Name: La inyección de una. Los embriones stephensi para generar la malaria resistente a los mosquitos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Aprende la técnica de microinyección en embriones de Anopheles stephensi para generar mosquitos transgénicos resistentes a la malaria. Este método permite modificar genéticamente vectores de enfermedades.

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Preparación antes de la microinyección: <ol><li> Los mosquitos la sangre de alimentación: para la inyección de lunes a miércoles en hembras se alimentan del viernes anterior. Para inyectar el jueves y viernes, las hembras se alimentan de lunes de la misma semana. </li><li> Prepare las agujas de cuarzo, utilizando el programa 2 y tampón isotónico (ver Materiales). </li><li> &quot;Colocación de tubo&quot; de los embriones es la normal vial Drosophila cultura. Algodón húmedo en la parte inferior, con un disco de papel de filtro húmedo que lo cubre. </li><li> Prepare cubreobjetos de plástico adhesiva de doble cara de la cinta a un extremo. Cinta de ajuste para cubrir deslizamiento de forma que termine en el borde del cubreobjetos. </li><li> Preparar el aceite para la desecación. </li><li> Prepare una placa de Petri con tampón isotónica para la transferencia de embriones para incubar. </li></ol> Puesta en marcha de por la que se obligó: <ol><li> Recoger 60-10 hembras alimentadas con sangre con el uso de un aspirador y transferirlos a la cultura vial Drosophila con algodón y papel de filtro húmedo con tampón isotónico. </li><li> Los mosquitos son puestos de nuevo en condiciones insectery en la oscuridad y se les permite poner sus huevos durante 1 hora y 15 minutos. </li><li> Permiten a los adultos vuelan en la jaula y retire el disco de papel filtro con embriones. </li><li> Para alinear los huevos, lo hacen bajo el microscopio de disección. Recoger los racimos de huevos con un pincel fino (Sable, No 0000) y traslado a una plaza preparada de papel Whatman 3MM empapado en tampón isotónico. Mantenga el papel todo el tiempo húmedo. No permitas que los huevos se desecado. Retire la exochorion con el cepillo, que ayuda a pegar mejor los huevos en la cinta. </li><li> El uso de fórceps fino N º 5 o un pincel fino, recoger más oscuro embriones gris y arreglos en línea en la plaza de Whatman 3MM humedecido con tampón isotónico. Línea hasta 20 a 30 embriones. Todos los embriones debe estar en la misma orientación que la inyección tiene que ser en el polo posterior. El extremo anterior de los embriones es ligeramente más ancha que la posterior. Luego, utilizando tiras de papel Whatman 3MM, secar el filtro donde los huevos están alineados al presionar con fuerza a ambos lados de la línea de huevo, sin tocar los huevos. </li><li> Para transferir los huevos, invertir la diapositiva que contiene la cinta de doble cara (Medicina), y presione suavemente contra los huevos. El extremo posterior de los huevos tienen que estar muy cerca de la orilla de la cinta de doble cara. La humedad del papel es fundamental para esto, si es demasiado húmedo no se peguen. Yo hago la desecación de los embriones de 5-10 segundos, pero el tiempo depende de la desecación de humedad y temperatura en la sala de microinyección. </li><li> La desecación es crucial para los huevos: poco demasiado y embriones no van a eclosionar. Sin un ADN desecación no va a embrión. </li><li> Cubrir los embriones desecados con aceite para evitar la desecación de halocarbonos más. </li></ol> Microinyección de los embriones: El aspecto más importante de la inyección es la calidad de la aguja (ver nota). <ol><li> Llenará una aguja con la solución de ADN que se inyecta mediante una microloader (Eppendorf # 5242 956.003). Soliution muy pequeña inyección es necesaria, de 1 a 2 ml. </li><li> Conecte la aguja a la Transjector Eppendorf, que controla el tiempo de inyección y la presión, así como la contrapresión. Microinyección se realizó con un microscopio con una etapa de movimiento (Leica) en x 10 aumentos y un micromanipulador (Leica). Si es necesario, una platina del microscopio planteado puede ser preparado por el apilamiento de diapositivas 4-5 microscopio. Coloque la hoja de la cubierta lleva los embriones en etapa levantada. Los embriones se inyectan en un ángulo de 150 °, la penetración debe ser en el polo posterior. Para la inyección, que mantener la aguja fija y mover la platina del microscopio. Cuando la aguja es nueva, la punta está sellada y generalmente se rompe en la primera inyección. Yo siempre trabajo con la presión necesaria para expulsar a una pequeña gota de ADN en el aceite entre cada inyección. </li><li> Me puse el tiempo de inyección de 0,2 a 0,9 seg y 1000 hPa, cuando la aguja es nueva. Puedo variar la presión y el tiempo hasta que una pequeña gota se ve que sale de la aguja en el aceite. La contrapresión es necesario establecer alrededor de 100. A medida que la punta de la aguja se desgasta, la presión de inyección se debe reducir para mantener al mínimo el volumen de la inyección (cerca de 300 hPa). Después de esto, la punta de la aguja es demasiado grande y está matando a la mayoría de los embriones. </li><li> Después de la inyección, extraer el aceite con papel de seda y cubierta de la diapositiva con embriones y el lugar de la placa de Petri con tampón isotónico. Colocar las cápsulas en el insectory y los dejan allí hasta que los embriones eclosionan. Comienzan a nacer después de 2-6 días. Transferencia de las larvas al agua destilada con la pizca de comida de peces de fondo. </li></ol> Notas ADN para la inyección: solución de ADN plásmido para la inyección fue aislado utilizando el kit plásmido EndoFree.Construir el plásmido y la mezcla de plásmido ayudante juntos en la concentración de la derecha, se precipitó con isopropanol. El sedimento se lavó con etanol al 70% antes de resuspender en tampón de inyección. Antes de la inyección, el ADN limpia utilizando Millex-GV columna. Buffer Izotonic: <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> 1,68 M NaCl - 88,3 ml 1,68 M NaCl - 2,9 m 1 M Hepes -10,7 ml 1,12 M CaCl 2 a 2,2 ml dH 2 O - 896 ml </td><td> O </td><td> 5 M NaCl - 29,67 ml KCl 1 M - 4,87 ml Hepes 1 M - 10,7 ml 1,12 M CaCl 2 a 2,2 ml dH 2 O - 952,56 ml </td></tr></tbody></table> Ajustar el pH a 7.2

<table><tbody><tr><td>Agujas de cuarzo para inyección</td><td></td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>Se preparan con tubos capilares de 1,0 mm de diámetro externo, 0,70 mm de diámetro interno y 10 cm de longitud, estirados hasta obtener una punta fina de 3-8 µm y un vástago de aproximadamente 100-300 mm mediante un estirador de micropipetas.</td></tr><tr><td>Estirador de cuarzo</td><td>Herramienta</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-2000</td><td>Configuración: Calor-275, Fil-3, Vel-38, Ret-250, Tracción-141</td></tr><tr><td>Kit de plásmido EndoFree</td><td></td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Columna Millex-GV</td><td></td><td></td><td>SLGV RO4 NL</td><td>para limpieza de ADN</td></tr><tr><td>ADN del constructo</td><td></td><td></td><td></td><td>0,5 mg/ml</td></tr><tr><td>Plásmido auxiliar</td><td></td><td></td><td></td><td>0,3 mg/ml</td></tr><tr><td>Solución de inyección</td><td>Tampón</td><td></td><td></td><td>Solución 1x: 5 mM KCl, 0,1 mM fosfato sódico, pH 6,8</td></tr><tr><td>Tampón isotónico</td><td></td><td></td><td></td><td>ver receta en la sección del protocolo</td></tr><tr><td>Aceite desecante</td><td></td><td></td><td></td><td>Aceite Halocarbono 700: Aceite Halocarbono 27 (1:1). Mezclar bien. Preparar con antelación a la microinyección.</td></tr><tr><td>Sangre</td><td></td><td></td><td></td><td>para alimentar a los mosquitos</td></tr><tr><td>Anopheles stephensi</td><td>Animal</td><td></td><td></td><td>Mosquitos, machos y hembras.</td></tr><tr><td>Vial de cultivo de Drosophila</td><td></td><td></td><td></td><td>para la puesta de huevos</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td></td><td></td><td></td><td>con tampón isotónico, para la eclosión de embriones</td></tr><tr><td>Pincel fino</td><td></td><td></td><td></td><td>Sable n.º 0000</td></tr><tr><td>Papel Whatman 3MM</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzas n.º 5</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cinta de doble cara</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microloader</td><td></td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>Transjector</td><td></td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>con platina móvil y micromanipulador, ajustado a 10x de magnificación</td></tr></tbody></table>

la inyección de una. los embriones stephensi para generar la malaria resistente a los mosquitos

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

La introducción de genes exógenos en los genomas de los mosquitos requiere técnicas de microinyección adaptados a las especies de interés. Este protocolo de vídeo se muestra un método utilizado por el laboratorio de James microinject construcciones de ADN en embriones Anopheles stephensi para la generación de mosquitos transformado. Técnicas para la preparación de las agujas de microinyección, recolección y preparación de los embriones y la realización de la microinyección se ilustran.

Los mosquitos Anopheles stephensi son vectores de la malaria que habitan en la India y en toda Asia. Este video muestra la técnica para la realización de micro-inyecciones de esta especie con transgenes que confieren resistencia a la malaria a los mosquitos. Gran parte de la metodología se demuestra en este vídeo es aplicable a las técnicas de microinyección de otras especies de mosquitos.

La inyección de una. Los embriones stephensi para generar la malaria resistente a los mosquitos

La introducción de genes exógenos en los genomas de los mosquitos requiere técnicas de microinyección adaptadas a la especie específica de interés. Este...

Cada 15 segundos, hay un niño que muere de malaria en el mundo; aquí, en el laboratorio de James, estamos intentando crear mosquitos franceses que no puedan transmitir el parásito de la malaria. Mi nombre es TIUs. Estoy aquí en la Universidad de California en Irvine, en el Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, en el laboratorio de Anthony James.Hoy les mostraré cómo crear ojos transgénicos y no de Stevens. Estamos haciendo esto para hacer que los mosquitos sean refractarios a la malaria, de modo que no puedan transportar el parásito de la malaria. Ahora he preparado un tubo con tampón isotónico donde los mosquitos pondrán sus huevos.Voy a usar este aspirador para recolectar los mosquitos y colocarlos en un vial. Este vial luego se colocará en un incubador a 30 grados Celsius, y lo dejaremos durante aproximadamente una hora en un recipiente. Ahora vamos a preparar las agujas de microinyección.Estas son agujas hechas de cuarzo y debemos usar una punta muy fina. Por lo tanto, necesitamos este tirador de agujas. Utilizamos un tirador de agujas de Suter Instruments y también las agujas de Subtle en SU Instruments.Ahora saco los mosquitos y colocaré estos huevos en la placa de

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Research

Investigación

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Biología

Invertir enfoques genéticos han demostrado ser extremadamente útil para determinar qué genes de resistencia a patógenos vector subyacente en los mosquitos. Este protocolo de vídeo ilustra un método usado por el laboratorio de James para inyectar dsRNA en hembras de A. aegypti, que albergan el virus del dengue. La técnica para la calibración de agujas de inyección, la manipulación de la configuración de la inyección, y la inyección de dsRNA en el tórax se ilustra.

La inyección de dsRNA en Mujer A. aegypti mosquitos

En este video, Nijole Jasinskiene demuestra la metodología utilizada para generar transgénicos mosquito Aedes aegypti, que son vectores de la fiebre del dengue. Las técnicas para la correcta preparación de las agujas de microinyección, desecación embriones, y la realización de la microinyección se demuestran.

Microinyección de A. aegypti embriones para obtener los mosquitos transgénicos

En esta entrevista, George Dimopoulos se centra en los mecanismos fisiológicos utilizados por los mosquitos para combatir el Plasmodium falciparum y las infecciones del virus del dengue. Se da una explicación de cómo los genes resistentes clave, los genes que confieren resistencia a los patógenos de vectores, se identifican en el mosquito y cómo este conocimiento puede ser usado para generar los mosquitos transgénicos que no son capaces de llevar el parásito de la malaria o el virus del dengue.

La construcción de un mosquito mejor: La identificación de los genes que permiten resistencia a la malaria y el dengue en A. gambiae y A. aegypti

Cruces genéticos de los parásitos de la malaria de roedores se llevan a cabo por la alimentación de dos parásitos genéticamente distintos a los mosquitos. Recombinante progenie clonada a partir de la sangre del ratón después de permitir que los mosquitos que pican ratones infectados. Este vídeo muestra cómo se producen los cruces genéticos...

Protocolo para la producción de un cruce genético de los parásitos de la malaria de roedores

En este vídeo, demostramos la integración de transgenes específicos del sitio mediada por phiC31 en el embrión de Anopheles mediante microinyección. Este método ayuda a introducir los genes deseados en un sistema huésped para aplicaciones industriales y de investigación.

phiC31-Integración de transgenes dirigidos en el sitio mediada por integrasa: una técnica de microinyección para la integración de transgenes específicos del sitio en un vector Anopheles

En este video, demostramos la entrega de una construcción de impulsor genético en el embrión del mosquito Anopheles gambiae a través de la técnica de microinyección de embriones. Este procedimiento permite la integración de la construcción de ADN entregada, a través de la recombinación homóloga, en las células de la línea germinal para generar una población de mosquitos transformada.

Microinyección de embriones de mosquitos: una técnica para introducir ADN exógeno en la yema del embrión de Anopheles gambiae para generar mutaciones de la línea germinal

CRISPR/Cas9 se utiliza cada vez más para caracterizar la función génica en organismos no modelo. Este protocolo describe cómo generar líneas eliminatorias de Culex pipiens,desde la preparación de mezclas de inyección, hasta la obtención e inyección de embriones de mosquitos, así como la forma de criar, cruzar y detectar mosquitos inyectados y su progenie para detectar mutaciones deseadas.

Preparación e inyección de embriones de mosquitos Culex para generar mutaciones nulas utilizando CRISPR/Cas9

El protocolo describe cómo lograr modificaciones dirigidas al sitio en el genoma de los mosquitos de la malaria Anopheles utilizando el sistema φC31 . Las modificaciones descritas incluyen tanto la integración como el intercambio de casetes transgénicos en el genoma de las líneas de acoplamiento que llevan attP.

Integración mediada por φC31 dirigida por sitios e intercambio de casetes en anopheles vectores de malaria

Las técnicas de microinyección son esenciales para introducir genes exógenos en los genomas de los mosquitos. Este protocolo explica un método utilizado por el laboratorio James para microinyectar construcciones de ADN en embriones de Anopheles gambiae para generar mosquitos transformados.

Método de microinyección para embriones de Anopheles gambiae

La malaria se transmite a través de la inoculación de la etapa de esporozoíto de Plasmodium por mosquitos infectados. El Plasmodium transgénico nos ha permitido comprender mejor la biología de la malaria y ha contribuido directamente a los esfuerzos de desarrollo de vacunas contra la malaria. En este trabajo se describe una metodología simplificada para generar esporozoítos transgénicos de Plasmodium berghei .

Generación de esporozoítos de Plasmodium berghei modificados genéticamente

En este trabajo describimos un protocolo detallado para la edición del genoma mediante microinyección embrionaria en el mosquito A. aegypti utilizando la tecnología CRISPR-Cas9.

Edición del genoma del mosquito Aedes aegypti de la fiebre amarilla mediante CRISPR-Cas9

Aprende la técnica de microinyección en embriones de Anopheles stephensi para generar mosquitos transgénicos resistentes a la malaria. Este método permite modificar genéticamente vectores de enfermedades.

La inyección de una. Los embriones stephensi para generar la malaria resistente a los mosquitos

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