Multicolor Time-lapse de imágenes de pez cebra transgénico: Visualización de células madre retinianas activado por la ablación selectiva de células neuronales

La expresión de reporteros fluorescentes en animales transgénicos permite seguir las respuestas celulares a las manipulaciones experimentales en modelos vivos de enfermedades. Aquí, la pérdida celular selectiva es inducida farmacológicamente en peces cebra, confocales multicolor de alta resolución. Las imágenes de las células objetivo y las vecinas inmediatas se adquieren antes y después de inmediato, y sus intervalos espaciados después del tratamiento farmacológico demuestran la activación de las poblaciones de células madre endógenas y el posterior reemplazo de las células objetivo durante la fase de recuperación.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de la regeneración, como ¿Cuáles son los mecanismos celulares y moleculares utilizados para regenerar tipos celulares discretos? Comience transfiriendo los óvulos transgénicos recolectados de los apareamientos a una placa de Petri que contenga una solución de 0,3 x danio a las 16 horas después de la fertilización. AGREGUE PTU para inhibir la actividad de la tirosina ACE antes de cualquier evidencia de pigmentación en el tejido de interés. Si el embrión no es albino, incubar los embriones a 28,5 grados centígrados.

Una vez que los reporteros sean evidentes, coloque la placa de Petri bajo un microscopio fluorescente estereoscópico con zoom y clasifíquela para la expresión transgénica deseada. Antes de la toma de imágenes. Prepare una solución de montaje aerodinámico de bajo punto de fusión al 0,5% en medio embrionario y guárdela a 40 grados centígrados.

Agregue trica y PTU si es necesario. Mezclar suavemente y volver a 40 grados centígrados. Anestesiar a los peces colocándolos en un medio embrionario que contenga trica.

Durante aproximadamente tres minutos, el pez dejará de responder. Para tocar con una micropipeta, extraiga peces individuales en una punta de pipeta recortada en un volumen de aproximadamente 30 microlitros de solución anestésica. A continuación, invierta la pipeta y deje que los peces se asienten en el fondo.

Toque la punta con la solución de montaje y permita que se transfieran por gravedad. Tenga cuidado de no diluir el agro para que pueda ser reutilizado. Deseche la solución anestésica restante de la micropipeta.

Luego, usando la misma punta, transfiera el pescado a una placa de Petri. En unos 30 microlitros de solución de montaje, oriente suavemente el pez de modo que la región de interés se centre en la gota aerodinámica. Asegúrese de que el pez permanezca en la orientación deseada hasta que el aeros se solidifique.

Se pueden montar varios peces en una sola placa de Petri si se desea. Después de que el aeros se haya solidificado, transporte el pez a la etapa de microscopio confocal y agregue suavemente el medio embrionario que contenga trica más o menos PTU al plato hasta que los peces estén completamente sumergidos. Abra el software de adquisición de imágenes y concéntrese en la región de interés para obtener imágenes óptimas de los detalles celulares y/o moleculares.

Utilice objetivos de larga distancia de trabajo con aperturas numéricas altas en el software. Elija los cuatro flora apropiados de la lista de diales. Haga clic en la configuración espectral y realice ajustes en los rangos de emisión.

Para obtener una separación limpia de las señales reporteras y maximizar la relación señal/ruido. Seleccione el objetivo apropiado en el menú desplegable para asegurarse de que los ajustes preestablecidos definidos por software se ajusten correctamente. Para enfocar los láseres y establecer los niveles de potencia, seleccione una salida de la tabla de búsqueda que revele la saturación de píxeles para cada canal.

A continuación, configure la sensibilidad del detector para obtener la calidad de imagen deseada, aumente gradualmente la salida del láser hasta que la intensidad de la imagen sea aceptable. Evite la saturación de píxeles en la región de interés y mantenga los niveles de láser lo más bajos posible. Para reducir los problemas de fotoblanqueo y fototoxicidad.

Asegúrese de que cada línea de láser produzca una señal detectable solo en el canal apropiado encendiendo y apagando manualmente los láseres mientras monitorea todos los canales de imágenes. Si no hay diafonía evidente, todos los canales se pueden adquirir simultáneamente. A continuación, enmarque el área de interés utilizando las funciones de zoom y rotación.

A continuación, configure la velocidad de escaneo y el tamaño de la imagen utilizando velocidades de escaneo más rápidas, minimiza el tiempo de permanencia del láser y aumenta la resolución temporal. Establezca el tamaño del paso de la dimensión Z de acuerdo con las necesidades experimentales. En este caso, se utiliza un tamaño de paso de 10 micras para obtener imágenes de siete secciones ópticas de tejido de la retina.

Una vez que se hayan determinado los ajustes adecuados, adquiera las imágenes de Zack y guárdelas. Luego pasa al siguiente pez. Se pueden realizar imágenes de captura y liberación en serie para rastrear los cambios celulares durante días sucesivos de acuerdo con las instrucciones del documento escrito adjunto.

Al realizar un experimento de imágenes multireportero, es mejor usar pisos que estén bien separados, espectrales, sin embargo, eso no siempre es práctico. Aquí mostramos un método simple de sustracción de imágenes utilizando el software de código abierto image J para separar pisos con perfiles de excitación y emisión superpuestos. En nuestro caso, GFP e YFP.

Las técnicas de imagen de líneas de tiempo descritas en este video se han utilizado para monitorear las células madre de la retina marcadas con GFP durante la ablación y regeneración de las neuronas bipolares de la retina Para realizar la separación espectral, recopile imágenes utilizando modos de imagen secuenciales y configuraciones de filtro de barrera variable, que permiten que los pisos cuatro superpuestos se adquieran de forma independiente y parcialmente separados respectivamente. Una vez que se hayan adquirido las imágenes, use la importación de formas bio loci de ImageJ para abrir los archivos de imagen e iniciar la herramienta de importación. Arrastre el archivo de interés a la ventana de la imagen J.

Divida los canales en pilas individuales usando la casilla de verificación dividir canales en la ventana de importación para iniciar el complemento align three TP. Haz clic en los plugins y luego alinea las pilas. A continuación, alinee tres tp.

Las pilas deben estar alineadas para garantizar una resta adecuada. Seleccione la pila de referencia en el primer cuadro desplegable y la pila desalineada en el segundo. Marque las casillas usar origen relativo XY y usar origen relativo Z y haga clic en Aceptar.

Para iniciar el proceso de alineación, haga clic en el botón de registro de volumen. Aparecerá una nueva ventana que contiene los parámetros de alineación. Haga clic en Aceptar.

Esta sección ha sido optimizada por el distribuidor del plugin, por lo que no son necesarias modificaciones. Cuando termine, aparecerá una ventana de pilas alineadas. Seleccione la salida de la ventana alineada para abrir la ventana de salida.

Esta ventana también está optimizada y no necesita modificaciones. Haga clic en Aceptar. Aparecerá una nueva pila en el espacio de trabajo con alineado anexado al final del título del archivo.

Para eliminar la diafonía usando la calculadora de imágenes, haga clic en procesar y luego en calculadora de imágenes. Seleccione la pila que se va a restar en el cuadro desplegable de la imagen y la pila que se va a utilizar en la resta. En el cuadro desplegable de la imagen dos, seleccione restar en el cuadro desplegable de la operación y haga clic en Aceptar.

La imagen J pedirá procesar la pila. Seleccione Sí. Debería aparecer una nueva pila, que ha eliminado la diafonía entre los canales superpuestos.

Combine las pilas para recrear la misma estructura de imagen antes de la alineación y la resta. Al seleccionar canales combinados en la ventana de herramientas de canal, la herramienta permite la fusión de hasta cuatro pilas en una hiperpila. Por último, colorea los canales, ajusta el brillo y el contraste, y guarda los archivos como tiffs para examinar la pérdida y regeneración selectivas de nitro reductasa.

Cereza M que expresa células bipolares de la retina. Se tomó una serie temporal de imágenes confocales en peces cebra individuales antes del tratamiento. Hay expresión en mosaico del reportero YFP marcado con membrana en células bipolares controladas que se muestran en amarillo y proteína de fusión de cereza nitro reductasa en bipolares dirigidos que se muestran en rojo.

El transgén CFP marcado con membrana que se muestra en cian proporciona información contextual sobre la mayoría de las otras células de la retina para mayor claridad. Se muestra la misma imagen sin la señal CFP después del tratamiento con metronidazol. La nitro reductasa roja que expresa las células bipolares se pierde, mientras que las células bipolares controladas amarillas se salvan.

Esto demuestra la naturaleza altamente específica de esta metodología de ablación. De nuevo, se muestra la misma imagen sin CFP para mayor claridad. Cuando se elimina el NIAZ metropolitano, las células que expresan NTR regresan aquí.

Un ejemplo del método de resta G-F-P-Y-F-P se muestra en esta figura GFP etiquetada como Mueller. Las células GL se muestran en verde y las células bipolares marcadas con YFP se muestran en púrpura. La superposición entre los dos produce blanco para realizar la resta.

Primero se deben alinear las imágenes GFP e YFP. Luego, el proceso de sustracción permite que las células bipolares marcadas con YFP se eliminen de la imagen GFP, lo que permite que Mueller ggl marcado con GFP se represente limpiamente y se detecten las células Mueller más tenues. Ahora se puede verificar la superposición entre las células bipolares marcadas con Mueller, ggl y M que se muestran en rojo.

Los datos que se muestran aquí sugieren que la ablación de células bipolares desencadena mullar ggl para reemplazar las células perdidas. Esta interpretación está en consonancia con estudios recientes sobre la regeneración de la retina, que implican a Mueller Ggl como progenitores inducidos por lesiones tanto en mamíferos como en peces. Esta técnica permite a los investigadores explorar los mecanismos que regulan la regeneración de tipos específicos de células a través de la visualización de células madre en el pez cebra.