Northern Blot para detectar y cuantificar microARN específicos en el extracto de ARN total de tejido vegetal

Los microARN, miARN, son ARN pequeños, monocatenarios y no codificantes. Los miARN se incorporan a un complejo multiproteico y se unen a secuencias de ARNm diana complementarias para regular negativamente la expresión génica.

Para detectar miARN específico del ARN total de los tejidos vegetales, agregue un tinte de carga de gel que contenga colorantes de seguimiento y formamida, un agente desnaturalizante del ARN. Calentar la muestra para desnaturalizar el ARN y evitar la formación de estructuras secundarias antes de la electroforesis.

Cargue la muestra y los marcadores de ARN estándar en pocillos de un gel de poliacrilamida desnaturalizante preensamblado. Ejecute la electroforesis, facilitando la separación basada en el tamaño de los fragmentos de ARN.

Transfiera el gel a papeles de filtro prehumedecidos en un casete electrobante. Alinea una membrana secante de nailon empapada en tampón sobre el gel. A continuación, apila los papeles de filtro prehumedecidos. Realiza la electrotransferencia.

La corriente eléctrica hace que el ARN cargado negativamente, incluido el miARN, salga del gel y caiga en la superficie de la membrana de nailon cargada positivamente. Exponga la membrana a la luz ultravioleta; esto entrecruza los ARN con la membrana, evitando así la pérdida de ARN.

Incubar la membrana en un tampón de hibridación que contenga agentes bloqueantes que ocupen los sitios de unión no específicos para reducir el ruido de fondo.

Agregue una sonda de oligonucleótidos de ARN radiomarcada complementaria al miARN objetivo para unirse específicamente a él. Lave la membrana con tampón, retirando las sondas no unidas.

Utilice un sistema de imágenes de fósforo para detectar y cuantificar las intensidades de la señal de hibridación radiactiva. La señal de alta resolución indica la expresión específica de miARN en el tejido vegetal.