadora de imágenes. Seleccione en el cuadro desplegable de imagen uno la pila que se restará y la pila que se utilizará en la resta. En el cuadro desplegable de imagen dos, seleccione Restar en el cuadro desplegable de operación y haga clic en Aceptar.Image J solicitará procesar la pila. Seleccione sí. Debería aparecer una nueva pila, que ha eliminado la interferencia entre los canales superpuestos.Fusionar las pilas para recrear la misma estructura de imagen antes del alineamiento y la sustracción. Al seleccionar los canales fusionados en la ventana de herramientas de canales, la herramienta permite fusionar hasta cuatro pilas en una pila hipercombinada. Finalmente, colorear los canales, ajustar el brillo y el contraste, y guardar los archivos como tiff para examinar la pérdida específica y la regeneración de la nitroreductasa.Células bipolares retinianas que expresan M cherry. Se tomaron series temporales de imágenes confocales en peces cebra individuales antes del tratamiento. Hay una expresión mosáica del reportero YFP marcado en la membrana en células bipolares controladas, mostrado en amarillo, y la proteína de fusión cherry nitroreductasa en bipolares diana, mostrada en rojo.El transgén marcado con CFP en la membrana mostrado en cian proporciona información contextual sobre la mayoría de las demás células retinianas para mayor claridad. La misma imagen sin la señal de CFP se muestra tras el tratamiento con metronidazol. Las células bipolares expresoras de nitroreductasa en rojo se pierden, mientras que las células bipolares controladas en amarillo se conservan.Esto demuestra la naturaleza altamente específica de esta metodología de ablación. Nuevamente, se muestra la misma imagen sin CFP para mayor claridad. Cuando se elimina metro NIAZ, las células que expresan NTR regresan aquí.Un ejemplo del método de sustracción G-F-P-Y-F-P se muestra en esta figura GFP etiquetada como Mueller. Las células GL se muestran en verde y las células bipolares etiquetadas con YFP se muestran en morado. La superposición entre las dos produce blanco para realizar la sustracción.Primero, las imágenes de GFP y YFP deben alinearse. El proceso de sustracción permite entonces eliminar las células bipolares marcadas con YFP de la imagen de GFP, lo que posibilita representar claramente las células Müller ggl marcadas con GFP y detectar células Müller más tenues. Ahora puede verificarse el traslape entre las células Müller tenues, ggl y las células bipolares marcadas con M cherry que se muestran en rojo.Los datos mostrados aquí sugieren que la ablación de células bipolares desencadena que los gliocitos de Müller generen la sustitución de las células perdidas. Esta interpretación concuerda con estudios recientes sobre la regeneración retiniana, que implican a los gliocitos de Müller como progenitores inducidos por lesión tanto en mamíferos como en peces. Esta técnica permite a los investigadores explorar los mecanismos que regulan la regeneración de tipos celulares específicos mediante la visualización de células madre en el pez cebra.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Aquí se describe un método para el montaje de embriones de pez cebra a largo plazo de imágenes, de dos fotones de imágenes y técnicas de daño a los tejidos, y de lapso de tiempo de imagen confocal.

De dos fotones axotomía y de lapso de tiempo de imagen confocal en embriones de pez cebra en vivo

El vídeo de la actualidad muestra un método que aprovecha las ventajas de la combinación de electroporación y la microscopía confocal para realizar las imágenes en vivo en cada células progenitoras neurales en el cerebro anterior pez cebra en desarrollo.

Time-lapse de imágenes en vivo de la relación clonal con células progenitoras neurales en el cerebro anterior El desarrollo de pez cebra

Fuente: Muto, A., et al. Ablación de una población neuronal mediante láser de dos fotones y su evaluación mediante imágenes de calcio y registro de comportamiento en larvas de pez cebra. J. Vis. Exp. (2018) En este video,  Se demuestra un procedimiento de ablación con láser de dos fotones, que permite la destrucción selectiva de neuronas fluorescentes en larvas de pez cebra inmovilizadas con agarosa. Las imágenes de alta resolución antes y después del procedimiento confirman un daño neuronal...

Ablación neuronal dirigida mediante microscopía de dos fotones en un pez cebra Larava

Fuente: Lahne, M., et.al. Cultivo de explantes de retina de pez cebra transgénico adulto para obtención de imágenes de células vivas mediante microscopía multifotónica. J. Vis. Exp. (2017)Este video muestra imágenes de células vivas de la migración nuclear glial de Müller en explantes de retina de pez cebra incrustados en agarosa después del daño de los fotorreceptores inducido por la luz. El factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) liberado por los fotorreceptores dañados activa las células...

Imágenes de células vivas de la migración nuclear glial de Müller durante la regeneración de la retina del pez cebra

Fuente: Williams, A. L., et al. Imágenes de lapso de tiempo multifotónico para visualizar el desarrollo en tiempo real: visualización de células de cresta neural migratorias en embriones de pez cebra. J. Vis. Exp. (2017)Este video muestra un protocolo de imágenes de lapso de tiempo multifotónico para visualizar la migración de las células de la cresta neural en un embrión de pez cebra en tiempo real con alta resolución.

Visualización de la migración de células de la cresta neural en un embrión de pez cebra mediante imágenes de lapso de tiempo multifotónicas

Aunque el sistema nervioso periférico (SNP) es capaz de reparación después de una lesión significativa, poco se sabe acerca de los mecanismos celulares y moleculares que rigen este fenómeno. El uso directo, el pez cebra transgénico y un ensayo de corte transversal del nervio reproducible, podemos estudiar los comportamientos de células gliales dinámicos durante la degeneración del nervio y la regeneración.

Motor transección del nervio y Time-lapse de imágenes de Conductas de células gliales en el pez cebra en vivo

la regeneración de la retina del pez cebra en su mayoría se ha estudiado el uso de las retinas fijos. Sin embargo, los procesos dinámicos tales como la migración nuclear interkinetic se producen durante la respuesta regenerativa y requieren imágenes de células vivas para investigar los mecanismos subyacentes. A continuación, describimos las condiciones de cultivo y de imagen para controlar interkinetic Migración Nuclear (INM) en tiempo real usando microscopía multifotónica.

Cultura de adulto pez cebra transgénico de retina explantes de Células vivas imágenes de microscopía multifotónica

el seguimiento en directo de la retina progenitores WT individuales en los antecedentes genéticos distintos permite la evaluación de la contribución de la señalización no autónomo celular durante la neurogénesis. Aquí, una combinación de gen desmontables, la generación de quimera a través de la transferencia de embriones y la imagen de lapso de tiempo confocal in vivo se utilizó para este propósito.

En vivo de imágenes de transgénicos de la Expresión Génica en el Estimado de retina progenitores en embriones de pez cebra quiméricos para estudiar celulares Influencias no autónomos

Se implementó una combinación de las técnicas de microscopía con largo excitación de fluorescencia de varios fotones de longitud de onda del láser ópticas avanzadas para capturar imágenes de alta resolución, tridimensionales en tiempo real de la migración de la cresta neural en Tg (sox10:EGFP) y los embriones de pez cebra de Tg (foxd3:GFP).

La proyección de imagen de lapso tiempo multi-Photon para visualizar el desarrollo en tiempo real: visualización de la migración de las células de cresta Neural en embriones de pez cebra

La imagen in vivo es una poderosa herramienta que se puede utilizar para investigar los mecanismos celulares subyacentes al desarrollo del sistema nervioso. Aquí describimos una técnica para el uso de la microscopía confocal de lapso de tiempo para visualizar un gran número de células etiquetadas en Brainbow multicolor en tiempo real dentro del sistema nervioso de pez cebra en desarrollo.

Visualización del cerebro en desarrollo en el pez cebra vivo mediante imágenes confocales de barco iris y lapso de tiempo

Aquí presentamos un método para obtener imágenes del cerebro embrionario del pez cebra in vivo hasta etapas larvales y juveniles. Este procedimiento microinvasivo, adaptado de enfoques electrofisiológicos, proporciona acceso a detalles celulares y subcelulares de neuronas maduras y se puede combinar con estudios optogenéticos y neurofarmacológicos para caracterizar la función cerebral y la intervención farmacológica.

Imágenes in vivo de tejido cerebral completamente activo en larvas y juveniles de pez cebra despiertos mediante la extirpación del cráneo y la piel

Aprende a realizar imágenes multicolor de tiempo real en pez cebra transgénico para estudiar la activación de células madre retinianas tras ablación neuronal selectiva. Este método permite visualizar la regeneración celular in vivo.

Multicolor Time-lapse de imágenes de pez cebra transgénico: Visualización de células madre retinianas activado por la ablación selectiva de células neuronales (Video) | JoVE Journal

Multicolor Time-lapse de imágenes de pez cebra transgénico: Visualización de células madre retinianas activado por la ablación selectiva de células neuronales

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