El aislamiento de las lipoproteínas de alta densidad para no codificante ARN pequeño Cuantificación

El objetivo general de este protocolo es cuantificar pequeños ARN no codificantes en lipoproteínas purificadas. Este protocolo puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las lipoproteínas, como la definición de las firmas de ARN pequeño de las lipoproteínas en la salud y la enfermedad, así como el avance de los ARN pequeños de lipoproteínas como biomarcadores de enfermedades o mensajes de célula a célula. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden analizar lipoproteínas de alta pureza para detectar pequeños cambios en el ARN en enfermedades o condiciones experimentales.

Las implicaciones de esta técnica se extienden para el tratamiento de enfermedades cardiometabólicas, ya que los ARN extracelulares son una nueva clase de biomarcadores de enfermedades y el ARN pequeño de lipoproteínas tiene un potencial emocionante como dianas farmacológicas en futuros estudios. Aunque este método está diseñado para ARN pequeños de HDL, también se puede adaptar para ARN pequeños de lipoproteínas de muy baja densidad y baja densidad. Por lo general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades, debido a la falta de equipo adecuado y experiencia en la preparación de muestras para la ultracentrifugación en gradiente de densidad.

Este protocolo se compone de métodos establecidos vinculados entre sí para la cuantificación de ARN pequeños en HDL de alta pureza, mediante secuenciación de alto rendimiento o PCR en tiempo real. Este video trata sobre la purificación del HDL. Este protocolo va a ser demostrado por mi asistente, Evan Shadari.

Para empezar, añade 90 microlitros de antioxidantes 100x a nueve mililitros de plasma. A continuación, ajuste la densidad del plasma a 1,025 gramos por mililitro, añadiendo 0,251 gramos de bromuro de potasio por cada nueve mililitros de plasma. Agita el plasma a temperatura ambiente, hasta que toda la sal se haya disuelto.

Luego, transfiera el plasma a tubos ultracentrífugos y asegúrese de tener una capa de burbujas en la parte superior. No debe haber aire atrapado debajo del plasma. A continuación, prepare una aguja de calibre 18 agregando una curva de 90 grados a un centímetro de la punta, con el lado biselado hacia arriba.

Luego, usando una jeringa y la aguja doblada, coloque con cuidado tres mililitros de la solución de recubrimiento número uno sobre el plasma. Retira la mayoría de las burbujas de la superficie y deja de dos a tres milímetros entre el menisco y el borde del tubo. A continuación, coloque con cuidado los tubos en los cubos SW 40 Ti.

Pese cada cubo con las tapas y equilibre exactamente los cubos que ocuparán posiciones opuestas en la centrífuga. A continuación, coloque el rotor en la ultracentrífuga y hágalo funcionar a 274, 400 veces G durante 24 horas a cuatro grados centígrados, con la pausa ajustada intermediamente a un valor de cuatro. Al día siguiente, retire con cuidado los cubos del rotor y levante los tubos de los cubos.

Luego, retire lentamente dos mililitros de la capa superior de la superposición, usando una jeringa y una aguja doblada. Esta es la fracción IDL de VLDL. Luego, recoja los siete mililitros restantes de plasma y transfiéralo a un tubo cónico de 15 mililitros.

Aumente el volumen del plasma a nueve mililitros agregando la solución de superposición número dos. Luego, ajuste la densidad a 1.080 gramos por mililitro agregando 0.746 gramos de bromuro de potasio. A continuación, agite suavemente la muestra para disolver la sal, lo que tardará unos 20 minutos.

A continuación, transfiera la muestra a un tubo ultracentrífugo sin atrapar aire. Asegúrate de que se haga una capa de burbujas en la parte superior. Con la aguja doblada, superponga con cuidado tres mililitros de la solución de recubrimiento número tres.

Luego, retire la mayoría de las burbujas y cargue con cuidado los tubos en el cubo SW 40 Ti. Equilibra y gíralos, como se ha descrito anteriormente, durante 24 horas. Al día siguiente, retire con cuidado dos mililitros de la capa superior de la capa superior con la aguja doblada.

Esta es la fracción LDL. Luego, transfiera la muestra restante a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros y aumente el volumen a nueve mililitros con la solución número cuatro. Ahora ajuste la densidad a 1,30 gramos por mililitro añadiendo unos 3,33 gramos de bromuro de potasio y meciendo la muestra hasta que la sal se disuelva.

Luego, transfiera la muestra a un tubo ultracentrífugo y con cuidado tres mililitros de la solución número cinco. Ahora, ultracentrífuga la muestra como antes, pero durante 48 horas. Dos días después, recoja los dos mililitros superiores de la capa con una jeringa y una aguja doblada.

Esto constituye la fracción HDL. Para eliminar las soluciones con alto contenido de sal, transfiera la fracción de HDL a una funda de diálisis húmeda con un límite de 10.000 pesos moleculares. A continuación, dialícelo durante 24 horas en un litro de un XPBS con una agitación suave a cuatro grados centígrados.

Reemplace la solución PBS tres veces durante el período de 24 horas. Posteriormente, determine la concentración de proteínas de la fracción HDL mediante un método BCA. Las vesículas extracelulares, o exosomas, tienen una densidad similar a las HDL pequeñas y, por lo tanto, podrían estar presentes en la misma fracción de densidad que las HDL.

Por lo tanto, la fracción de HDL requiere una mayor purificación por FPLC. Inmediatamente antes de usar el FPLC, pase 1,2 miligramos de la fracción DGUC HDL en 500 microlitros de solución a través de un filtro centrífugo de 0,22 micras. Recoja la muestra filtrada en una jeringa de inyección FDLC, asegurándose de que no queden atrapadas burbujas de aire.

A continuación, ajuste el caudal de FPLC a 0,3 mililitros por minuto con un límite de presión de 2,6 megapascales. A continuación, equilibre las columnas con volúmenes de búfer de 0,2 columnas. Ahora inyecte la muestra con tres mililitros de tampón en el instrumento FPLC y comience la ejecución.

Recoge fracciones de 1,5 mililitros para un total de 72 fracciones. Identificar las fracciones de FPLC correspondientes a DGUC HDL mediante la determinación de los niveles de colesterol total mediante un kit colorimétrico según las instrucciones del fabricante. Espere encontrar de seis a siete fracciones de FPLC que contengan DGUC HDL.

Agrupar todas las fracciones que contienen HDL y concentrarlas utilizando un filtro centrífugo de corte de 10 kilodalton a 4.000 veces G durante una hora a cuatro grados Celsius, o hasta que el concentrado de HDL sea de aproximadamente 100 microlitros. A continuación, recoge el concentrado de HDL y cuantifica la proteína mediante el método BCA. Más tarde, use la misma cantidad de proteína total HDL para aislar el ARN.

El plasma humano se fraccionó por FPLC sin el uso de la separación por gradiente de densidad. Seis fracciones correspondieron a HDL y seis a lipoproteínas de muy baja densidad. Los lípidos en negro, el colesterol en rojo y las proteínas en azul se midieron mediante kits colorimétricos.

En comparación, el uso de la ultracentrifugación en gradiente de densidad antes de la FPLC dio como resultado el hallazgo de proteínas lipídicas y colesterol casi exclusivamente en las fracciones de HDL. A partir de HDL tomado de cuatro donantes de plasma sanos, se aisló y secuenció el ARN total utilizando un protocolo de 50 pares de bases de lectura única. La distribución de lecturas normalizadas ilustra el enriquecimiento de pequeños ARN alrededor de 21 y 34 nucleótidos.

El análisis de la biblioteca mostró que el 38 por ciento de las lecturas eran micro ARN y el 37 por ciento se derivaron de ARNt. También estaban presentes ARN misceláneos, ARN ribosómicos, ARN pequeños, ARN nucleolares pequeños y ARN largos no codificantes. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en diez días, cuando se hace correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar validar los cambios de ARN pequeños en HDL observados con la secuenciación de alto rendimiento con otro método, como la PCR o la transferencia del norte. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la capacidad de aceptación del flujo electrónico del colesterol HDL y los SA antiinflamatorios HDL, durante los pasos de aislamiento del ARN y los pasos de preparación de la secuenciación para responder preguntas adicionales, como determinar la correlación entre los cambios pequeños del ARN HDL y la función del HDL. Tras su desarrollo, esta técnica abrió el camino a los investigadores en los campos de los lípidos y las lipoproteínas para estudiar la carga no colesterolosa, en particular los ácidos nucleicos y las enfermedades metabólicas, como la hipercolesterolemia o la diabetes.

Y no lo olvide, trabajar con plasma humano puede ser extremadamente peligroso, y uno debe tener la capacitación adecuada en patógenos transmitidos por la sangre, y se debe usar el equipo de protección personal adecuado al realizar esta técnica.