Name: Un método para el aislamiento de los islotes murinos y Trasplante Renal subcapsular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-13T11:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 42 s
Description: Aprenda el aislamiento de islotes pancreáticos en ratones y su trasplante subcapsular renal para investigar tratamientos contra la diabetes tipo 1. Este método permite evaluar la función del injerto mediante monitoreo de glucosa.

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<li>Gores, P. F., Rabe, F., Sutherland, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+survival+of+intraportal+versus+subrenal+capsular+transplanted+islet+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Prolonged survival of intraportal versus subrenal capsular transplanted islet allografts.</a> Transplantation. 43, 747-749 (1987).</li>
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<li>Inoue, M., Maeno, T., Hatchell, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+allografted+pancreatic+islets+in+the+subretinal+space+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Res%22%5BJournal%5D)">Survival of allografted pancreatic islets in the subretinal space in rats.</a> Ophthalmic Res. 35, 48-53 (2003).</li>
</ol>

En los apartados anteriores, se describen los pasos detallados para el aislamiento y el transplante de los islotes pancreáticos de ratón. En este sentido, destacar brevemente los pasos que son críticos para el éxito de los procedimientos. 1. Aislamiento de islotes Los pasos clave son la identificación de un momento óptimo digestión enzimática (1,4), el posicionamiento de la pinza hemostática sobre la abertura duodenal del conducto biliar común (2.2.3), canulación del conducto biliar común (2,3), una agitación vigorosa del páncreas después de los 37 ° C digerir (3,2), y la eliminación de la contaminación de células exocrinas (3.3.7 y 3.3.16). Estos pasos tienen una gran influencia en la calidad, el rendimiento y la pureza de los islotes. Quizás el paso más difícil técnicamente es la canalización del conducto biliar común. En muchos ratones, el conducto biliar común puede ser difícil de visualizar debido a la fascia que rodea. Por lo tanto, es común que los intentos para canalizar el resultado del conducto biliar común en la penetración del tejido facial solamente. En estos casos, la Liberase comienza a llenar el tejido conectivo circundante y no perfusión del páncreas. Si esto se detecta, detener el flujo de Liberase y la posición de la aguja para que penetre en el lumen de la vía biliar. Con la práctica, es posible identificar rápidamente la posición óptima para la colocación de la aguja y para completar la canalización sin dañar el conducto friable. 2. El trasplante de islotes Los pasos críticos son la inducción de la diabetes con STZ (5,1) y la prestación eficiente de los islotes de la bolsa subcapsular (5.3.14-5.3.16). STZ es un análogo de la glucosa natural que es selectivamente tóxica para las células de la secreción de insulina de las células β de los islotes 9. Sin embargo, esta toxicidad selectiva se produce en un rango de concentraciones relativamente estrecho. Prueba de ello es el hecho de que altas dosis de STZ puede resultar en un rápido (2-3 días) letalidad en ausencia de hiperglucemia. Por lo tanto, se debe tener cuidado para identificar la dosis óptima de STZ de la cepa y la edad de los ratones se utiliza antes de los experimentos a gran escala se inició. La entrega física de los islotes de la bolsa subcapsular es también un paso clave. Para lograr resultados consistentes, es imprescindible para reducir al mínimo la pérdida de islotes en su entrega. Esto puede ocurrir si hay defectos o roturas en la cápsula renal que cubre la bolsa o si el volumen inyectado es demasiado grande. El daño a la cápsula se puede evitar la manipulación suave y cuidadosa, y mediante el uso de la sonda de cristal liso para preparar la bolsa subcapsular. Además, el volumen de inyección puede ser minimizado con la extracción cuidadosa del sobrenadante en el paso 5.3.6.3. Si se retira el sobrenadante hasta el nivel de los islotes sedimentado, normalmente hay más que suficiente espacio en la bolsa subcapsular a cabo 400 a 500 islotes. Sin embargo, si el volumen de inyección es demasiado grande, los islotes son más propensos a fugas de la bolsa durante el proceso de trasplante, poniendo en peligro la reproducibilidad del experimento. Dentro de este protocolo, es posible modificar algunos de los pasos y aún así lograr resultados satisfactorios. Estos incluyen los siguientes: (a) el uso de una enzima diferente para digerir el páncreas, (b) un método diferente para la entrega de la enzima en el páncreas, (c) el uso de un continuo de Ficoll-diatrizoato de sodio (FSD) gradiente en lugar de la densidad de un solo paso Histopaque1077, y (d) trasplante de islotes a otros lugares de la subcapsule riñón. <ol class="lalpha"><li> En este protocolo, Liberase se utiliza para debilitar a los contactos célula-célula en el páncreas. Liberase es esencialmente una mezcla altamente purificada de colagenasas que han demostrado ser útiles en la liberación de los islotes del páncreas. No obstante, las colagenasas menos purificada son capaces de lograr un resultado similar. Por lo tanto, es posible utilizar diferentes preparados enzimáticos disponibles en el mercado para digerir el páncreas, siempre y cuando la condición de la digestión se ha optimizado para conseguir una calidad de islotes de alta, el rendimiento y la pureza. </li><li> También es posible para digerir el páncreas sin perfusión ductal de la enzima. La entrega de Liberase través del conducto biliar común permite una máxima exposición de la zona del páncreas superficie de la enzima. Esto da como resultado una digestión más aún del páncreas y una mayor liberación de los islotes intactos. Sin embargo, otras medidas para aumentar la superficie del páncreas para que la enzima se puede utilizar. Por ejemplo, picado el páncreas antes de incubar en Liberase o la inyección directa de Liberase través de la cápsula del páncreas puede ser usado para aislar los islotes. Sin embargo, ningún otro método de entrega Liberase es tan eficaz como la perfusión a través del conducto biliar común. Por lo tanto, la inyección de picado o directa debe reservarse como un último recurso, si el conducto biliar común está dañado y no perfusable. </li><li> Un método alternativo para la separación de los islotes de las células exocrinas implica lael uso de un gradiente de FSD en lugar de Histopaque1077 10. La separación eficiente de los islotes de células exocrinas en este protocolo se debe en parte a un diferencial de densidad entre los dos tipos de células. Histopaque1077 tiene una densidad de 1,0771 g / ml a 25 ° C. A esta temperatura, Histopaque es más denso que los islotes, pero menos densa que las células exocrinas. Por lo tanto, bajo la fuerza de centrifugación, Histopaque1077 gránulos de las células exocrinas, levantando los islotes a la superficie. En principio, cualquier otra sustancia con una densidad que puede separar los islotes de células exocrinas se pueden utilizar en este paso y el gradiente de FSD es una de esas sustancias. </li><li> Con respecto a la ubicación de los islotes del trasplante, la cápsula renal utilizados en este protocolo es uno de los pocos lugares posibles. Mientras que el subcapsule riñón es el sitio más frecuente de trasplante en ratones, el trasplante de otros sitios se han encontrado para ser eficaz y que incluyen la vena porta hepática, espacio subretiniano, testículos, almohadilla de grasa del epidídimo, el bazo, páncreas y hasta 11-14. Cada uno de estos lugares tiene sus propias ventajas y desafíos. Por lo tanto, la selección de un sitio para el trasplante de islotes debe ser determinado por las preguntas formuladas y las circunstancias específicas de los experimentos. </li></ol> Se cree que las estrategias que se pueden superar las limitaciones en el trasplante de islotes dramáticamente mejorar su potencial terapéutico. Por lo tanto, el uso de un modelo murino que se detallan en este protocolo ofrece un enfoque atractivo para la identificación de tales estrategias.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>Liberasa TL</td><td>Reactivo</td><td>Roche Group</td><td>05401020001</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino fetal</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque1077</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sodio</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>Estreptozotocina</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-0130</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>Isóflurano</td><td>Reactivo</td><td>Vedco, Inc.</td><td>ISOSOL</td><td></td></tr><tr><td>Tubos capilares de vidrio</td><td>Equipo</td><td>Fisher Scientific</td><td>22362574</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de insulina</td><td>Equipo</td><td>BD Biosciences</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de jeringa de calibre 27</td><td>Equipo</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa Hamilton n.º 1702</td><td>Equipo</td><td>Fisher Scientific</td><td>14813133</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de 10 cm</td><td>Equipo</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875712</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de 6 cm</td><td>Equipo</td><td>Fisher Scientific</td><td>07770212</td><td></td></tr><tr><td>Sutura 6-0</td><td>Equipo</td><td>Ethicon Inc.</td><td>8726H</td><td></td></tr><tr><td>Tubo flexible PE 50</td><td>Equipo</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9083963</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa desechable de 5 ml</td><td>Equipo</td><td>BD Biosciences</td><td>309603</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de 50 ml</td><td>Equipo</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de 15 ml</td><td>Equipo</td><td>BD Biosciences</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Malla de nailon de 0,1 mm</td><td>Equipo</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Malla de alambre de 0,419 mm</td><td>Equipo</td><td>Newark Wire Cloth Company</td><td>0300241</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora con baño de agua</td><td>Equipo</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-5</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Equipo</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Stemi SV6</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Equipo</td><td>Nikon Instruments</td><td>TMS</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora para cultivo celular</td><td>Equipo</td><td>Napco</td><td>6300</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de disección</td><td>Equipo</td><td>Kent Scientific</td><td>INS14393</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de McPherson-Vannas</td><td>Equipo</td><td>Kent Scientific</td><td>INS500260</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas curvas</td><td>Equipo</td><td>Kent Scientific</td><td>INS15915</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas hemostáticas</td><td>Equipo</td><td>Kent Scientific</td><td>INS 500451</td><td></td></tr><tr><td>Nebulizador de isóflurano</td><td>Equipo</td><td>Smiths Medical</td><td>ISOTech 4 OHMEDA</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga con rotor oscilante</td><td>Equipo</td><td>Dupont &amp;#8211; Sorvall</td><td>RT6000D</td><td></td></tr><tr><td>Rotor oscilante</td><td>Equipo</td><td>Dupont &amp;#8211; Sorvall</td><td>H1000B</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de pH</td><td>Equipo</td><td>Mettler Toledo</td><td>09313509</td><td></td></tr><tr><td>Puntas para carga de geles</td><td>Equipo</td><td>Fisher Scientific</td><td>05408151</td><td></td></tr><tr><td>Puntas p200</td><td>Equipo</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>111-0730</td><td></td></tr></tbody></table>

un método para el aislamiento de los islotes murinos y trasplante renal subcapsular

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Desde los primeros trabajos pioneros de Ballinger y Reckard lo que demuestra que el trasplante de islotes de Langerhans en roedores diabéticos podrían normalizar sus niveles de glucosa en la sangre, el trasplante de islotes se ha propuesto ser un tratamiento potencial para la diabetes tipo 1 1,2. Más recientemente, los avances en trasplante de islotes humanos han fortalecido aún más este punto de vista 1,3. Sin embargo, dos limitaciones importantes evitar el trasplante de islotes de ser una realidad clínica generalizada: (a) la necesidad de un gran número de islotes por paciente, lo cual reduce considerablemente el número de beneficiarios potenciales, y (b) la necesidad de inmunosupresión pesado, que afecta de manera significativa la población pediátrica de los pacientes debido a su vulnerabilidad a la inmunosupresión a largo plazo. Las estrategias que se pueden superar estas limitaciones tienen el potencial para mejorar la utilidad terapéutica del trasplante de islotes. El trasplante de islotes bajo la cápsula renal ratón es un modelo ampliamente aceptado para investigar varias estrategias para mejorar el trasplante de islotes. Este experimento requiere el aislamiento de islotes de alta calidad y la implantación de islotes a los destinatarios de la diabetes. Ambos procedimientos requieren pasos de la cirugía que puede ser mejor demostrado por el vídeo que por texto. En este sentido, el documento los pasos detallados para estos procedimientos por el vídeo y el protocolo escrito. También brevemente los diferentes modelos de trasplante: singénico, autoinmunes alogénico, singénico y alogénico autoinmunes.

El trasplante de islotes aislados se ha propuesto ser un tratamiento potencial para la diabetes tipo 1. Aquí se describe un método para aislar los islotes de páncreas de ratón y trasplantarlas en el espacio subcapsular del riñón.

Un método para el aislamiento de los islotes murinos y Trasplante Renal subcapsular

Desde los primeros trabajos pioneros de Ballinger y Reckard, que demostraron que el trasplante de islotes de Langerhans en roedores diabéticos podía normalizar...

El trasplante de islotes pancreáticos se ha propuesto como un tratamiento potencial para la diabetes tipo uno. Sin embargo, dos limitaciones importantes impiden que se convierta en una realidad clínica generalizada. En primer lugar, se necesita un gran número de islotes por receptor.Dado que los islotes se obtienen de donantes de órganos, el número de receptores potenciales está severamente limitado. El trasplante secundario requiere un tratamiento de por vida con inmunosupresores potentes, lo que pone al paciente, especialmente a la población pediátrica, en riesgo de desarrollar malignidades, infecciones e insuficiencia renal. El trasplante de islotes bajo la cápsula renal del ratón se realiza para investigar estrategias que mejoren los resultados del trasplante clínico.Islotes aislados de ratones donantes sanos se agrupan en grupos y se preparan para trasplante. Luego, los islotes se trasplantan al espacio subcapsular del riñón. En ratones receptores diabéticos, la función del injerto de islotes se evalúa mediante el monitoreo de los niveles de glucosa en sangre, lo que revela que aproximadamente entre 250 y 350 islotes restaurarán la euglicemia en un ratón receptor de 20 gramos dentro de las 24 horas posteriores al trasplante.La demostración visual de este método es fundamental respecto a los pasos para la canulación. Es difícil aprender la identificación del conducto biliar común y la transferencia de los ojetes al espacio subcapsular del riñón. Estos pasos requieren la identificación de estructuras tisulares, manos firmes y el uso de una técnica que minimice el daño tisular.Coloque un ratón sacrificado en posición supina sobre una toalla de papel bajo el microscopio de disección y rocíe el abdomen con etanol al 70%. Use tijeras para abrir el abdomen con una incisión en forma de V desde la región púbica hasta las dos patas delanteras. El ratón se encuentra debajo del microscopio de disección.Colóquelo con la cabeza orientada hacia el observador. Localice la entrada duodenal del conducto biliar común con una pinza hemostática, la abertura duodenal del conducto biliar común. La pinza hemostática debe colocarse de manera que, al comprimirse, siga exactamente el borde entre el páncreas y el intestino.Aquí se demostrarán dos métodos para canular el conducto biliar. El método de mano libre y el método con ayuda de fórceps para canular el conducto biliar. Utilizando el método de mano libre, tire del hemostato sujeto al duodeno alejándolo de la cabeza del ratón hacia la cola, de modo que el conducto biliar común quede tenso.Existe una confluencia en el conducto biliar cerca del hígado donde se unen la bilis que drena desde la vesícula biliar y las enzimas provenientes del hígado. Antes de entrar en los intestinos, tense el conducto biliar para exponer el interior de la posición en forma de V. Utilice una aguja curvada de calibre 27 conectada a una jeringa de cinco mililitros, de modo que la aguja atraviese justo la posición en V y canule directamente la porción inferior del conducto. Deslice la aguja varios milímetros más allá del extremo del bisel para evitar el reflujo hacia el hígado y la vesícula biliar.Una vez que la canulación sea exitosa, perfundir el páncreas dispensando dos mililitros de liasa desde la jeringa. Observar la expansión del páncreas sobre el estómago como indicación de una canulación óptima. Alternativamente, se puede canular el conducto biliar.Utilizando el método de la fórceps quística. Tire del hemostato C sujeto al duodeno alejándolo de la cabeza del ratón hacia la cola, de modo que el conducto biliar común se tense. Luego, utilizando una aguja curvada de calibre 27 conectada a una jeringa de cinco mililitros, punzón la fascia por debajo del conducto biliar común cerca del hígado.Utilice la aguja para separar la fascia del conducto con la aguja aún en su lugar. Deposite el hemostato y tome un par de pinzas. Use un brazo de las pinzas abiertas para sostener el conducto biliar en el lugar donde la aguja ha separado la fascia, mientras tira del conducto y las pinzas hacia adelante.Deslice la aguja dentro del conducto utilizando la pinza como tope. Una canulación exitosa se indica por una expansión uniforme de la región del páncreas situada encima del estómago. Una vez que se haya perfundido el páncreas, retire el hemostato del duodeno.Luego, use la pinza para levantar el duodeno y utilice un segundo par de pinzas para separar el páncreas de los intestinos. A continuación, tire del páncreas para separarlo de la parte superior del estómago y del bazo. Finalmente, levante el páncreas fuera del abdomen y córtelo para separarlo de las conexiones restantes de la fascia con el intestino, el estómago y el bazo.Coloque el páncreas en un tubo cónico de 50 mililitros y colóquelo en hielo. Incube el páncreas a 37 grados Celsius según las instrucciones del protocolo escrito adjunto. Después de la incubación, agregue 20 mililitros de medio a los tubos y disocie el tejido agitando los tubos vigorosamente 40 veces en 10 segundos.Este paso es fundamental para una recuperación óptima de las violetas. Centrifugar las células a 800 rotaciones por minuto. Re-suspender en 15 mililitros de medio y concentrar las muestras.Vierta la suspensión a través de una malla de alambre de 0,419 milímetros y diríjala hacia un tubo cónico nuevo de 50 mililitros. Enjuague el primer tubo con 10 mililitros adicionales de medio que contenga 10% de suero bovino fetal y viértalo a través de la malla de alambre. Pelletee las células mediante centrifugación, redispersa el precipitado en cinco mililitros de medio Hís Opaco 10 77 a temperatura ambiente. Luego, vortexee suavemente durante varios segundos, agregue cinco mililitros adicionales de Hís Opaco alrededor de la parte interna del tubo para lavar los restos adheridos a la pared del tubo. Pipetee lentamente para superponer 10 mililitros de RPMI libre de suero por la pared del tubo a una velocidad de un mililitro por cada 10 segundos.Debe observarse una interfaz nítida. A continuación, centrifugar las muestras en una centrífuga con rotor de cestas oscilantes a 20 grados Celsius y 900 veces la gravedad durante 20 minutos, con una aceleración muy lenta y sin frenado tras la centrifugación. Las islitas se separarán de las células exocrinas utilizando una pipeta serológica desechable de 10 mililitros. Transferir las islitas desde la interfaz del medio histo Paque a un tubo cónico nuevo de 50 mililitros.En este punto, se pueden agrupar varios tubos para eliminar el residuo de los orificios, rellenar los tubos opacos con medio que contenga suero y centrifugar los tubos durante dos minutos a 800 rotaciones por minuto para obtener el pellet de islotes. Luego, volver a suspender los islotes en medio fresco. Repetir este paso al menos dos veces.Reus.Suspenda el pellizco en cinco mililitros de medio. Coloque un filtro de células de nailon de 0.1 milímetros boca abajo sobre un tubo cónico de 15 mililitros. Pase la suspensión celular mediante pipeta a través del filtro para recolectar los orificios.Luego, enjuague el tubo de 50 mililitros con seis mililitros adicionales de medio y páselos a través del filtro. Coloque una gota de tres mililitros de medio en una placa de Petri de 10 centímetros. Invierta el filtro celular y sumérjalo en la gota de medio para recoger los orificios; pipetee cinco a siete mililitros adicionales de medio de cultivo a través del filtro hacia la placa de Petri.Para recoger los orificios restantes del colador bajo un objetivo de cuatro aumentos, tome los orificios individualmente con una pipeta P200 y transfiéralos a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Estas imágenes muestran orificios aislados de ratones C57BL/6 de 12 semanas de edad. La pureza y calidad de los orificios pueden estimarse microscópicamente al finalizar el procedimiento de aislamiento.Por ejemplo, las dos imágenes mostradas aquí muestran un campo representativo donde hay presencia de restos celulares y contaminación por células exocrinas. Al seleccionar islotes para un experimento, evite escoger células exocrinas contaminantes o islotes que parezcan estar en mal estado. Los islotes con centros necróticos se encuentran en mal estado, como se muestra en esta figura tomada 24 horas después del aislamiento; los centros necróticos no serán visibles inmediatamente después del aislamiento.Los orificios que son células descamadas son inevitables y pueden utilizarse en trasplantes de orificios, como se observa en este video de lapso de tiempo de 24 horas. Inmediatamente después del aislamiento, se desarrollan centros necróticos dentro de muchos de los orificios. Estos centros necróticos parecen ser expulsados del orificio cerca del final de la grabación, durante la selección de los orificios.Agrúpelos de manera que cada tubo tenga una distribución equilibrada en cuanto a calidad y tamaño de los ojales. Por ejemplo, cada grupo de 15 ojales podría contener cuatro ojales grandes, seis ojales medianos y cinco ojales pequeños. Coloque el tubo en hielo; los ojales pueden usarse inmediatamente para trasplante o pueden manipularse.Antes de usar. Coloque una punta estéril para carga de geles en la abertura de un tubo microfusible de 1,5 mililitros de manera que se forme una curva suave, creando una forma de U en el extremo estrecho de la punta. Ambas aberturas de la punta deben quedar orientadas directamente hacia arriba, fuera del tubo microfusible.Retire suavemente un tubo de ojales del hielo. Asegúrese de que todos los ojales se hayan sedimentado en el fondo del tubo. Utilizando una pipeta P200, recoja suavemente los ojales en un volumen mínimo desde el fondo del tubo y transfiéralos a la punta curva preparada.Una vez que los ojetes hayan sedimentado, retire la mayor cantidad posible de medio de la punta aspirando el medio a través de la abertura grande de la punta para carga de geles que contiene los ojetes, utilizando una punta para carga de geles nueva conectada a una pipeta P200. Conecte el extremo no biselado del tubo a la abertura estrecha de la punta para carga de geles que contiene los islotes. Luego, conecte la punta a una pipeta P200 y empuje suavemente los islotes dentro del tubo.A continuación, conecte el extremo no biselado del tubo PE 50 a la aguja de una jeringa Hamilton de 25 microlitros. Con el émbolo retirado, presione el émbolo de la jeringa hasta que los ojales estén aproximadamente a 0,5 centímetros de la abertura biselada. Coloque la jeringa a un lado para que los ojales se asienten en una sola masa cerca de la abertura biselada del tubo mientras se prepara el riñón para recibir los ojales.Prepare el sitio quirúrgico cortando el pelo y frotando la piel con Betadine alternando con alcohol isopropílico al 70 % tres veces. Comience el procedimiento de trasplante del ojal realizando una compresión en el dedo del pie para confirmar la anestesia en el ratón receptor. Coloque el eje de una varilla de vidrio directamente debajo del ratón y por debajo del riñón, perpendicular a la médula espinal.Luego, localice el riñón a través de la piel y coloque un campo quirúrgico estéril. Una vez localizado el riñón, use tijeras McFerson banis para hacer una incisión de dos centímetros a través de la dermis directamente encima de él, perpendicular a la médula espinal. Esta incisión expondrá la pared peritoneal con las tijeras.Realice una incisión de un centímetro a través de la pared peritoneal en la misma dirección que el corte a través de la capa dérmica, utilizando el eje de la varilla de vidrio como tope, y fuerce el riñón a través de la abertura peritoneal presionando hacia abajo sobre la superficie adyacente. Humedezca la superficie del riñón expuesto con PBS estéril frío con hielo utilizando un aplicador de algodón humedecido. Repita el paso cada pocos minutos según sea necesario para evitar que la cápsula del riñón se seque.Con una aguja de 27 gauge, realice una incisión de 0,2 centímetros a través de la cápsula renal a lo largo de la superficie anterior del riñón. Desplazándose desde el lado lateral izquierdo hacia el lado lateral derecho, inserte un tubo capilar de vidrio estirado con llama. Introduzca el tubo a través de la incisión realizada previamente y muévalo en dirección posterior a lo largo de la superficie lateral dorsal del riñón.Para crear una bolsa entre la cápsula renal y el parénquima renal, mueva los orificios en la jeringa Hamilton de 25 mililitros preparada hasta el borde extremo de la abertura biselada del tubo flexible. Luego inserte el borde biselado con la cara hacia arriba en la bolsa subcapsular. El borde largo está en contacto con el parénquima renal.Mueva el tubo hasta el extremo más posterior de la cápsula. Luego, transfiera lentamente los ojales desde el tubo de PE 50 al interior del saco subcapsular presionando el émbolo de la jeringa. A medida que los ojales llenan el saco, retire lentamente el tubo flexible para crear más espacio.Tras retirar el tubo del saco, deslice la sonda de vidrio a lo largo de la superficie externa del riñón, de anterior a posterior, para empujar suavemente las aberturas hacia el extremo proximal del saco. Utilizando fórceps de brazo curvado, levante el revestimiento peritoneal adyacente a la abertura hecha para el riñón. Luego, use un aplicador de algodón humedecido con PBS para empujar suavemente el riñón de vuelta hacia la cavidad peritoneal.Cierre el ratón aplicando suturas en la pared peritoneal y grapas quirúrgicas en la capa dérmica. Devuelva el ratón a su jaula y realice un monitoreo. Para la recuperación, se debe proporcionar agua con acetominofeno para el intestino del ratón.Ojitos de ratón C aislados. Utilizando los métodos descritos en este video, se trasplantó una dosis curativa en ratones C57BL/6 alogénicos. Se monitorearon los niveles de glucosa en sangre sin ayuno a partir del día uno posterior a la cirugía.El rechazo se observa alrededor del día 17 en ratones receptores de 20 gramos que recibieron 300 islotes de un donante alogénico aquí. La recuperación se monitoreó en ratones que recibieron ya sea 150 islotes o 300 islotes de donantes singénicos. No se observa rechazo en estos trasplantes, ya que los islotes provienen de donantes singénicos.La dosis de islotes administrada mide la función principal de los islotes inmediatamente después del trasplante. Si bien se observó una recuperación marginal con 150 islotes, se observó una recuperación completa cuando se trasplantaron 300 islotes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar los pasos críticos necesarios para aislar los islotes de ratón y trasplantarlos en el espacio subcapsular del riñón.Con la práctica, desarrollará la capacidad de cateterizar rápidamente el conducto biliar común, que es el paso más difícil de este protocolo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

El protocolo fue desarrollado para ofrecer de forma limpia y fácil de islotes o células bajo la cápsula renal de ratones. Las células se concentran en pastillas en el tubo final utilizado para trasplantar las células en la cápsula renal. La facilidad de esta técnica reduce el estrés de las células y el ratón.

El trasplante de islotes pancreáticos en la cápsula renal de ratones diabéticos

El trasplante renal en ratones es un procedimiento técnicamente difícil que requiere una cuidadosa atención post-operatoria y el tratamiento para el éxito.

Procedimiento murino Trasplante Renal

En este video, describimos un procedimiento para infundir células de los islotes pancreáticos en la vena porta hepática, seguido de la aplicación de espuma de gel para prevenir con éxito el sangrado. La hemorragia postoperatoria es una causa frecuente de alta mortalidad durante el trasplante de islotes.

Modelo murino de trasplante de islotes: un método quirúrgico para infundir islotes pancreáticos en la vena porta y prevención de la hemorragia postoperatoria

Un nuevo enfoque de la combinación de trasplante intraocular y microscopía confocal permite longitudinal, no invasiva imágenes en tiempo real con una sola célula de resolución dentro de los tejidos...

Trasplante en la cámara anterior del ojo para Longitudinal, no invasiva<em&gt; En vivo</em&gt; Imagen con una sola célula de resolución en tiempo real

El objetivo de este manuscrito es describir los pasos necesarios para realizar un trasplante de riñón en un ratón, prestando especial atención a los detalles de la anastomosis arterial.

Riñón murino Trasplante Técnica

Este protocolo demuestra el aislamiento de los islotes murinos y la siembra en un andamio decelularizado. Los islotes soportados por el andamio fueron trasplantados en la almohadilla de grasa epididimal de ratones diabéticos inducidos por estreptozotocina (STZ). Los islotes sobrevivieron en el sitio del trasplante e invirtieron la condición hiperglucémica.

Transplante de islotes en el cojín de grasa epididimal de ratones diabéticos

Se introduce un método para el trasplante omental de islotes en un ratón. Los islotes aislados se mezclan con hidrogel y la mezcla se coloca en la bolsa omental de un ratón diabético. Luego, se controla la glucosa en la sangre, y se realiza el análisis inmuno-histoquímico.

Un método para el trasplante de islotes pancreáticos para el epiplón en ratón

Trasplante de islotes pancreáticos es una manera de lograr normoglycemia en diabetes tipo 1. Este artículo se centra en la técnica de trasplante vía intraportal para mantener niveles normales de glucosa en ratones diabéticos.

Intraportal trasplante de islotes pancreáticos en modelo murino

Proporcionamos un método simple y eficiente para trasplantar 2'-deoxyguanosine tratado E18.5 timo en la cápsula renal de un ratón desnudo. Este método debe ser un iida en el estudio de la función de células epiteliales timmicas y la maduración de las células T.

Trasplante subcapsular renal de timo embrionario murino tratado con 2'-desoxiguanosina en ratones desnudos

En este protocolo, se describe un método de aislamiento de islotes murinos y trasplante en el tejido adiposo blanco subcutáneo inguinal. Los islotes murinos sinémicos aislados se trasplantan en un receptor murino utilizando un hidrogel de membrana del sótano. Se controla el nivel de glucosa en sangre de los receptores y se realiza un análisis histológico de los injertos de islos.

Modelo de trasplante de tejido adiposo blanco subcutáneo inguinal (ISWAT) de islotes murinos

Proporcionamos un protocolo mínimamente invasivo para el trasplante intramuscular de islotes de células madre pancreáticas derivadas de células madre humanas en ratones inmunodeficientes, para implantación in vivo y análisis posteriores.

Trasplante intramuscular de células endocrinas pancreáticas derivadas de células madre pluripotentes humanas en ratones

Aprenda el aislamiento de islotes pancreáticos en ratones y su trasplante subcapsular renal para investigar tratamientos contra la diabetes tipo 1. Este método permite evaluar la función del injerto mediante monitoreo de glucosa.

Un método para el aislamiento de los islotes murinos y Trasplante Renal subcapsular

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