La inyección de una. Los embriones stephensi para generar la malaria resistente a los mosquitos

Cada 15 segundos, hay un niño que muere de malaria en el mundo; aquí, en el laboratorio de James, estamos intentando crear mosquitos franceses que no puedan transmitir el parásito de la malaria. Mi nombre es TIUs. Estoy aquí en la Universidad de California en Irvine, en el Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, en el laboratorio de Anthony James.

Hoy les mostraré cómo crear ojos transgénicos y no de Stevens. Estamos haciendo esto para hacer que los mosquitos sean refractarios a la malaria, de modo que no puedan transportar el parásito de la malaria. Ahora he preparado un tubo con tampón isotónico donde los mosquitos pondrán sus huevos.

Voy a usar este aspirador para recolectar los mosquitos y colocarlos en un vial. Este vial luego se colocará en un incubador a 30 grados Celsius, y lo dejaremos durante aproximadamente una hora en un recipiente. Ahora vamos a preparar las agujas de microinyección.

Estas son agujas hechas de cuarzo y debemos usar una punta muy fina. Por lo tanto, necesitamos este tirador de agujas. Utilizamos un tirador de agujas de Suter Instruments y también las agujas de Subtle en SU Instruments.

Ahora saco los mosquitos y colocaré estos huevos en la placa de Petri que contiene un papel de filtro empapado en tampón isotónico, lo cual tiene como fin mantener los embriones húmedos durante el periodo de inyección. La cantidad de agua en el papel de filtro es crítica. No debe permitirse que los huevos floten ni que se sequen.

Ahora voy a trasladar el embrión desde el papel de huevo a otro papel Watman de tres MM que ha sido empapado en tampón isotónico. Hago esto para eliminar la coriona antes de alinearlos para la microinyección. Ahora voy a retirar la coriona, que es esta superficie plateada de los huevos.

Y lo hago cepillándolos con mi pincel. Entonces, en la parte superior tenemos un embrión donde el corion aún está presente y tienen esta parte brillante y plateada. ¿Dónde está el de abajo?

He tenido éxito al retirar el Corian y este de arriba probablemente se deslice sobre una cinta, mientras que el de abajo se adherirá. Y eso es lo importante cuando se trabaja con un lado irregular. Ahora estoy alineando los embriones.

Los embriones son más grandes en el extremo anterior, y ese extremo lo coloco hacia la derecha. A la izquierda tengo el extremo posterior, que es más delgado y por donde inyectaré los embriones. Intento colocarlos juntos para que se ayuden mutuamente a mantenerse en posición.

Y normalmente hago alrededor de 10 juntos en una línea. Ahora tengo una línea, los embriones, y los transferiré a un cubreobjetos. Sobre el cubreobjetos.

Puse cinta adhesiva para pelucas para que se mantengan fijas. Una vez hecho esto, secaré el papel de filtro donde están los embriones con otro papel de filtro, colocaré los embriones sobre la laminilla y dejaré secar durante 30 segundos antes de aplicar aceite. Ahora hemos alineado los embriones y los tenemos bajo el aceite.

En la platina del microscopio, inyectaremos ADN mezclado con colorante alimentario utilizando esta punta especial del patrón de microbios e inyectaremos esta mezcla en las agujas del puerto. Ahora hemos llenado la aguja y la hemos colocado nuevamente en un microinyector. Y ahora estamos listos para realizar las microinyecciones.

Ahora estoy moviendo la aguja para afilarla y poder verla enfocada. Una vez hecho esto, muevo la aguja de peso y coloco los embriones, enfocándolos también. Y cuando esto está hecho, vuelvo a mover la aguja hasta tenerla en posición y procedo con mis embriones.

Ahora, cuando la aguja atraviesa el aceite, se vuelve borrosa y es necesario ajustarla nuevamente. Así que eso es exactamente tiburón. Exactamente, garrapata de tiburón.

Y ahora estoy listo para realizar las inyecciones. Pueden ver que toqué el embrión con la aguja, y al hacerlo rompí la punta y pueden observar una pequeña gota que sale y que sería inyectada en el embrión. Así que aquí inyecte y luego saque la aguja nuevamente.

Y verifico cada vez entre cada embrión que haya una pequeña gota saliendo hasta la punta de la aguja. Y como puede ver, necesito reajustar la posición para cada embrión para lograr una colocación perfecta. Ahora este estaba filtrando.

Como puede observarse, cuando realizo mi segunda inyección en el aceite, la burbuja se vuelve muy grande y necesito reajustar la presión del microinyector. Ahora ya hemos terminado con las microinyecciones y vamos a trasladar los embriones del microscopio a la placa de Petri, que hemos llenado con tampón isotónico. Limpiaré el aceite de la lámina cubreobjetos y la cortaré en un trozo pequeño, que colocaré dentro de la placa de Petri.

Ahora los dejaremos aquí hasta el final del día a temperatura ambiente. Luego los trasladaremos al insectario. Hoy les he mostrado cómo inyectar un embrión de *Aedes aegypti* para generar mosquitos transitorios.

Y ahora solo tenemos que esperar a que eclosionen todas las larvas. Las criaremos hasta la etapa adulta y luego se aparearán. Y después de eso tendremos tres semanas antes de poder comenzar una criba para determinar si son Refactor o no.