Name: Visualización en vivo de las vesículas sinápticas En Drosophila segmentaria axones larvas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-15T16:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Aprende a visualizar vesículas sinápticas en axones de larvas de Drosophila mediante microscopía de fluorescencia in vivo. Este método permite estudiar el transporte axonal en tiempo real para investigar enfermedades neurológicas.

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SG es apoyado por fondos de la Universidad Estatal de Nueva York en Buffalo y de John R. Oishei Fundación. MK fue apoyado por un Premio de Investigación de Estudiantes de la UB por curca.

1. Preparación de los reactivos <ol><li> Prepare la preparación de amortiguación disección mediante la adición de los siguientes compuestos: 128 mM NaCl, 1 mM EGTA, 4 mM de MgCl 2, 2 mM KCl, HEPES 5 mM y 36 mM de sacarosa en 1000 ml, el pH a 7,2 y el filtro de esterilización. </li></ol> 2. Preparación para la disección <ol><li> Cubo Siligard: El gel se corta a aproximadamente una pulgada de ancho, una pulgada de largo y aproximadamente 1 cm de alto. El cubo de gel se coloca en un portaobjetos de vidrio durante la disección. Los cubos se pueden utilizar más de una vez. </li><li> Pins: pins utilizados para la disección debe ser muy corto. La parte inferior de pasadores fuerte minutien funciona mejor en la disección. </li><li> Necesidad de una tijeras afiladas primavera microdisección. </li><li> Necesita dos pinzas de punta fina. </li></ol> 3. Recolección de larvas <ol><li> Vagando 3 de larvas que son expresión de una proteína GFP etiquetados vesículas se recogen en una placa de Petri. </li><li> Las larvas se lavan con agua desionizada para deshacerse de todos los alimentos. </li></ol> 4. La disección en vivo de larvas <ol><li> Una larva se transfiere al cubo de gel de la disección de un portaobjetos de vidrio. Larva se encuentra inmersa en un tampón de disección. </li><li> Larva se consumía en el anterior y posterior uso de dos pines muy bien con el dorso hacia arriba. </li><li> El uso de tijeras de microdisección, una pequeña incisión en la línea media cerca del extremo posterior. A partir de esta incisión se hace una incisión a través de la anterior. El uso de dos pines, el pin de la cutícula corte en los bordes laterales. </li><li> Añadir una gota de la disección de buffer. Retire con cuidado el intestino, los intestinos y los órganos de grasa con fórceps. La mayoría de estos tejidos que normalmente se escurre durante el corte dorsal. </li><li> Vuelva a colocar el tampón con el tampón fresco de disección. La larva no debe estar seca y deben estar constantemente en la disección de amortiguamiento. </li><li> Incubaciones con los marcadores en vivo o MitoTracker LysoTracker se llevan a cabo en este momento, diluyendo el marcador en vivo en un tampón de disección. Después de la incubación de los marcadores en vivo lavar la larva diseccionado varias veces (cinco lavados rápidos) con tampón fresco de disección. </li><li> Después de reemplazar el último lavado, empujar las clavijas en el syligard y cubreobjetos de inmediato. Las larvas ya está listo para la observación. </li></ol> 5. Imágenes en vivo de larvas disecadas <ol><li> Coloque el cubreobjetos y gel en la platina del microscopio y la imagen mediante un microscopio invertido. </li><li> Utilizamos un lente de 100x a las vesículas de imagen etiquetada dentro de las larvas nervios segmentarios. La expresión de GFP en los cuerpos celulares del ganglio ventral se evalúa en primer lugar antes de los nervios segmentarios se va a examinar. Si la tinción GFP robusta que se observa en los cuerpos celulares en el ganglio ventral, los nervios están a continuación, imágenes y para su evaluación. </li><li> El uso de un sistema de visión dual con filtros para PPC / YFP o RFP YFP / software y división de opiniones que puede, simultáneamente, imágenes de dos proteínas marcadas en vivo. </li></ol> 6. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2151/2151fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1:. Una imagen representativa que muestra muchas vesículas axonal en muchas pistas axonal en el nervio segmentario larvas Nota las manchas de la GFP, lo que representa la acumulación axonal. <img src="/files/ftp_upload/2151/2151fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: Una imagen representativa que muestra una pista única axonal con muchas vesículas axonal en el nervio segmentario larval.

<ol><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Hurd, D. D., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+mutations+cause+motor+neuron+disease+phenotypes+by+disrupting+fast+axonal+transport+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila.</a> Genetics. 144, 1075-1085 (1996).</li>
<li>Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+axonal+transport+by+loss+of+huntingtin+or+expression+of+pathogenic+polyQ+proteins+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila.</a> Neuron. 40, 25-40 (2003).</li>
</ol>

Imágenes in vivo de transporte de vesículas sinápticas en Drosophila nervios larvas segmentaria es una poderosa herramienta para el estudio de los mecanismos en el transporte axonal. Hemos utilizado anteriormente este protocolo para evaluar la dinámica de transporte dentro de los nervios larvas expresar ampliado repite polyQ para dilucidar cómo la expansión de repeticiones afectan a la dinámica del transporte de vesículas 3. El uso de este protocolo la velocidad de movimiento de la ...

<table><tbody><tr><td>1 par de tijeras de disección micro</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>Tijeras de resorte &amp;#8211; hoja de 6 mm. Diámetro de la punta de 0,125 mm</td></tr><tr><td>2 pares de pinzas</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Pinzas micro-Adson para disección con punta serrada Fisherbrand</td></tr><tr><td>Caja de alfileres de disección</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>Alfileres Minutien de 0,1 mm de diámetro</td></tr></tbody></table>

visualización en vivo de las vesículas sinápticas en drosophila segmentaria axones larvas

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidar los mecanismos de transporte axonal ha demostrado ser muy importante para determinar cómo los defectos en el transporte de larga distancia afecta a diferentes enfermedades neurológicas. Los defectos en este proceso esencial puede tener efectos perjudiciales en el funcionamiento neuronal y el desarrollo. Hemos desarrollado un protocolo de disección que está diseñado para exponer los<em&gt; Drosophila</em&gt; Nervios larvas segmentaria para ver el transporte axonal en tiempo real. Hemos adaptado este protocolo para obtener imágenes en vivo desde el publicado por Hurd y Saxton (1996) utiliza para immunolocalizatin de las larvas de los nervios segmentarios. Disección cuidadosa y condiciones adecuadas de amortiguación son críticos para maximizar la vida útil de las larvas disecadas. Cuando se hace correctamente, las larvas disecados han demostrado el transporte de vesículas robusta durante 2-3 horas en condiciones fisiológicas. Usamos el método de UAS-GAL4<sup&gt; 1</sup&gt; Para expresar GFP-etiquetados APP o vesículas sinaptotagmina dentro de un solo axón o axones muchos nervios en las larvas segmentaria mediante el uso de diferentes neuronal GAL4 conductores. Otros marcadores marcados con fluorescencia, por ejemplo, mitocondrias (MitoTracker) o lisosomas (LysoTracker), puede aplicarse también a las larvas antes de ver. GFP-vesícula movimiento y el movimiento de partículas se pueden ver simultáneamente con longitudes de onda diferentes.

Este protocolo describe la disección en vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas con el propósito de la imagen del movimiento de las buenas prácticas agrarias etiquetados vesículas axonal en rieles de microtúbulos.

Visualización en vivo de las vesículas sinápticas En Drosophila segmentaria axones larvas

El esclarecimiento de los mecanismos del transporte axonal ha demostrado ser fundamental para determinar cómo los defectos en el transporte a larga distancia afectan a diferentes...

Para estudiar si existen defectos en el transporte axonal de larga distancia en enfermedades neurológicas como la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Huntington. Se obtiene una imagen del transporte axonal de vesículas de transporte en larvas esofágicas vivas. Aquí preguntándose.Se disecan terceras larvas en estadio estrella que expresan una proteína física marcada con GFP sobre un cubo de gel, y luego se transfieren al microscopio para la obtención de imágenes in vivo. A continuación, se utiliza microscopía de fluorescencia para rastrear el transporte físico dentro del axón. La principal ventaja de utilizar esta técnica frente a los métodos existentes es la visualización del movimiento vivo y no interrumpido de vesículas sinápticas y axones larvales.Prepárese para la disección asegurándose de que los siguientes materiales y reactivos estén disponibles. Buffer de disección. Un cubo protector Sill cortado de una pulgada de ancho, una pulgada de largo y un centímetro de alto colocado sobre un portaobjetos de vidrio.Alfileres de disección extra cortos. La parte inferior afilada de los alfileres manum funciona mejor en la disección. La longitud correcta se puede obtener insertando alfileres más largos en el gel y cortando cualquier parte del alfiler que sobresalga.También necesitará un par de tijeras de resorte para microdisección afiladas y dos juegos de pinzas de punta fina. Utilice una espátula metálica pequeña para transferir larvas de tercer estadio en estrella que expresan una proteína SLE marcada con GFP a una placa de Petri.A continuación, aplique agua desionizada a las larvas en la placa de Petri para eliminar toda la comida. Luego, utilizando pinzas, transfiéralas a un cubo de gel para disección para realizar la disección en vivo. Use pinzas para transferir una larva al cubo de gel de disección.En un portaobjetos de vidrio, agregue tampón de disección al portaobjetos para sumergirlo. A continuación, sujete la larva en los extremos anterior y posterior con el lado dorsal hacia arriba. Utilizando tijeras de microdisección, realice un pequeño corte en la línea media cerca del extremo posterior.Desde esta incisión, realice otro corte hacia la parte anterior. Los intestinos y los cuerpos grasos saldrán usando dos alfileres. Fije la cutícula cortada a los bordes laterales del cubo de silicón.Utilice una pipeta para agregar una gota de tampón de disección. Luego, con pinzas, retire cuidadosamente los intestinos del intestino y los cuerpos grasos. Aplique una toalla absorbente kimwipe a un lado de la larva para eliminar el tampón, mientras simultáneamente agrega tampón de disección fresco con una pipeta.La lava nunca debe estar seca. Para marcar estructuras mitocondriales o lisosomales en la lava, sustituya el tampón de disección por tampón de disección que contenga mito tracker o lyo tracker. Coloque el cubo de disección en una cámara cuadrada humedecida y cúbralo con papel de aluminio.Incube durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación del marcador in vivo, aspire repetidamente el tampón de disección que rodea a las larvas y añada más tampón de disección con una pipeta. Repita este procedimiento cinco veces para eliminar cualquier marcador residual.Después de reemplazar el último lavado, introduzca completamente los pasadores en la guarda S e inmediatamente coloque un cubreobjetos para evitar el movimiento de la larva. La larva ya está lista para la observación para realizar imágenes en vivo de la larva diseccionada. Coloque la muestra sobre la platina de un microscopio invertido para visualizar vesículas marcadas.Dentro de los nervios segmentarios larvales. Realice la obtención de imágenes utilizando un objetivo de 100 aumentos. Si la tinción de GFP es intensa, se observa en los cuerpos celulares en la imagen del ganglio ventral; los nervios segmentarios se analizan mediante un sistema de doble vista con filtros para C-F-P-Y-F-P o R-F-P-Y-F-P, y con software de vista dividida, se pueden observar simultáneamente dos proteínas marcadas in vivo.En esta serie de lapsos de tiempo se observan muchas vesículas axonales en múltiples trayectos axonales dentro de un nervio segmentario de larva. Téngase en cuenta que la GFP que representa acumulaciones axonales también muestra el movimiento bidireccional de las vesículas. Aquí, se observa el movimiento de vesículas axonales en un único trayecto dentro de un nervio segmentario de larva.Téngase en cuenta que el movimiento bidireccional de estos sles es, en promedio, un micrón por segundo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar una disección limpia para la observación in vivo de vesículas marcadas con GFP y axones larvales gsof.

in-vivo-visualization-synaptic-vesicles-within-drosophila-larval

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Se describen las características estructurales de la sinapsis neuromuscular Glia-en una nueva preparación de tejidos de adentro hacia afuera de las larvas de mosca en directo con tintes fluorescentes con microscopía confocal. Hemos marcado terminales de las neuronas en vivo con anticuerpos fluorescentes primaria de HRP, y también se visualiza el espacio perisynaptic con dextranos fluorescentes.

Visualizar el vivo Drosophila Gliales-unión neuromuscular con tintes fluorescentes

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Este video muestra un protocolo para estudiar el reciclaje de vesículas sinápticas en las uniones neuromusculares en larvas de Drosophila que expresan canalrodopsina utilizando un colorante fluorescente. La luz azul activa las canalrodopsinas, causando la entrada de calcio y la exocitosis de las vesículas sinápticas. El tinte se integra en las membranas neuronales y se internaliza durante la endocitosis, lo que da lugar a una mayor fluorescencia. Una mayor estimulación de la luz azul induce...

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Fuente: Jeong, S. Visualización del patrón de proyección axonal de las neuronas motoras embrionarias en Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Este video demuestra la visualización de proyecciones axonales en embriones de Drosophila. El inmunomarcaje de las neuronas motoras, la disección precisa para exponer las estructuras neuronales y la microscopía de contraste de interferencia diferencial revelan colectivamente una arquitectura neuronal detallada, enfatizando los patrones de proyección axonal.

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La inmunotinción es una técnica eficaz para visualizar tipos específicos de células y proteínas dentro de los tejidos. Al utilizar la sonicación, el protocolo descrito aquí alivia la necesidad de diseccionar tejidos de Drosophila melanogaster de embriones y larvas en fase avanzada antes de la inmunotinción. Proporcionamos una metodología eficiente para la inmunotinción de larvas enteras fijadas en formaldehído.

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Este trabajo detalla un método de inmunohistoquímica estándar para visualizar las proyecciones de neuronas motoras de los embriones de Drosophila melanogaster de etapa tardía-16. La preparación en filetes de embriones fijos teñidos con anticuerpos FasII proporciona una potente herramienta para caracterizar los genes necesarios para la búsqueda de axones motores y el reconocimiento de dianas durante el desarrollo neural.

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Aquí ilustramos cómo sola molécula de microscopía de localización foto-activado puede llevarse a cabo en la terminal del nervio motor de un vivo Drosophila melanogaster tercer instar de la larva.

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Aprende a visualizar vesículas sinápticas en axones de larvas de Drosophila mediante microscopía de fluorescencia in vivo. Este método permite estudiar el transporte axonal en tiempo real para investigar enfermedades neurológicas.

Visualización en vivo de las vesículas sinápticas En Drosophila segmentaria axones larvas

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