Multicolor Time-lapse de imágenes de pez cebra transgénico: Visualización de células madre retinianas activado por la ablación selectiva de células neuronales

La expresión de reporteros fluorescentes en animales transgénicos permite seguir las respuestas celulares a manipulaciones experimentales en modelos vivos de enfermedades. Aquí, se induce farmacológicamente la pérdida selectiva de células en peces cebra, mediante microscopía confocal multicolor de alta resolución. Se adquieren imágenes de las células diana y sus vecinas inmediatas antes, inmediatamente después y en intervalos de tiempo posteriores al tratamiento con fármacos. El análisis de imágenes demuestra la activación de poblaciones endógenas de células madre y la subsiguiente sustitución de las células diana durante la fase de recuperación.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología regenerativa, como cuáles son los mecanismos celulares y moleculares utilizados para regenerar tipos celulares específicos. Comience transfiriendo huevos transgénicos recolectados de apareamientos a una placa de Petri que contenga solución de 0,3 x danio a las 16 horas post fertilización. AÑADA PTU para inhibir la actividad de la tirosina ACE antes de cualquier evidencia de pigmentación en el tejido de interés. Si el embrión no es albino, incube los embriones a 28,5 grados Celsius.

Una vez que los reporteros sean evidentes, coloque la placa de Petri bajo un microscopio estéreo de aumento fluorescente y seleccione la expresión del transgén deseada. Antes de la obtención de imágenes, prepare una solución de montaje de agarosa de baja fusión al 0,5 % en medio para embriones y almacénela a 40 grados Celsius.

Añada trica y PTU si es necesario. Mezcle suavemente y devuelva a 40 grados Celsius. Anestesie los peces colocándolos en medio de embrión que contenga trica.

Durante aproximadamente tres minutos, los peces perderán respuesta. Al tocarlos con una micropipeta, aspire individualmente cada pez hacia una punta de pipeta recortada, en un volumen de aproximadamente 30 microlitros de solución anestésica. A continuación, invierta la pipeta y permita que el pez se asiente en el fondo.

Toque la punta con la solución de montaje y permita que se transfieran por gravedad. Tenga cuidado de no diluir el agro para que pueda reutilizarse. Deseche la solución anestésica restante del micropipeta.

Luego, utilizando la misma punta, transfiera el pez a una placa de Petri. En aproximadamente 30 microlitros de solución de montaje, oriente suavemente el pez de manera que la región de interés quede centrada en la gota de aerosol. Asegúrese de que el pez permanezca en la orientación deseada hasta que el aerosol se solidifique.

Se pueden montar varios peces en un solo plato de Petri si se desea. Después de que el agar se haya solidificado, transporte los peces al portaobjetos del microscopio confocal y agregue suavemente medio de embrión que contenga trica con o sin PTU al plato hasta que los peces queden completamente sumergidos. Abra el software de adquisición de imágenes y enfoque la región de interés para obtener una imagen óptima del detalle celular y/o molecular.

Utilice objetivos de larga distancia de trabajo con altas aperturas numéricas en el software. Seleccione los filtros de flora adecuados de la lista giratoria. Haga clic en configuración espectral y realice ajustes en los rangos de emisión.

Para obtener una separación limpia de las señales del reportero y maximizar las relaciones señal-ruido, seleccione el objetivo adecuado en el menú desplegable para asegurarse de que cualquier ajuste predefinido por software se modifique correctamente. Para enfocar los láseres y establecer los niveles de potencia, seleccione una salida de la tabla de búsqueda que muestre la saturación de píxeles para cada canal.

A continuación, ajuste la sensibilidad del detector para obtener la calidad de imagen deseada; aumente gradualmente la potencia del láser hasta que la intensidad de la imagen sea aceptable. Evite la saturación de píxeles en la región de interés y mantenga los niveles de láser tan bajos como sea posible para reducir los problemas de fotoblanqueo y fototoxicidad.

Asegúrese de que cada línea láser produzca una señal detectable únicamente en el canal apropiado activando y desactivando manualmente los láseres mientras se monitorean todos los canales de imagen. Si no se observa diafonía, todos los canales pueden adquirirse simultáneamente. A continuación, encuadre el área de interés utilizando las funciones de zoom y rotación.

Luego, configure la velocidad de escaneo y el tamaño de la imagen utilizando velocidades de escaneo más rápidas, lo que minimiza el tiempo de permanencia del láser y aumenta la resolución temporal. Ajuste el tamaño del paso en la dimensión Z de acuerdo con las necesidades del experimento. Aquí, se utiliza un tamaño de paso de 10 micrómetros para obtener siete secciones ópticas de tejido retiniano.

Una vez que se hayan determinado los ajustes adecuados, adquiera las imágenes de Zack y guárdelas. Luego, pase al siguiente pez. Se puede realizar un imagenado seriado con captura y liberación para rastrear los cambios celulares durante días sucesivos según las instrucciones del documento escrito adjunto.

Al realizar un experimento de imágenes con múltiples marcadores, lo mejor es utilizar fluoróforos que estén bien separados espectralmente; sin embargo, eso no siempre es práctico. Aquí mostramos un método sencillo de sustracción de imágenes utilizando el software de código abierto ImageJ para separar fluoróforos con perfiles de excitación y emisión superpuestos. En nuestro caso, GFP y YFP.

Las técnicas de obtención de imágenes en líneas de tiempo descritas en este video se han utilizado para monitorear células madre retinianas marcadas con GFP durante la ablación y regeneración de neuronas bipolares retinianas. Para realizar la separación espectral, recolecte imágenes utilizando modos de adquisición secuencial y configuraciones variables de filtros de barrera, lo que permite adquirir independientemente y separar parcialmente las fluorescencias superpuestas, respectivamente. Una vez que las imágenes han sido adquiridas, utilice la herramienta de importación ImageJ loci bio format para abrir los archivos de imagen y comenzar el proceso de importación. Arrastre el archivo de interés a la ventana de ImageJ.

Divida los canales en pilas individuales utilizando la casilla de verificación dividir canales en la ventana de importación para iniciar el complemento alinear tres TP. Haga clic en complementos, luego en alinear pilas. A continuación, alinee tres tp.

Las pilas deben alinearse para garantizar una sustracción adecuada. Seleccione la pila de referencia en el primer cuadro desplegable y la pila desalineada en el segundo. Marque las casillas usar origen relativo XY y usar origen relativo Z y haga clic en aceptar.

Para iniciar el proceso de alineación, haga clic en el botón de registro de volumen. Aparecerá una nueva ventana que contiene los parámetros de alineación. Haga clic en aceptar.

Esta sección ha sido optimizada por el distribuidor del complemento, por lo que no son necesarias modificaciones. Cuando finalice, aparecerá una ventana de pilas alineadas. Seleccione la salida desde la ventana alineada para abrir la ventana de salida.

Esta ventana también está optimizada y no requiere modificaciones. Haga clic en aceptar. Aparecerá una nueva pila en el área de trabajo con "alineado" añadido al final del título del archivo.

Para eliminar la interferencia cruzada utilizando la calculadora de imágenes, haga clic en Procesar y luego en Calculadora de imágenes. Seleccione en el cuadro desplegable de imagen uno la pila que se restará y la pila que se utilizará en la resta. En el cuadro desplegable de imagen dos, seleccione Restar en el cuadro desplegable de operación y haga clic en Aceptar.

Image J solicitará procesar la pila. Seleccione sí. Debería aparecer una nueva pila, que ha eliminado la interferencia entre los canales superpuestos.

Fusionar las pilas para recrear la misma estructura de imagen antes del alineamiento y la sustracción. Al seleccionar los canales fusionados en la ventana de herramientas de canales, la herramienta permite combinar hasta cuatro pilas en una pila hipercombinada. Finalmente, colorear los canales, ajustar el brillo y el contraste, y guardar los archivos como tiffs para examinar la pérdida específica y la regeneración de la nitro reductasa.

Células bipolares retinianas que expresan M cherry. Se tomaron series temporales de imágenes confocales en peces cebra individuales antes del tratamiento. Hay una expresión mosáica del reportero YFP marcado en la membrana en células bipolares controladas, mostrado en amarillo, y la proteína de fusión cherry nitroreductasa en bipolares dirigidas, mostrada en rojo.

El transgén CFP marcado en la membrana mostrado en cian proporciona información contextual sobre la mayoría de las demás células retinianas para mayor claridad. La misma imagen sin la señal CFP se muestra tras el tratamiento con metronidazol. Las células bipolares expresoras de nitroreductasa en rojo se pierden, mientras que las células bipolares controladas en amarillo se conservan.

Esto demuestra la naturaleza altamente específica de esta metodología de ablación. Nuevamente, se muestra la misma imagen sin CFP para mayor claridad. Cuando se elimina metro NIAZ, las células que expresan NTR regresan aquí.

Un ejemplo del método de sustracción G-F-P-Y-F-P se muestra en esta figura GFP etiquetada como Mueller. Las células GL se muestran en verde y las células bipolares etiquetadas con YFP se muestran en morado. La superposición entre las dos produce blanco para realizar la sustracción.

Primero, las imágenes de GFP y YFP deben alinearse. El proceso de sustracción permite entonces eliminar las células bipolares marcadas con YFP de la imagen de GFP, lo que posibilita representar claramente las células Müller ggl marcadas con GFP y detectar células Müller más tenues. Ahora puede verificarse el traslape entre las células Müller tenues, ggl y las células bipolares marcadas con M cherry que se muestran en rojo.

Los datos mostrados aquí sugieren que la ablación de células bipolares desencadena que los gliocitos de Müller generen la sustitución de las células perdidas. Esta interpretación concuerda con estudios recientes sobre la regeneración retiniana, que implican a los gliocitos de Müller como progenitores inducidos por lesión tanto en mamíferos como en peces. Esta técnica permite a los investigadores explorar los mecanismos que regulan la regeneración de tipos celulares específicos mediante la visualización de células madre en el pez cebra.