Visualización en vivo de las vesículas sinápticas En Drosophila segmentaria axones larvas
15 de octubre de 2010
Este protocolo describe la disección en vivo de Drosophila Larvas con el propósito de la imagen del movimiento de las buenas prácticas agrarias etiquetados vesículas axonal en rieles de microtúbulos.
Para estudiar si existen defectos en el transporte axonal de larga distancia en enfermedades neurológicas como la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Huntington. Se obtiene una imagen del transporte axonal de vesículas de transporte en larvas esofágicas vivas. Aquí preguntándose.
Se disecan terceras larvas en estadio estrella que expresan una proteína física marcada con GFP sobre un cubo de gel, y luego se transfieren al microscopio para la obtención de imágenes in vivo. A continuación, se utiliza microscopía de fluorescencia para rastrear el transporte físico dentro del axón. La principal ventaja de utilizar esta técnica frente a los métodos existentes es la visualización del movimiento vivo y no interrumpido de vesículas sinápticas y axones larvales.
Prepárese para la disección asegurándose de que los siguientes materiales y reactivos estén disponibles. Buffer de disección. Un cubo protector Sill cortado de una pulgada de ancho, una pulgada de largo y un centímetro de alto colocado sobre un portaobjetos de vidrio.
Alfileres de disección extra cortos. La parte inferior afilada de los alfileres manum funciona mejor en la disección. La longitud correcta se puede obtener insertando alfileres más largos en el gel y cortando cualquier parte del alfiler que sobresalga.
También necesitará un par de tijeras de resorte para microdisección afiladas y dos juegos de pinzas de punta fina. Utilice una espátula metálica pequeña para transferir larvas de tercer estadio en estrella que expresan una proteína SLE marcada con GFP a una placa de Petri.
A continuación, aplique agua desionizada a las larvas en la placa de Petri para eliminar toda la comida. Luego, utilizando pinzas, transfiéralas a un cubo de gel para disección para realizar la disección en vivo. Use pinzas para transferir una larva al cubo de gel de disección.
En un portaobjetos de vidrio, agregue tampón de disección al portaobjetos para sumergirlo. A continuación, sujete la larva en los extremos anterior y posterior con el lado dorsal hacia arriba. Utilizando tijeras de microdisección, realice un pequeño corte en la línea media cerca del extremo posterior.
Desde esta incisión, realice otro corte hacia la parte anterior. Los intestinos y los cuerpos grasos saldrán usando dos alfileres. Fije la cutícula cortada a los bordes laterales del cubo de silicón.
Utilice una pipeta para agregar una gota de tampón de disección. Luego, con pinzas, retire cuidadosamente los intestinos del intestino y los cuerpos grasos. Aplique una toalla absorbente kimwipe a un lado de la larva para eliminar el tampón, mientras simultáneamente agrega tampón de disección fresco con una pipeta.
La lava nunca debe estar seca. Para marcar estructuras mitocondriales o lisosomales en la lava, sustituya el tampón de disección por tampón de disección que contenga mito tracker o lyo tracker. Coloque el cubo de disección en una cámara cuadrada humedecida y cúbralo con papel de aluminio.
Incube durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación del marcador in vivo, aspire repetidamente el tampón de disección que rodea a las larvas y añada más tampón de disección con una pipeta. Repita este procedimiento cinco veces para eliminar cualquier marcador residual.
Después de reemplazar el último lavado, introduzca completamente los pasadores en la guarda S e inmediatamente coloque un cubreobjetos para evitar el movimiento de la larva. La larva ya está lista para la observación para realizar imágenes en vivo de la larva diseccionada. Coloque la muestra sobre la platina de un microscopio invertido para visualizar vesículas marcadas.
Dentro de los nervios segmentarios larvales. Realice la obtención de imágenes utilizando un objetivo de 100 aumentos. Si la tinción de GFP es intensa, se observa en los cuerpos celulares en la imagen del ganglio ventral; los nervios segmentarios se analizan mediante un sistema de doble vista con filtros para C-F-P-Y-F-P o R-F-P-Y-F-P, y con software de vista dividida, se pueden observar simultáneamente dos proteínas marcadas in vivo.
En esta serie de lapsos de tiempo se observan muchas vesículas axonales en múltiples trayectos axonales dentro de un nervio segmentario de larva. Téngase en cuenta que la GFP que representa acumulaciones axonales también muestra el movimiento bidireccional de las vesículas. Aquí, se observa el movimiento de vesículas axonales en un único trayecto dentro de un nervio segmentario de larva.
Téngase en cuenta que el movimiento bidireccional de estos sles es, en promedio, un micrón por segundo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar una disección limpia para la observación in vivo de vesículas marcadas con GFP y axones larvales gsof.
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Descripción general
Este protocolo describe la disección en vivo de larvas de Drosophila para obtener imágenes del movimiento de vesículas axonales marcadas con GFP sobre rastros de microtúbulos. Esta técnica permite la visualización del movimiento vivo y sin interrupciones de las vesículas sinápticas dentro de los axones larvales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Técnicas de imagen
Antecedentes
- El transporte axonal es fundamental para la función neuronal.
- Los defectos en el transporte axonal están asociados a enfermedades neurológicas.
- Las larvas de Drosophila sirven como organismo modelo para estudiar estos procesos.
- La microscopía de fluorescencia permite la observación en tiempo real del movimiento de vesículas.
Objetivo del estudio
- Investigar defectos en el transporte axonal de larga distancia.
- Comprender las implicaciones de estos defectos en enfermedades neurológicas.
- Utilizar técnicas de imagen en vivo para una observación mejorada.
Métodos Utilizados
- Diseción de larvas de Drosophila que expresan proteínas marcadas con GFP.
- Transferencia de larvas disecadas a un cubo de gel para mayor estabilidad.
- Imagen en vivo mediante microscopía de fluorescencia.
- Seguimiento del transporte de vesículas dentro de los axones.
Resultados principales
- Visualización exitosa del transporte axonal en larvas vivas.
- Demuestra el movimiento de vesículas marcadas con GFP.
- Información sobre la dinámica del transporte de vesículas sinápticas.
- La comparación con métodos existentes resalta las ventajas de este enfoque.
Conclusiones
- El protocolo proporciona una herramienta valiosa para estudiar el transporte axonal.
- La imagenología en vivo revela información crítica sobre la función neuronal.
- Este método puede aplicarse para investigar diversas afecciones neurológicas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Comprender la dinámica del transporte axonal es fundamental para reducir los riesgos asociados con las dianas terapéuticas en enfermedades neurodegenerativas, ya que los defectos en el tráfico de vesículas están vinculados mecanísticamente al Alzheimer, Huntington y la ELA. Este modelo de axón en larva de Drosophila permite la visualización en tiempo real del movimiento de vesículas sinápticas, proporcionando un sistema predictivo y relevante para la enfermedad, útil para la validación temprana de dianas y para obtener información mecanicista. Al cuantificar el flujo bidireccional de vesículas y las tasas de transporte, el método apoya decisiones de avance o interrupción en programas preclínicos centrados en la integridad axonal.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas mediante la visualización del transporte de vesículas marcadas con GFP-APP o sinaptotagmina en axones vivos.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de dianas mediante la observación directa de la dinámica de vesículas en un sistema genéticamente modificable.
- Valor predictivo: Apoya la reducción mecanicista de riesgos al vincular defectos en el transporte con disfunción neuronal en modelos de enfermedad.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Prepara sistemas axonales validados para la selección de compuestos mediante el establecimiento de la movilidad basal de vesículas en condiciones fisiológicas.
- Valor operativo: Proporciona lecturas cuantitativas y reproducibles del movimiento de vesículas (por ejemplo, flujo bidireccional de 1 µm/s) para la estandarización de ensayos.
- Valor estratégico: Permite flujos de trabajo de imagen escalables y compatibles con plataformas para evaluar los efectos de compuestos sobre el transporte axonal.
Investigación Translacional y Preclínica
- Valor científico: Se alinea con sistemas relevantes para enfermedades al modelar defectos de transporte observados en afecciones neurodegenerativas humanas.
- Valor operativo: Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante imágenes en vivo del transporte de vesículas en nervios larvales intactos.
- Reducción de riesgos: Orienta las decisiones de avance al cuantificar la recuperación o agravamiento del transporte por moduladores candidatos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la etapa preclínica, apoyando la comprobación de hipótesis en la fase inicial de descubrimiento, la preparación de ensayos en la selección y la validación mecanicista en las etapas preclínicas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la aclaración de vías y la reducción del riesgo biológico mediante la visualización del transporte de vesículas en respuesta a perturbaciones genéticas o farmacológicas.
- Tamizaje: Permite la preparación del ensayo mediante protocolos estandarizados de disección, tinción e imagen que producen métricas consistentes de motilidad vesicular.
- Análisis: Genera mediciones cuantitativas de variables dependientes (velocidad, direccionalidad, flujo) que permiten comparaciones entre condiciones experimentales.
- Investigación Traductiva: Se conecta con la continuidad preclínica al modelar defectos en el transporte axonal relevantes para enfermedades neurológicas humanas.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de imagen reutilizable para estudios longitudinales de la integridad axonal en múltiples clases de dianas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de objetivos mediante la visualización directa de la dinámica de las vesículas sinápticas.
- Valor operativo: Normalización y reproducibilidad mediante condiciones definidas del tampón de disección y parámetros de imagen.
- Valor estratégico: Mejora en las decisiones de avance/no avance al reducir la ambigüedad mecanicista en las hipótesis sobre el transporte axonal.
- Impacto en el portafolio: Priorización ajustada al riesgo de objetivos basada en la eficacia de rescate del transporte en modelos relevantes para la enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de Drosophila, microdisección y microscopía de fluorescencia.
- Depende de un microscopio invertido con objetivo de 100x, sistema de doble visión y juegos de filtros adecuados para GFP y otros fluoróforos.
- Necesita la estandarización del tampón de disección, la clasificación por etapas de larvas y controles ambientales (cámara humedecida, temperatura).
- Las consideraciones para la adaptación incluyen la expresión de diferentes cargas marcadas con GFP (por ejemplo, mitocondrias, lisosomas) mediante conductores neuronales GAL4.
- Las limitaciones prácticas incluyen el tiempo de preparación de las larvas y la ventana de 2–3 horas para un transporte vesicular robusto tras la disección.
