Un método para el aislamiento de los islotes murinos y Trasplante Renal subcapsular

El trasplante de ojales se ha propuesto como un tratamiento potencial para la diabetes tipo uno. Sin embargo, dos grandes limitaciones impiden que sea una realidad clínica generalizada. En primer lugar, se necesita un gran número de ojales por destinatario.

Dado que los ojales se obtienen de donantes de órganos, el número de receptores potenciales es muy limitado. El segundo trasplante requiere un tratamiento de por vida con inmunosupresores fuertes, lo que pone al paciente, especialmente a la población pediátrica, en riesgo de malignidad, infección e insuficiencia renal. El trasplante de ojales debajo de la cápsula de riñón de ratón se realiza para investigar estrategias para mejorar los resultados clínicos del trasplante.

Ojales aislados de ratones donantes sanos clasificados en grupos y preparados para el trasplante. A continuación, los ojales se trasplantan al espacio subcapsular del riñón. En ratones receptores diabéticos, la función del injerto de ojales se evalúa mediante el control de los niveles de glucosa en sangre, que revelan que aproximadamente 250 a 350 ojales restaurarán la glucemia en un ratón receptor de 20 gramos dentro de las 24 horas posteriores al trasplante.

La demostración visual de este método es fundamental en cuanto a los pasos para la canulación. El conducto biliar común y la transferencia de los ojales al espacio subcapsular del riñón son difíciles de aprender. Estos pasos requieren una identificación de las estructuras de los tejidos, manos firmes y el uso de técnicas que minimicen el daño tisular.

Coloque un ratón sacrificado en posición supina sobre una toalla de papel en el endoscopio de disección y rocíe el abdomen con etanol al 70%. Use tijeras para abrir el abdomen con una incisión en V desde la región púbica hasta ambas patas delanteras. El ratón está debajo del ámbito de disección.

Colócalo con la cabeza apuntando hacia el observador. Localice la entrada duodenal del conducto biliar común con una pinza hemostática, la abertura duodenal del conducto biliar común. El hemostático debe colocarse de tal manera que, cuando se comprima, corra exactamente a lo largo del borde del intestino pancreático.

Aquí se demostrarán dos métodos para canular el conducto biliar. El método de la mano libre y el método de asistencia de fórceps para canular el conducto biliar. Usando el método de la mano libre, tire del hemostático sujetado en el duodeno lejos de la cabeza del ratón hacia la cola para que el conducto biliar común se tense.

Hay una confluencia en el conducto biliar cerca del hígado donde la bilis que drena de la vesícula biliar y las enzimas del hígado se unen Antes de ingresar a los intestinos, apriete el conducto biliar para exponer el interior de la posición V. Una aguja doblada de calibre 27 unida a una jeringa de cinco mililitros para que la aguja se deslice a través de la V y canula directamente la parte inferior del conducto. Deslice la aguja varios milímetros más allá del extremo del bisel para evitar el reflujo hacia el hígado y la vesícula biliar.

Una vez que la canulación sea exitosa, perfunda el páncreas dispensando dos mililitros de liasa de la jeringa. Esté atento a la expansión del páncreas sobre el estómago como una indicación de una canulación óptima. Alternativamente, se puede canular el conducto biliar.

Usando el método del quiste con fórceps. Tire del hemostático C sujetado en el duodeno lejos de la cabeza del ratón hacia la cola para que el conducto biliar común se convierta en torta. Luego, con una aguja doblada de calibre 27 conectada a una jeringa de cinco mililitros, perfore la fascia debajo del conducto biliar común cerca del hígado.

Use la aguja para limpiar la fascia del conducto con la aguja aún en su lugar. Coloque el hemostático en el suelo y tome un par de pinzas. Use un brazo de las pinzas abiertas para sostener el conducto biliar donde la aguja ha despejado la fascia mientras tira del conducto y las pinzas hacia adelante.

Deslice la aguja en el conducto usando las pinzas como tope. Una canulación exitosa está indicada por una expansión uniforme de la región del páncreas en la parte superior del estómago. Una vez que se ha perfundido el páncreas, se retira el hemostático del duodeno.

Luego, use las pinzas para levantar el duodeno y use un segundo par de pinzas para separar el páncreas de los intestinos. A continuación, extraiga el páncreas de la parte superior del estómago y del bazo. Finalmente, levante el páncreas del abdomen y córtelo para liberarlo de las conexiones restantes de la fascia con el intestino, el estómago y el bazo.

Coloque el páncreas en un tubo cónico de 50 mililitros y colóquelo sobre hielo. Incubar el páncreas a 37 grados centígrados de acuerdo con las instrucciones del protocolo escrito adjunto. Después de la incubación, agregue 20 mililitros de medio a los tubos y disocie el tejido agitando los tubos vigorosamente 40 veces en 10 segundos.

Este paso es fundamental para una recuperación óptima de las violetas. Las celdas de giro son de 800 rotaciones por minuto. Resus pasar en 15 mililitros de medio y condensar las muestras.

Vierta la lechada resuspendida a través de una malla de alambre de 0,419 milímetros y canalizarla en un tubo cónico nuevo de 50 mililitros. Enjuague el primer tubo con 10 mililitros adicionales de medio que contenga 10% de suero bovino fetal y viértalo a través de la malla de alambre pellet las células por centrifugación reus, doble el pellet en cinco mililitros de temperatura ambiente su opaco 10 77. A continuación, haga un vórtice suavemente durante varios segundos, añada cinco mililitros adicionales de su opaco alrededor del interior del tubo para lavar los ojales de la pared del tubo, pipetee lentamente para superponer 10 mililitros de RPMI libre de suero por el costado del tubo a una tasa de un mililitro por 10 segundos.

Una interfaz nítida debería ser evidente. A continuación, girar las muestras en una centrífuga de cubo oscilante a 20 grados centígrados y 900 veces la gravedad durante 20 minutos con una aceleración muy lenta y sin frenado después de la centrifugación, los islotes se separarán de las células exocrinas utilizando una pipeta serológica desechable de 10 mililitros. Transfiera los ojales de la interfaz de medios histo Paque a un tubo cónico nuevo de 50 mililitros.

En este punto se pueden agrupar varios tubos para eliminar los ojales residuales, sus tubos opacos llenan con suero que contiene medios y granulan los islotes centrifugando los tubos durante dos minutos a 800 rotaciones por minuto. A continuación, reus suspende los islotes en medios frescos. Repita este paso al menos dos veces. Reus.

Suspenda el palet en cinco mililitros de medio. Coloque un colador de células de nailon de 0,1 milímetros boca abajo sobre un tubo cónico de 15 mililitros. Pipetear la suspensión de células resuspendidas a través de ella para recoger los ojales.

A continuación, enjuague el tubo de 50 mililitros con seis mililitros adicionales de medio y páselo por el colador. Coloque una gota de tres mililitros de medio en una placa de Petri de 10 centímetros. Invierta el colador de células y sumérjalo en la gota de medio para recoger los ojales, pipetee de cinco a siete mililitros adicionales de medio de cultivo a través del filtro en la placa de Petri.

Para recoger los ojales restantes del colador por debajo de un objetivo de cuatro veces, recoja los ojales individualmente con una pipeta P 200 y transfiéralos a un tubo de microfuga de 1,5 mililitros. Estas imágenes muestran ojales aislados de ratones C 57 black six de 12 semanas de edad. La pureza y la calidad de los ojales se pueden estimar microscópicamente al finalizar el procedimiento de aislamiento.

Por ejemplo, las dos imágenes que se muestran aquí muestran un campo representativo donde hay desechos y contaminación de células exocrinas. Al elegir ojales para un experimento, evite elegir células exocrinas contaminantes u ojales que parezcan poco saludables. Los ojales con centros necróticos no están sanos, como se muestra en esta figura tomada 24 horas después del aislamiento, los centros necróticos no serán visibles inmediatamente después del aislamiento.

Los ojales que son células desprendidas son inevitables y se pueden usar en el trasplante de ojales en este video de lapso de tiempo de 24 horas de ojales. Inmediatamente después del aislamiento, se desarrollan centros necróticos dentro de muchos de los ojales. Estos centros necróticos parecen ser expulsados del ojal cerca del final de la grabación mientras se recogen los ojales.

Agrúpalos de modo que cada tubo tenga una distribución uniforme de la calidad y el tamaño de los ojales. Por ejemplo, cada grupo de 15 ojales puede contener cuatro ojales de gran tamaño, seis ojales medianos y cinco ojales pequeños. Lugar. El tubo en ojales de hielo se puede utilizar inmediatamente para el trasplante o manipular.

Antes de usar. Coloque una punta de carga de gel estéril en la abertura de un tubo microfusionado de 1,5 mililitros para que haya una curva suave, que forma una U en el extremo estrecho de la punta. Ambas aberturas de la punta deben estar orientadas directamente hacia afuera del tubo de microrresiduos.

Retire con cuidado un tubo de ojales del hielo. Asegúrese de que todos los ojales se hayan asentado en la parte inferior del tubo. Con una pipeta P 200, recoja suavemente los ojales en un volumen mínimo desde el fondo del tubo y transfiéralos a la punta curva preparada.

Una vez que los ojales se hayan sedimentado, retire la mayor cantidad posible de medios de la punta aspirando los medios a través de la gran abertura de la punta de carga de gel con cojinete de ojales Con una punta de carga de gel nueva conectada a una pipeta P 200. Fije el extremo no biselado de la tubería a la abertura estrecha de la punta de carga de gel del cojinete del islote. A continuación, conecte la punta a una pipeta P 200 y empuje suavemente los islotes en el tubo.

A continuación, conecte el borde no biselado del tubo de PE 50 a la aguja de una jeringa Hamilton de 25 microlitros. Con el émbolo retirado, presione el émbolo de la jeringa hasta que los ojales estén aproximadamente a 0,5 centímetros de la abertura biselada. Coloque la jeringa a un lado para que los ojales se asienten en una sola masa cerca de la abertura biselada del tubo mientras se prepara el riñón para recibir los ojales.

Prepare el sitio quirúrgico cortando el cabello y frotando la piel con Betadine alternando con alcohol isopropílico al 70% tres veces. Comience el procedimiento de trasplante de ojales realizando un pellizco en el dedo del pie para confirmar la anestesia en el ratón receptor. Coloque el eje de una varilla de vidrio directamente debajo del ratón y debajo del riñón perpendicular a la médula espinal.

A continuación, localice el riñón a través de la piel y coloque un paño quirúrgico estéril. Una vez que se localiza el riñón, use las tijeras McFerson banis para hacer una incisión de dos centímetros a través de la dermis directamente encima de ella perpendicular a la médula espinal. Esta incisión expondrá la pared peritoneal con las tijeras.

Haga una incisión de un centímetro a través de la pared peritoneal en la misma dirección que el corte a través de la capa dérmica usando el eje de la varilla de vidrio como tope, fuerce el riñón a través de la abertura peritoneal presionando hacia abajo la superficie adyacente. Humedece la superficie del riñón expuesto con PBS estéril y helado usando un aplicador con punta de algodón empapado. Repita el paso cada pocos minutos según sea necesario para evitar que la cápsula de riñón se seque.

Con una aguja de calibre 27, haga una incisión de 0,2 centímetros a través de la cápsula renal a través de la superficie anterior del riñón. Moviéndose desde el lado lateral izquierdo hacia el lado lateral derecho, inserte un tubo capilar de vidrio tirado por llama. Pruebe a través de la incisión realizada anteriormente y muévala en dirección posterior a lo largo de la superficie lateral dorsal del riñón.

Para crear una bolsa entre la cápsula renal y el parénquima renal, mueva los ojales de la jeringa Hamilton de 25 mililitros preparada hasta el borde de la abertura biselada del tubo flexible. A continuación, inserte el borde biselado hacia arriba en la bolsa subcapsular. El borde largo está en contacto con el parénquima renal.

Mueva el tubo hasta el extremo más posterior de la cápsula. A continuación, transfiera lentamente los ojales del tubo de PE 50 a la bolsa subcapsular presionando el émbolo de la jeringa. A medida que los ojales llenan la bolsa, retroceda lentamente el tubo flexible para hacer más espacio.

Después de retirar el tubo de la bolsa, deslice la sonda de vidrio a lo largo de la superficie exterior del riñón de adelante a atrás para empaquetar suavemente los ojales en el extremo proximal de la bolsa. Con pinzas de brazo flexionado, levante el revestimiento peritoneal adyacente a la abertura hecha para el riñón. Luego, use un aplicador con punta de algodón empapado en PBS para empujar suavemente el riñón hacia la cavidad peritoneal.

Cierre el ratón aplicando suturas en la pared peritoneal y clips para heridas en la capa dérmica. Regrese el mouse a su jaula y monitor. Para la recuperación, se debe proporcionar agua aceto meine para el intestino del ratón.

C Ojales de ratón aislados. Utilizando los métodos descritos en este video y se trasplantó una dosis curativa en seis ratones negros C 57 alogénicos. Los niveles de glucosa en sangre en ayunas se monitorizaron desde el primer día postoperatorio.

El rechazo se observa alrededor del día 17 en ratones receptores de 20 gramos que recibieron 300 ojales de un donante alogénico aquí. La recuperación se monitoreó en ratones que recibieron 150 o 300 ojales de donantes singénicos. No se observa rechazo en estos trasplantes ya que los ojales son de donantes singénicos.

La dosis de ollao administrada mide la función principal de los ollaos inmediatamente después del trasplante. Mientras que se observó una recuperación marginal con 150 ojales, se observó una recuperación completa cuando se trasplantaron 300 ojales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar los pasos críticos necesarios para aislar los ojales de ratón y trasplantar esos ojales debajo del espacio subcapsular del riñón.

Con la práctica, desarrollará la capacidad de canular rápidamente el conducto biliar común, que es el paso más difícil de este protocolo.