Name: El aislamiento de las lipoproteínas de alta densidad para no codificante ARN pequeño Cuantificación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Aprenda a aislar lipoproteínas de alta densidad para cuantificar ARN pequeños no codificantes mediante ultracentrifugación en gradiente de densidad. Este método permite analizar cambios en ARN en condiciones experimentales y de enfermedad.

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Este trabajo fue respaldado por premios de los Institutos Nacionales de Salud, el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre a K.C.V. HL128996, HL113039 y HL116263. Este trabajo también fue respaldado por premios de la Asociación Americana del Corazón a K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003 y R.M.A. POST25710170.

1. Purificación HDL (~ 5,5 días) <ol><li> La ultracentrifugación en gradiente de densidad (DGUC, ~ 5 días) <ol><li> Añadir 90 l de 100x antioxidantes para 9 ml de plasma aisladas de sangre venosa fresca. </li><li> Ajuste la densidad de plasma con KBr de 1,006 g / ml a 1,025 g / ml mediante la adición de 0,251 g de KBr a 9 ml de plasma de la Etapa 1.1.1 (0,0278 g / ml de plasma KBr). Rock the plasma hasta que toda la sal se disuelve a temperatura ambiente y transferir ultracentrifugar tubos y asegurar que todas las burbujas suben a la superficie. </li><li> Doble la punta de una aguja de 18 G a 90 ° 1 cm de la punta, con el lado cónico hacia arriba. El uso de una jeringa y la aguja de calibre 18, se coloca cuidadosamente 3 ml de solución de recubrimiento # 1 sobre el plasma (Tabla 1). NOTA: La aguja doblada asegura toda la VLDL / IDL, LDL y HDL se eliminan sin mezclarse con la superposición. </li><li> Eliminar la mayoría de las burbujas en la parte superior, dejando 2 - espacio 3 mm del menisco en la parte superior del tubo y carefuLLY colocar los tubos en cubos SW-40Ti. </li><li> Pesar cada cubeta (con las tapas) en el equilibrio, y equilibrar exactamente con el cubo opuesto (cubo + cap): # 1 a # 4, # 2 y # 5 y # 3 a # 6. NOTA: Estos cubos deben ser equilibrados y emparejado en todo momento. </li><li> Coloque el rotor en ultracentrífuga (Lista de Materiales). Centrifugar a 274.400 xg durante 24 horas a 4 ° C con un freno intermedio # 4. </li><li> Retirar con cuidado cubos de rotor y los tubos de los cubos. </li><li> Retire cuidadosamente 2 ml de la capa superior de la superposición usando una jeringa y una aguja doblada. Esta será la fracción VLDL / IDL que puede ser almacenado en 4 ° C o -80 DO. </li><li> Después de la eliminación de la fracción VLDL / IDL, recoger el restante 7 ml de muestra (plasma) y colocarlo en un tubo cónico de 15 ml. Llevar el volumen de la muestra hasta 9 ml con solución de recubrimiento # 2 (Tabla 1). </li><li> Ajustar la densidad de la muestra de 1,025 g / ml a 1,080 g / ml con KBr usandoaproximadamente 0,746 g de KBr en la muestra 9 ml o 0,0828 g / ml de KBr muestra. Agite suavemente la muestra hasta que todo el KBr se disuelve (aproximadamente 20 minutos) y transferir ultracentrifugar tubo mientras burbujas asegurando suben a la superficie. </li><li> Con jeringa y aguja, coloque cuidadosamente 3 ml de solución de superposición # 3 sobre la muestra (Tabla 1). Deja 2-3 mm espacio de menisco en la parte superior del tubo. </li><li> Retire la mayoría de las burbujas restantes en la parte superior del tubo y se coloca cuidadosamente los tubos de ultracentrífuga y dolorosas en los cubos SW-40Ti. </li><li> Pesar cada cubeta (con las tapas) en el equilibrio, y equilibrar exactamente con el cubo opuesto + cap, como en 1.1.5. </li><li> Coloque el rotor en ultracentrífuga (ver Lista de Materiales). Centrifugar a 274.400 xg durante 24 horas a 4 ° C con un freno intermedio # 4. </li><li> Retirar con cuidado cubos de rotor y los tubos de los cubos. </li><li> Retire cuidadosamente 2 ml de la capa superior de la superposición usando una jeringa y sernt aguja. Esta será la fracción LDL que puede ser almacenado en 4 ° C o -80 DO. </li><li> Después de la eliminación de la fracción LDL, recoger los restantes aproximadas 7 ml de muestra (plasma) y colocarlo en un nuevo tubo cónico de 15 ml. Llevar el volumen de la muestra (plasma) hasta 9 ml con 1,080 g / ml solución # 4 (Tabla 1). </li><li> Ajustar la densidad de la muestra de 1,080 g / ml a 1,30 g / ml con KBr usando 3,33 g de KBr en el 9 ml de muestra (plasma) o 0,37 g de KBr por cada ml de muestra. Roca o agitar ligeramente la muestra hasta que todo se disuelva el KBr (sal) y transferir ultracentrifugar tubo. </li><li> Con jeringa y aguja, coloque cuidadosamente 3 ml de solución de superposición # 5 sobre la muestra (Tabla 1). </li><li> Eliminar la mayoría de las burbujas restantes en la parte superior del tubo, dejando espacio 2- 3 mm del menisco en la parte superior del tubo y se coloca cuidadosamente los tubos de ultracentrífuga llenos en cubos SW-40Ti. </li><li> Pesar cada cubeta (con los tapones) en el equilibrio, y exactamente el equilibrio con el cubo opuesto + cap, como en 1.1.5. </li><li> Coloque el rotor en ultracentrífuga (ver Lista de Materiales). Centrifugar a 274.400 xg durante 48 horas a 4 ° C con un freno de # 4. </li><li> Retirar con cuidado cubos de rotor y los tubos de los cubos. </li><li> Retirar con cuidado aproximadamente 2 ml de la capa superior de la superposición usando una jeringa y una aguja doblada. Esta es la fracción de HDL, que se puede almacenar a 4 ° C o -80 ° C. NOTA: Después de HDL DGUC puede ser dializada para eliminar las soluciones de alto contenido de sal. </li><li> Para diálisis, coloque la fracción HDL recogido en una funda de diálisis sellado (10.000 MW de corte) y se dializa durante la noche en 1 L de 1x PBS. tampón de Cambio de diálisis (1x PBS) 3 veces más de 24 h. perturbación suave de la PBS con una varilla de agitación magnética mejorará la diálisis. </li><li> Determinar la concentración de proteína de la DGUC-HDL usando un método BCA 8. </li></ol></li><li> Fast Protein Liquid Croncromatografía (FPLC) o de exclusión por tamaño cromatografía (~ 6 h) <ol><li> Filtro de 1,2 mg de DGUC-HDL (proteína total) en 500 l a través de un filtro de micras micro-centrífuga 0,22 (véase la lista de Materiales), inmediatamente antes de la inyección. NOTA: Un filtrado adicional de la muestra DGUC-HDL a través de un filtro de 0,45 micras micro-centrífuga antes del filtro de 0,22 micras puede ser necesario para algunas muestras. </li><li> Recoger la muestra filtrada DGUC-HDL, cargar la jeringa de inyección de FPLC (relleno), y asegurarse de que no haya burbujas en la jeringa antes de la inyección en el FPLC. </li><li> Ajuste el caudal de FPLC a 0,3 ml / min con un límite de presión a 2,6 MPa. Equilibrar columnas con 0,2 volúmenes de columna (aproximadamente 15 ml) de tampón, antes de la inyección de la muestra. Se inyecta la muestra con 3 ml de tampón en el instrumento de FPLC (circuito de inyección) y empezar la carrera. Recoger fracciones de 1,5 ml para un total de 72 fracciones. </li></ol></li></ol> 2. De alto rendimiento Pequeño ARNSecuenciación (sRNAseq, ~ 9 días) <ol><li> Aislamiento de ARN (~ 1 día) <ol><li> Identificar las fracciones de FPLC correspondientes a DGUC-HDL mediante la determinación de los niveles de colesterol total usando un kit colorimétrico de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El uso de este FPLC puesta a punto, espera encontrar 6 - 7 fracciones FPLC contienen DGUC-HDL. </li><li> Recoger todo el volumen (aproximadamente 8 mL -1 0 piscina de 1,45 ml fracción volúmenes) de las fracciones HDL-DGUC FPLC y concentrar utilizando 10 kDa mw unidades centrífugas filtro de corte a 4.000 xg durante 1 hora a 4 ° C o hasta que el concentrado de HDL es de aproximadamente 100 l. </li><li> Se recoge el concentrado de HDL y cuantificar la concentración de proteína total HDL mediante el método BCA 8. </li><li> Determinar la concentración más alta de proteína total HDL, hasta 1 mg, que se pueden dividió en partes alícuotas de cada muestra en el conjunto. Por ejemplo, aislar ARN a partir de la misma cantidad de proteína total HDL para cada muestra. </li><li> Realizar Aislamiento de ARN usandoun protocolo modificado (véase la lista de materiales). <ol><li> Añadir 10 volúmenes de reactivo de fenol lisis (ver Lista de Materiales) de la muestra y agitar durante 1 min. </li><li> Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Añadir cloroformo (20% del volumen de reactivo de fenol lisis utilizado en el paso 2.1.5.1) y agitar vigorosamente durante 15 s. </li><li> Incubar a temperatura ambiente durante 2 - 3 min. </li><li> Centrifugar durante 15 min a 12.000 xg a 4 ° C en una centrífuga refrigerada. </li><li> Transferir la fase acuosa superior a un nuevo tubo, evitando la interfase. </li><li> Añadir un volumen 1,5 veces de 100% de etanol a la fase acuosa y agitar durante 1 min. </li><li> Almacenar las muestras durante al menos 1 hora o durante la noche a -80 ° C. </li><li> Continuar con el protocolo de aislamiento de ARN usando el mini columnas previstas. </li><li> Eluir con 30 l de H RNasa libre de 2 O. En primer lugar añadir 15 l de H2O directamente a la frita, giro a baja velocidad (2.000 x g) durante 2 minutos, ya continuación, girar a alta velocidad (max) durante 1 minuto. Repita este paso con un 15 l adicionales de H 2 O. </li></ol></li><li> Inmediatamente proceder a sRNA la generación de bibliotecas o almacenar a -80 ° C. </li></ol></li><li> Generación de biblioteca (~ 6 h) <ol><li> Preparar bibliotecas sRNA cDNA utilizando el protocolo del kit sRNA biblioteca generación, según las instrucciones del fabricante con una modificación de la amplificación por PCR como se detalla a continuación. <ol><li> Preparar la mezcla maestra de PCR en hielo que contiene H 0,5 l de DNasa / RNasa libre de O 2, 15 l de PCR Mix (LMP) y 1 l de RNA PCR Primer (RP1) por muestra (incluya un 10% adicional para el error pipeteo). </li><li> Añadir 16,5 l de la mezcla de PCR a cada muestra (ADNc). </li><li> Asignar un número de índice / código de barras para cada muestra para la multiplexación y añadir 1 Índice de cebador de PCR l (con el número correspondiente) a la muestra. </li><li> Realizar una vuelta rápida utilizando la microfuga. NOTA: El volumen total debeahora ser de 30 l por muestra. </li><li> Realizar las condiciones de los ciclos para la amplificación por PCR como se detalla en las tablas 2 y 3. </li></ol></li></ol></li><li> Seleccione el tamaño sRNA Biblioteca a retirar el adaptador: Adaptadores (~ 1,5 h) <ol><li> Realizar la selección de tallas de la biblioteca usando el selector automático de tamaño de ADN según las instrucciones del fabricante con los siguientes parámetros de tamaño: Objetivo: 156 pb, de inicio: 135 pb, Fin: 177 pb, Bandera Rango: Amplio. </li></ol></li><li> DNA Clean Up (~ 0,5 h) <ol><li> Limpiar tamaño seleccionado sRNA cDNA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Eluir limpia y se concentró sRNA ADNc con H 2 x 7 l DNasa / RNasa libre de 2 O. </li></ol></li><li> Cuantificación y evaluación de sRNA cDNA Biblioteca rendimiento y calidad (~ 1 h) <ol><li> Evaluar la calidad de la biblioteca de ADNc sRNA y tamaño usando un chip de ADN de alta sensibilidad en un Bioanalyzer (Lista de Materiales) según manufactinstrucciones del urer. </li><li> Cuantificar las concentraciones individuales de la biblioteca de ADNc sRNA usando un ensayo de ADN de alta sensibilidad (Lista de Materiales), según las instrucciones del fabricante. NOTA: Se recomienda disponer de todas las muestras con diferentes índices que se ejecuten en el mismo carril de la celda de flujo, si es posible. Si se requiere más de un carril, mezclar muestras de casos y de control apropiada. </li></ol></li><li> De alto rendimiento de secuenciación sRNA (~ 7 días) <ol><li> Piscina individuo indexado bibliotecas sRNA en base a concentraciones equimolares. </li><li> Pantalla agruparon bibliotecas sRNA de calidad mediante chip de ADN de alta sensibilidad en el Bioanalyzer y determinar la concentración de ADN de la biblioteca como en 2.5.1 - 2.5.2. </li><li> Realizar PCR cuantitativa (qPCR) del contenido adaptador para asegurar la profundidad adecuada secuenciación utilizando la biblioteca de secuenciación kit de cuantificación qPCR según las instrucciones del fabricante (Lista de Materiales). </li><li> Realizar la secuenciación utilizando una sola lectura, 50 bprotocolo de p para llegar a una profundidad de aproximadamente 20-25 M lee / muestra, según las instrucciones del fabricante. </li></ol></li></ol> 3. Análisis de Datos (~ 1 día) <ol><li> Utilice bcl2fastq2, según las instrucciones Guía del usuario, a los archivos FASTQ prima procesamiento previo de muestras desmultiplexadas (Lista de Materiales). </li><li> Utilice Cutadapt para recortar adaptadores 9 y retire lee &lt;16 nucleótidos (NTS) de longitud, siguiendo las instrucciones del manual de usuario (Lista de Materiales). </li><li> Eliminar las secuencias de contaminación presentes en las bibliotecas, incluyendo sRNA secuencia de solución de parada (STP: CCACGTTCCCGTGG) y adaptador de arrastre (CTACAGTCCGACGATC) utilizando la función removeSequenceInFastq en marco NGSPERL, según instrucciones de la guía del usuario (Lista de Materiales). </li><li> Realizar mediciones de control de calidad mediante el uso de FastQC Centro de Ciencias Cuantitativas (SCC) herramientas, según instrucciones de la guía del usuario (Lista de Materiales). </li><li> Generar lista no redundante de &quot;idéntico&quot;, se lee (redunda colapsont lee) y el número de copias de registros mediante CQSTools, según instrucciones de la guía del usuario (Lista de Materiales). </li><li> Align lee al genoma humano utilizando Bowtie1.1.2 permitiendo 1 desajuste (opciones: -a -m 100 --el mejor --strata -v 1), según las instrucciones del manual de usuario (Lista de Materiales). </li><li> Realice la alineación leer, contar y dar lugar a tareas de resumen utilizando NGSPERL, según instrucciones de la guía de usuario. </li><li> Convertir tabla de recuento exportado a un archivo de hoja de cálculo. </li><li> Normalizar lee de una clase específica (por ejemplo, los miRNAs) con el número total de lecturas para esa clase (por ejemplo, el número total de miRNAs lecturas) y las señales del informe como Lee miARN Por asignada (RPMM). (Por ejemplo, RPMM = (miR-X / # total de miARN lecturas) * 1.000.000). </li><li> Entrada normalizado tabla de conteo como la tecnología de un solo color genérico en el software de bajo nivel y diferenciado de alto nivel de análisis según instrucciones de la guía del usuario (Lista de Materiales). NOTA: En la actualidad, existen genes de limpieza no bien caracterizados / SRNEn cuanto a HDL-sRNA. Un control de espiga-in puede ser utilizado, pero puede ser problemático. La normalización de la proteína de entrada a HDL o el volumen total se aconseja. Lo más importante, se recomienda para validar los resultados de secuenciación por una de las diversas estrategias para cuantificar miRNAs y sRNAs utilizando PCR en tiempo real o PCR cuantitativa. </li></ol>

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<li>Cheung, M. C., Wolf, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effect+of+ultracentrifugation+on+apolipoprotein+A-I-containing+lipoprotein+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations.</a> J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).</li>
<li>Kunitake, S. T., Kane, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+integrity+of+high+density+lipoproteins+in+the+ultracentrifuge%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge.</a> J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).</li>
<li>Laurent, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meeting+report%3A+discussions+and+preliminary+findings+on+extracellular+RNA+measurement+methods+from+laboratories+in+the+NIH+Extracellular+RNA+Communication+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium.</a> J Extracell Vesicles. 4, 26533(2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo está diseñado para cuantificar miRNAs y otros sRNAs por secuenciación de alto rendimiento o PCR en tiempo real sobre el HDL altamente puro. Al igual que con cualquier enfoque, las consideraciones especiales se deben dar a cada paso en el proceso de purificación de HDL y ARN y luego cuantificar sRNAs. Este protocolo está diseñado para los proyectos iniciados con ≥ 2 ml de plasma. Sin embargo, los análisis de ARN de alta calidad con éxito se pueden completar con HDL purificada a partir de tan poco como 80 l...

No codificante ARN pequeños extracelulares (sRNAs) representan una nueva clase de biomarcadores de la enfermedad y las posibles dianas terapéuticas y es probable que facilitan la comunicación de célula a célula 1. El tipo más ampliamente estudiada de sRNA son los microARN (miARN) que son aproximadamente 22 nts de longitud y se procesan a partir de formas precursoras más largas y transcritos primarios 2. miRNAs se han demostrado a la post-transcriptionally regular la expresión génica a través de la supresión de la traducción de la proteína y la inducción de la degradación del ARNm 2. Sin embargo, los miRNAs son sólo uno de los muchos tipos de sRNAs; como sRNAs pueden escindirse de ARNt padres (sRNAs tRNA derivados, TDR), pequeños ARN nucleares (sRNAs derivados sRNA, sndRNA), pequeños RNAs nucleolar (sRNAs derivados de ARNsno, snRNA), ARN ribosomal (sRNAs, RDR rRNA derivados ), y ARN (YDR), y otros ARN diverso 1. Unos pocos ejemplos de estos nuevos sRNAs se ha informado de función similar a miRNAs; sin embargo, el fu biológicanctions de muchos de estos sRNAs que queda por determinar, aunque funciones en la regulación de genes es probable 3-6. Lo más interesante, miRNAs y otros sRNAs son presente de forma estable en los fluidos extracelulares, incluyendo la saliva, plasma, orina y bilis. sRNAs extracelulares se probable protegidos de RNasas través de su asociación con vesículas extracelulares (EV), lipoproteínas, y / o complejos de ribonucleoproteínas extracelulares. Anteriormente, se informó de que las lipoproteínas, a saber, las lipoproteínas de alta densidad (HDL), miRNAs de transporte en el plasma 7. En este estudio, HDL se aisló utilizando un método secuencial de la ultracentrifugación en gradiente de densidad (DGUC), cromatografía líquida de proteína rápida (de exclusión por tamaño de filtración en gel cromatografía, FPLC), y cromatografía de afinidad (anti-apolipoproteína AI (apoA-I) inmunoprecipitación ) 7. Con las dos matrices en tiempo real de baja densidad basados ​​en PCR y ensayos de miARN individuales, los niveles de miARN se cuantificaron sobre el HDL aisladas de curartu y 7 sujetos hipercolesterolémicos. Con este enfoque, hemos sido capaces de perfil miRNAs y cuantificar miRNAs específicos en las preparaciones de HDL de alta pureza. Desde 2011, se ha determinado que a pesar de cromatografía de afinidad mejora la pureza del HDL, la saturación de anticuerpos limita en gran medida el rendimiento, y puede ser un costo prohibitivo. Actualmente, el protocolo recomienda un método tándem secuencial de dos etapas de DGUC seguido de FPLC, que también produce muestras de HDL de alta calidad para aguas abajo aislamiento de ARN y cuantificación sRNA. Debido a los recientes avances en la secuenciación de alto rendimiento de sRNAs (sRNAseq), por ejemplo, los miRNAs, y el aumento de la conciencia de otras clases no miARN sRNA, sRNAseq es el estado actual de la técnica en el miARN y sRNA perfiles. Como tal, nuestro protocolo recomienda que cuantifican miRNAs y otros sRNAs en muestras de HDL utilizando sRNAseq. No obstante, el ARN total aislado de HDL también se puede utilizar para cuantificar miRNAs individuales y otros sRNAs o validar los resultados sRNAseq usando PCR en tiempo real unapproaches. A continuación se describe en detalle un protocolo para la extracción, purificación, cuantificación, análisis de datos y validación de alta pureza HDL-sRNAs. El objetivo general de este trabajo es demostrar la viabilidad y el proceso de cuantificación en sRNA HDL altamente puro aislado del plasma humano.

<table><tbody><tr><td>Ultracentrífuga&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A99839</td><td>Optima XPN-80</td></tr><tr><td>Rotor ultracentrífugo</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td>SW-41Ti</td></tr><tr><td>AKTA Sistema FPLC puro</td><td>GE Healthcare</td><td>29018224</td><td></td></tr><tr><td>3x FPLC Superdex 200 Columnas de aumento en línea</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td>10/300 gl</td></tr><tr><td>SynergyMx</td><td>BioTek Instruments</td><td>7191000</td><td></td></tr><tr><td>Mesa centrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004525</td><td>Sorvall ST40R</td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada</td><td>Eppendorf</td><td>22629867</td><td>5417R (adquirida a través de USA Scientific)</td></tr><tr><td>Microfuge&nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>2631-0006</td><td></td></tr><tr><td>PippenPrep</td><td>Sage Science</td><td>PIP0001</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>G2938B</td><td></td></tr><tr><td>Ensayo de ADN de alta sensibilidad</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Biblioteca de secuenciación Kit de cuantificación de qPCR</td><td>Illumina</td><td>SY-930-1010</td><td></td></tr><tr><td>ProFlex Termociclador</td><td>Applied Biosystems</td><td>4484073</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 12k Flex Applied</td><td>Biosystems</td><td>4471134</td><td></td></tr><tr><td>EpMotion Robot</td><td>Eppendorf</td><td>960000111</td><td>5070</td></tr><tr><td>Tubos centrífugos ultratransparentes</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de potasio</td><td>Fisher Chemicals</td><td>P205-500</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico de 15 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Filtros microcentrífugos 0,45 y micro; m</td><td>Millipore</td><td>UFC30HV00</td><td></td></tr><tr><td>Filtros microcentrífugos 0,22 y micro; m</td><td>Millipore</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>miRNAEasy Kits de aislamiento de ARN total</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol total kit colormétrico</td><td>Cliniqa (Raichem)</td><td>R80035</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de centrifugación de corte de 10.000 m.w.</td><td>Amicon</td><td>UFC801024</td><td>adquirido a través de Millipore</td></tr><tr><td>Tubos de tiras de PCR</td><td>Axygen</td><td>PCR-0208-C</td><td>adquiridos a través de Fisher</td></tr><tr><td>kit de microARN RT</td><td>Life Technologies</td><td>4366597</td><td>para 1000 reacciones</td></tr><tr><td>Mezcla maestra de PCR Botella</td> de Life <td>Technologies</td><td>4440041</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Kit Pierce BCA Thermo</td><td>Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Kit de limpieza y concentración Zymo</td><td></td><td>D4014</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de diálisis Spectrum</td><td>Labs</td><td>132118</td><td>comprado a través de Fisher</td></tr><tr><td>bcl2fastq2</td><td>Illumina</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>Cutadapt</td><td>https://github.com/marcelm/cutadapt</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>NGSPERL</td><td>github.com/shengqh/ngsperl</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>CQSTools</td><td>github.com/shengqh/CQS.Tools</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>Bowtie 1.1.2&nbsp;</td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr><tr><td>GeneSpringGX13.1.1</td><td>Agilent</td><td>n/a</td><td>Software</td></tr></tbody></table>

el aislamiento de las lipoproteínas de alta densidad para no codificante arn pequeño cuantificación

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

La diversidad de pequeños ARN no codificantes (sRNA) se está expandiendo rápidamente y están surgiendo sus papeles en los procesos biológicos, incluyendo la regulación de genes,. Lo más interesante es sRNAs también se encuentran fuera de las células y se presente de forma estable en todos los fluidos biológicos. Como tal, sRNAs extracelulares representan una nueva clase de biomarcadores de la enfermedad y es probable que participan en la señalización celular y las redes de comunicación intercelulares. Para evaluar su potencial como biomarcadores, sRNAs pueden ser cuantificados en plasma, orina y otros fluidos. Sin embargo, para entender completamente el impacto de sRNAs extracelulares como señales endocrinas, es importante para determinar qué compañías están transportando y protegerlos en fluidos biológicos (por ejemplo, plasma), que las células y los tejidos contribuyen a piscinas sRNA extracelulares, y las células y los tejidos capaces de aceptar y utilizar extracelular sRNA. Para lograr estos objetivos, es fundamental para aislar poblaciones altamente puros de portadores extracelularespara sRNA de perfiles y la cuantificación. Hemos demostrado anteriormente que las lipoproteínas, en particular de las lipoproteínas de alta densidad (HDL), el transporte microARN (miARN) funcionales entre las células y el HDL-miRNAs son significativamente alteradas en la enfermedad. A continuación, detallamos un nuevo protocolo que utiliza tándem aislamiento HDL con ultracentrifugación en gradiente de densidad (DGUC) y rápido-proteína-cromatografía líquida (FPLC) para obtener HDL de alta pureza para el perfilado de aguas abajo y cuantificación de todos los sRNAs, incluyendo miRNAs, utilizando tanto alta secuenciación -throughput y enfoques de PCR en tiempo real. Este protocolo será un recurso valioso para la investigación de sRNAs sobre el HDL.

Este protocolo es una serie de métodos establecidos unidos entre sí para permitir la cuantificación de sRNAs en HDL altamente puro mediante secuenciación de alto rendimiento o en tiempo real PCR (Figura 1). Para demostrar la viabilidad y el impacto de este protocolo, el HDL se purificó a partir de plasma humano por el método DGUC y FPLC tándem. Las fracciones recogidas correspondientes a FPLC HDL (por la distribución de colesterol) se concentraron y el ARN total fue aisl...

Este protocolo describe el aislamiento y la cuantificación de pequeños ARN de lipoproteínas de alta densidad.

El aislamiento de las lipoproteínas de alta densidad para no codificante ARN pequeño Cuantificación

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

El objetivo general de este protocolo es cuantificar ARN no codificantes pequeños en lipoproteínas purificadas. Este protocolo puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las lipoproteínas, como definir las firmas de ARN pequeño en lipoproteínas en condiciones de salud y enfermedad, así como impulsar el uso de los ARN pequeños de lipoproteínas como biomarcadores de enfermedad o como mensajeros entre células. La principal ventaja de esta técnica es que permite analizar lipoproteínas altamente puras para detectar cambios en el ARN pequeño asociado a enfermedades o condiciones experimentales.Las implicaciones de esta técnica se extienden a la terapia de enfermedades cardiometabólicas, ya que los ARN extracelulares representan una nueva clase de biomarcadores de enfermedad y los ARN pequeños de lipoproteínas tienen un potencial prometedor como dianas terapéuticas en estudios futuros. Aunque este método está diseñado para ARN pequeños de HDL, también puede adaptarse para ARN pequeños de lipoproteínas de muy baja densidad y de baja densidad. En general, las personas nuevas en este método podrían tener dificultades debido a la falta de equipo adecuado y experiencia en la prepa

isolation-high-density-lipoproteins-for-non-coding-small-rna

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este documento muestra los métodos para el aislamiento, purificación y detección de exosomas, así como las técnicas para el análisis de su contenido molecular. Estos métodos son adaptables para el aislamiento exosoma de ambos medios de cultivo de células y fluidos biológicos, y puede más allá del análisis de contenido molecular también ser útil en los estudios funcionales.

Aislamiento y caracterización de ARN que contienen exosomas

Un paso a paso el protocolo para aislar e identificar los complejos de ARN asociados a través de RIP-Chip.

Método para el aislamiento e identificación de mRNAs, microRNAs y componentes proteicos de ribonucleoprotein complejos de extractos celulares usando RIP-Chip

Este protocolo describe un método para la extracción de ARN pequeños a partir de suero humano. Hemos utilizado este método para aislar los microARNs de suero de cáncer para su uso en arrays de ADN y PCR cuantitativa singleplex. El protocolo utiliza fenol y tiocianato de guanidina reactivos con modificaciones para producir ARN de alta calidad.

El aislamiento de los pequeños RNAs no codificantes de suero humano

Los microRNAs (miRNAs) son una clase ampliamente conservada de moléculas reguladoras. Aquí describimos un método de clonación de miRNA que se basa en dos potentes pasos de ligadura seguidos de una secuenciación de alto rendimiento. Nuestro método permite una cuantificación precisa de miRNAs en todo el genoma.

Ligadura Altamente Eficiente de los Pequeños ARN moléculas de microARN cuantificación mediante secuenciación de alto rendimiento

La expresión de genes de un subconjunto de células en un tejido específico representa un reto importante. En este artículo se describe cómo aislar el ARN total de alta calidad a partir de una población de células específicas mediante la combinación de un método immunolabeling rápida con láser captura microdissection.

Aislamiento de ARN a partir de células subpoblaciones específicas utilizando láser captura Microdissection Combinado con Rapid Immunolabeling

MicroARNs juegan un importante papel regulador y están surgiendo como nuevas dianas terapéuticas para diversas enfermedades humanas. Se ha demostrado que miRNAs se realizan en las lipoproteínas de alta densidad. Hemos desarrollado un método simplificado para aislar rápidamente HDL purificado adecuado para el análisis de los genes miARN partir de plasma humano.

Método rápido y simplificado para el aislamiento alto rendimiento de procesamiento de miRNA desde muy puras lipoproteína de alta densidad

Factores epigenéticos pueden interactuar con programas genéticos que modulan la expresión génica y regulan la función de la célula de B. Mediante la combinación de la estimulación in vitro de células B, qRT-PCR y alto rendimiento microARN-secuencia y secuencia de ARNm enfoques, podemos analizar la modulación epigenética de miRNA y expresión genética en las células de B.

Genoma-ancha análisis de inhibidor de HDAC mediada por modulación de microRNAs y mRNAs en células B inducida por recombinación del ADN someterse a interruptor de clase y diferenciación de células plasmáticas

gotitas de lípidos son orgánulos importantes para la replicación de varios patógenos, incluyendo el virus de la hepatitis C (VHC). Se describe un método para aislar las gotas de lípidos para la espectrometría de masas cuantitativa de proteínas asociadas; se puede utilizar bajo una variedad de condiciones, tales como infección por el virus, el estrés ambiental, o tratamiento con fármacos.

Aislamiento gotas de lípidos para el análisis cuantitativo de Espectrometría de Masas

Aquí, se presenta un protocolo cuantitativo en tiempo real basado en la reacción en cadena de la polimerasa para la determinación del contenido nativo de microARN (absoluto/relativo) de las partículas de lipoproteína. Además, se demuestra un método para aumentar el nivel de microARN, así como un método para determinar la tasa de captación celular de las partículas de lipoproteínas.

Enriquecimiento de partículas de lipoproteínas nativas con microRNA y determinación posterior de su contenido absoluto/relativo de microRNA y su tasa de transferencia celular

Este protocolo proporciona un método eficiente de digestión de colagenasas para el aislamiento de adipocitos viables y células de la fracción vascular estromal-SVF de grasa visceral humana en un solo proceso, incluida la metodología para obtener ARN de alta calidad de los adipocitos y la fenotipificación de los macrófagos SVF mediante la tinción de múltiples marcadores unidos a la membrana para su análisis por citometría de flujo.

Aislamiento de adipocitos viables y fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo visceral humano adecuado para análisis de ARN y fenotipado de macrófagos

Aprenda a aislar lipoproteínas de alta densidad para cuantificar ARN pequeños no codificantes mediante ultracentrifugación en gradiente de densidad. Este método permite analizar cambios en ARN en condiciones experimentales y de enfermedad.

El aislamiento de las lipoproteínas de alta densidad para no codificante ARN pequeño Cuantificación

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