Name: Azul nativos electroforesis en gel de poliacrilamida (BN-PAGE) para el análisis de los complejos Multiproteinas de lisados celulares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-24T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Aprenda a caracterizar complejos multiproteicos de lisados celulares mediante electroforesis en gel de poliacrilamida azul nativo (BN-PAGE). Esta técnica bidimensional preserva las interacciones proteicas para análisis preciso.

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Damos las gracias a Michael Reth, Schagger Hermann, y Margarita Camacho-Carvajal de apoyo científico. Este trabajo fue financiado por FORSYS de la Bildung Bundesministerium fuer Forschung y de Alemania (BMBF), por el BIOS de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), y apoyado en parte por la Iniciativa de Excelencia de los Gobiernos de Alemania Federal y el Estado (GSC-4, Spemann Escuela de Posgrado ).

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<li>Swamy, M., Minguet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+native+antibody-based+mobility-shift+technique+%28NAMOS-assay%29+to+determine+the+stoichiometry+of+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A native antibody-based mobility-shift technique (NAMOS-assay) to determine the stoichiometry of multiprotein complexes.</a> J Immunol Methods. 324 (1-2), 74-83 (2007).</li>
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<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+applications+of+blue-native+and+clear-native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis.</a> Proteomics. 8, 3974-3990 (2008).</li>
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En este estudio, se describe el análisis de los países socios mediterráneos por BN-PAGE. Un enfoque en 2D se utiliza para separar los PSM primera virtud de las condiciones, y luego más que dividir en sus componentes individuales de una segunda dimensión SDS-PAGE. Las muestras se preparan a partir de lisados ​​celulares. Para la solubilización de muchos países socios mediterráneos, un detergente apropiado que se necesita, que conserva la estructura de los complejos de proteínas. Aquí, nosotros usamos un 0,1% Triton X-100. Sin embargo, el detergente óptimo y su concentración adecuada tiene que ser determinada empíricamente para cada MPC. En el caso de Triton X-100, por ejemplo, se ha informado de que las bajas concentraciones de detergente permite la identificación de una forma dimérica de la F 1 F 0-ATPasa complejos (Arnold, Pfeiffer et al. 1998). Mayor Triton X-100 concentraciones, sin embargo, a la disociación del dímero y el correspondiente aumento de las monoméricas F 1 F 0-ATPasa complejo. Esto está en consonancia con uno de nuestros estudios anteriores, se nos muestran que el polivalente de células T complejo receptor (TCR) se conserva cuando se extrae con bajas concentraciones de Brij 96, mientras que el uso de una mayor concentración o de otro detergente llamado digitonina resultados en la extracción de monómero TCR (Schamel, Arechaga y cols. 2005). Detergentes de uso común que pueden ser probados incluyen digitonina (0,5 a 1%), Triton X-100 (0,1 a 0,5%), Brij 96 (de 0,1 a 0,5%), o dodecylmaltoside (0,1 a 0,5%). Estos reactivos son los detergentes no iónicos, que tienden a ser mejor para la estabilidad de MPC. Tenga en cuenta que el contacto con SDS y otros detergentes fuertes se debe evitar (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). Diálisis de los lisados ​​se requiere para lograr la separación MPC en un BN-gel (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al 2004).; (Heiss, Junkes et al 2005).. Parece que el ajuste de la concentración de sal o la eliminación de las impurezas de bajo peso molecular es crucial para alta resolución. Es de destacar que también las preparaciones de membrana y los PSM, que han sido inmunopurificados y posteriormente eluido de los anticuerpos, son adecuados para BN-PAGE (Swamy, Siegers et al. 2006). En ambos casos, las muestras no tienen que ser dializados para la separación de BN-PAGE, si la lisis de membrana o de elución se lleva a cabo en tampón BN-lisis. Para la separación de proteínas por BN-PAGE, el colorante azul de Coomassie es necesario, que se une inespecíficamente a las proteínas y los cubre con las cargas negativas. De esta manera, azul de Coomassie permite la movilidad electroforética de las proteínas hacia el cátodo a un pH neutro (Schagger y von Jagow 1991); (Schagger, Cramer et al, 1994).. Además, azul de Coomassie impide la agregación de proteínas en el gel de apilamiento durante la electroforesis. BN-PAGE, Coomassie G250 tiene que ser usado en lugar de azul de Coomassie R250 o coloidal azul Coomassie. Antes de ejecutar un BN-gel, es necesario garantizar que el porcentaje del gel se adapta al tamaño esperado de la MPC de interés. Prefabricados BN-geles con gradientes de diferentes tampones adecuados y están disponibles comercialmente a partir de Invitrogen (NativePAGE Novex Bis-Tris Gel System). Sin embargo, BN-geles también pueden prepararse usando un mezclador de gradiente, junto con una bomba persistaltic. Para garantizar un gradiente intacta, el líquido debe fluir constantemente durante el vaciado y las burbujas se debe evitar. Recomendamos la carga de las diluciones de muestras diferentes en el gel, porque la sobrecarga puede dar lugar a la precipitación de proteínas durante el proceso de electroforesis. Además, el BN-geles se debe ejecutar a 4 ° C para evitar la degradación de proteínas y para mantener el PSM intacto. Después de BN-PAGE, la visualización de los PSM se puede lograr mediante la tinción de azul brillante de Coomassie, tinción de plata o inmunotransferencia. Las bandas de proteínas visualizados por tinción con Coomassie o plata son adecuados para su posterior análisis por espectrometría de masas (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). En el caso de inmunotransferencia, las condiciones de transferencia óptima de los países socios mediterráneos de interés tiene que ser determinada empíricamente. Tenga en cuenta que Coomassie azul también es transferido durante el secante de un BN-gel. Por lo tanto, el gel se incoloro después de la transferencia con éxito, mientras que la membrana va a ejercer un color azul. Además, es importante mencionar que no todos los anticuerpos primarios, que trabaja en la detección después de SDS-PAGE, es aplicable a inmunotransferencia en BN-PAGE. Puede ocurrir que los anticuerpos no reconocen la MPC de interés debido a su epítopo se oculta en la conformación nativa de las proteínas. Para superar este problema, es posible para desnaturalizar las proteínas dentro de la BN-gel antes de la transferencia al hervir el gel en tampón 1x breve muestra de SDS. En nuestro ejemplo, que no tema el BN-gel directamente a la detección de bandas de proteínas. En su lugar, divide a la BN-PAGE de lisado separados por un segundo dimensien SDS-PAGE. En la segunda dimensión SDS-gel, proteínas monoméricas migrar dentro de una diagonal hiperbólico, debido a que el gel de gradiente en el primero y el gel lineal en la segunda dimensión (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). Esto permite la fácil identificación de los países socios mediterráneos, ya que se localizan por debajo de esta hiperbólica diagonal. Subcomponentes de una distinta MPC se separan en una línea vertical en la segunda dimensión SDS-PAGE. Componentes que son constituyentes de los PSM dinstinct varios se pueden identificar en una línea horizontal en función del tamaño de la MPC. Sin embargo, hay que tener en cuenta que varios puntos de proteínas que aparecen en una línea vertical también podría formar parte de los complejos que migran por separado en la misma posición en BN-PAGE. La prueba final de que se encuentran en la misma MPC se puede obtener mediante un ensayo en gel a base de anticuerpos turno. En este ensayo, lisado celular se incuba con un anticuerpo contra una proteína representada por uno de los puntos identificados antes de la BN-PAGE. Esto se traduce en un cambio de todos los países socios mediterráneos que contienen esta proteína hacia una mayor masa molecular en la primera dimensión. Otras proteínas que son también una parte de estos países socios mediterráneos se someterán a este cambio de complejos específicos y por lo tanto fácil de identificar en la segunda dimensión SDS-gel. No sólo la composición de los países socios mediterráneos pueden ser analizados por BN-PAGE, sino también la determinación de su estequiometría es posible (y Schamel Reth 2000); (Schamel 2001), (Swamy, Minguet y otros, 2007.). Para ello, un ensayo de NAMOS (nativo basado en anticuerpos movilidad cambio de ensayo) se puede realizar. Al igual que en el ensayo de gel a base de anticuerpos cambio, los lisados ​​celulares se incuban con anticuerpos monoclonales subunidad anticuerpos específicos. Esto conduce a la inducción de immunoshifts electroforética en los geles BN-, que permiten la inferencia de la medida del cambio en la estequiometría de los países socios mediterráneos En conlusion, BN-PAGE es adecuado para la identificación de los países socios mediterráneos y la determinación de su tamaño, composición, así como la abundancia relativa. Realizado como un ensayo NAMOS, sino que también ofrece la posibilidad de determinar la estequiometría de una cierta MPC. Teniendo en cuenta su aplicabilidad general, esta técnica es una herramienta muy útil para la caracterización de los países socios mediterráneos (Dekker, Müller y otros, 1996.) (Wittig y Schagger 2008); (Wagner, Rehling y otros, 2009.) (Wittig y Schagger 2009) .

azul nativos electroforesis en gel de poliacrilamida (bn-page) para el análisis de los complejos multiproteinas de lisados ​​celulares

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Complejos multiproteicos (PSM) juegan un papel crucial en la señalización celular, ya que la mayoría de las proteínas se pueden encontrar en complejos funcionales o de reglamentación con otras proteínas (Sali, Glaeser et al. 2003). Así, el estudio de las redes de interacción proteína-proteína requiere de la caracterización detallada de los países socios mediterráneos para obtener una comprensión integradora de la función de la proteína y la regulación. Para la identificación y el análisis, los países socios mediterráneos deben ser separados en condiciones nativas. En este video, se describe el análisis de los países socios mediterráneos por el azul de electroforesis en gel de poliacrilamida nativo (BN-PAGE). BN-PAGE es una técnica que permite la separación de los PSM en una conformación nativa con una resolución mayor que la ofrecida por filtración en gel o ultracentrifugación de densidad de sacarosa, y por tanto es útil para determinar el tamaño del MPC, la composición y abundancia relativa (Schagger y von Jagow 1991) ; (Schagger, Cramer et al, 1994).. Mediante este método, las proteínas se separan según su tamaño y forma hidrodinámica en una matriz de poliacrilamida. En este caso, se demuestra el análisis de los PSM del total de lisados ​​celulares, señalando que la diálisis lisado es el paso crucial para hacer BN-PAGE aplicable a las muestras biológicas. Usando una combinación de primera dimensión BN-y segunda dimensión SDS-PAGE, se muestra que los países socios mediterráneos separados por BN-PAGE se pueden subdividir en sus componentes individuales por SDS-PAGE. La visualización de los componentes MPC después de la separación de gel se realiza por immunoblotting estándar. A modo de ejemplo para el análisis de MPC por BN-PAGE, se optó por el 19S bien caracterizados eucariotas, 20S, 26S y los proteasomas.

En este video, se describe la caracterización de los complejos multiproteicos (PSM) por el azul electroforesis nativa en gel de poliacrilamida (BN-PAGE). En una primera dimensión, se dializan lisados ​​celulares están separados por BN-PAGE para identificar PSM individual. En una segunda dimensión SDS-PAGE, PSM de interés se subdividen para analizar sus componentes por inmunotransferencia.

Azul nativos electroforesis en gel de poliacrilamida (BN-PAGE) para el análisis de los complejos Multiproteinas de lisados ​​celulares

Los complejos multiproteicos (CMP) desempeñan un papel crucial en la señalización celular, ya que la mayoría de las proteínas se encuentran en complejos funcionales o reguladores con otras...

El objetivo general del siguiente experimento es caracterizar un complejo MultiPro a partir de lisados celulares utilizando electroforesis en gel de poliacrilamida nativa azul, que, a diferencia de la electroforesis SDS-PAGE, permite la separación de proteínas en condiciones nativas y conserva las interacciones entre proteínas. Esto se logra dializando el lisado celular para eliminar las sales en exceso, haciendo que la muestra sea apta para la separación mediante electroforesis nativa azul en una segunda etapa. El lisado se aplica a la electroforesis nativa azul en primera dimensión, que separa los complejos proteicos en condiciones nativas según su tamaño y forma.A continuación, una segunda dimensión. Se realiza una electroforesis SDS-PAGE desnaturalizante para subdividir los complejos en sus componentes individuales. Las proteínas pueden visualizarse mediante tinción con plata o con kumasi, o mediante inmunotransferencia (western blotting).Aquí las proteínas separadas se detectaron mediante tinción con plata en la siguiente demostración, sin embargo, se utilizará el análisis por inmunotransferencia. Hola, soy Brita Bloom del laboratorio de Wolfgang Sharmel en el Departamento de Inmunología Molecular del Instituto Max Plank de Inmunobiología en Friburgo, Alemania. Hola, soy Dina Fiala.También soy del Laboratorio Sham. Hoy les mostraremos un procedimiento para el análisis de complejos MultiPro a partir de lisados celulares. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la composición de receptores de membrana con múltiples subunidades.Sin embargo, en este video utilizamos el proteasoma tic como ejemplo. Así que comencemos. Antes de iniciar este procedimiento, prepare todos los tampones según se describe en el protocolo escrito y manténgalos a cuatro grados Celsius.Recolecte 10 millones de células HEC 2 9 3 y péllasul por centrifugación a 350 veces G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Luego, lave los pellets celulares con un mililitro de PBS frío con hielo y use la centrifugación para pelotar las células lavadas. Repita este lavado dos veces, luego resuspenda el pellet celular lavado en 250 microlitros de hielo.Añada frío azul, tampón de lisis nativa y incube la suspensión en hielo durante 15 minutos. Tras la incubación, centrifugue las células vivas a 13.000 × g durante 15 minutos a cuatro grados Celsius para eliminar el material insoluble. Mientras tanto, derrita un orificio en la tapa de un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros utilizando el extremo de mayor diámetro de una pipeta de pasta calentada.Luego, coloque el tubo en hielo para enfriarlo hasta cuatro grados Celsius. Una vez finalizada la centrifugación, transfiera el lisado al tubo para la eliminación de sales mediante diálisis. Coloque una membrana de diálisis con un punto de corte de 10 kilodalton encima del tubo abierto.Cierre la tapa y corte cualquier exceso de membrana de diálisis que sobresalga. Luego, selle cuidadosamente el lateral de la tapa con parafina; una vez sellada, invierta el tubo y colóquelo boca abajo en un tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugue la muestra a la velocidad más baja posible durante 10 segundos.En una centrífuga de cultivo celular, prepare un vaso de precipitados de 100 mililitros con tampón frío de diálisis azul nativo y un agitador magnético utilizando al menos 10 mililitros de tampón de diálisis azul nativo por cada 100 microlitros de muestra. Luego, retire el tubo invertido del tubo cónico usando pinzas. Para evitar que el tubo quede derecho.Sujete el tubo con cinta adhesiva boca abajo dentro del vaso de precipitados y elimine cualquier burbuja de aire del orificio situado debajo de la tapa. Utilizando una pipeta Pasteur doblada, encienda el agitador magnético y deje la muestra durante seis horas o durante la noche en la cámara fría para realizar la diálisis. Revise la muestra ocasionalmente para asegurarse de que la agitación no esté generando burbujas de aire en la membrana de diálisis.Tras la incubación, transfiera el lisado de células dializadas a un nuevo tubo microcentrífugo enfriado y déjelo en hielo hasta la carga en el gradiente de gel. La preparación del gel se realiza a temperatura ambiente con un mezclador de gradientes. Coloque el mezclador de gradientes sobre una placa agitadora y conéctelo a un trozo de tubo flexible.Cierre el canal del mezclador de gradiente utilizando la válvula y cierre el tubo con una abrazadera. Coloque un agitador magnético en el cilindro conectado al tubo. A continuación, pase el tubo flexible a través de una bomba peristáltica y conecte una aguja de jeringa a su extremo.Luego coloque la aguja entre las dos placas de vidrio en la parte superior del aparato para geles. Prepare soluciones de gel separador al 4% y al 15% de modo que los volúmenes combinados sean iguales al volumen del gel separador. Añada inmediatamente un PS y TM.Use y vierta las soluciones de gel en los cilindros correspondientes del mezclador de gradientes. Luego encienda el aparato y abra la válvula. Presione sobre el cilindro izquierdo para expulsar la burbuja de aire dentro del canal que conecta los dos depósitos de gel.Encienda la bomba a cinco mililitros por minuto. Retire la pinza y permita que el gel fluya lentamente entre las placas de vidrio. Eleve lentamente la aguja cuando el gel se detenga, asegurándose de que la aguja esté siempre por encima del líquido.Deje que todo el líquido entre en el aparato de gel. Luego, cubra suavemente el líquido con isopropanol y enjuague el aparato con agua destilada. Deje que el gel polimerice durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente.A continuación, prepare un gel de enfoque al 3,2 %, agregando PS y TM justo antes de usarlo. Vierta el gel de enfoque sobre el gel de separación e introduzca el peine entre las placas de vidrio, evitando burbujas. Una vez que el gel de enfoque haya polimerizado, enfríe inmediatamente el gel a cuatro grados Celsius antes de cargar la muestra.Retire el peine extrayéndolo lentamente en un ángulo respecto al plano del gel. Esto permite que el aire entre rápidamente en los bolsillos, lo cual mejora la calidad de los pocillos para separar el lisado celular dializado mediante electroforesis nativa azul. Cargue 20 microlitros del marcador de ferritina y 40 microlitros del lisado dializado en los pocillos secos. A cuatro grados Celsius, los carriles vacíos se llenan con volúmenes iguales de tampón de diálisis. Luego, sobrepóngase a las muestras en cada pocillo con tampón catódico frío.Llene la cámara interna con tampón catódico frío y la cámara externa con tampón anódico frío. Trabaje a cuatro grados Celsius y aplique 100 voltios hasta que las muestras hayan entrado en el gel de separación. Luego aumente el voltaje a 180 voltios y corra el gel hasta que el frente de colorante alcance el final del gel.La corrida dura entre tres y cuatro horas. Para la electroforesis SDS-PAGE en segunda dimensión, prepare un gel estándar de SDS al 10 % con una sola banda amplia. Una banda para el marcador de peso molecular y otra para una alícuota del control de lisado dializado que se ha mezclado con tampón muestral SDS y hervido durante cinco minutos a 95 grados Celsius. Retire el gel de electroforesis azul nativo, junto con las placas, del aparato de electroforesis y levante suavemente una de las placas.Retire el gel de apilamiento y corte la banda del gel Blue Native PAGE que contiene las proteínas de interés. Coloque el trozo de gel Blue Native PAGE en tampón de muestra SDS e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente en un agitador. Después de la incubación, hierva brevemente el trozo de gel en un microondas e incube durante otros 15 minutos.En el tampón de muestra de SDS sobre un agitador, retire el peine del gel de SDS y llene con algo de tampón de SDS en el pocillo; cargue el trozo de gel de electroforesis nativa azul en el pocillo grande del gel de SDS. Evite las burbujas de aire. Puede ser útil usar una pinza para ayudarse, ya que el trozo de gel debe colocarse exactamente sobre el gel de apilamiento.Cubra el corte con tampón de muestra SDS, luego cargue el marcador y el control del lisado. Realice la electroforesis y la transferencia de proteínas según los protocolos estándar. Para interpretar los resultados, es importante saber que la posición de una proteína en la segunda dimensión de la electroforesis azul nativa SDS-PAGE proporciona evidencia sobre si la proteína forma parte de un complejo MultiPro o no.Las proteínas monoméricas migrarán en una diagonal hiperbólica debido al gradiente del gel en la primera dimensión y como un gel lineal en la segunda dimensión; las subunidades de los complejos MultiPro se encontrarán por debajo de la diagonal formando una línea vertical. Si una proteína determinada forma parte de complejos distintos, se detectarán varios puntos en una línea horizontal. En resumen, el enfoque bidimensional de electroforesis nativa azul y electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS permite determinar la composición, el tamaño y la abundancia relativa de los complejos MultiPro.En esta demostración, se detectaron varias proteasas o subunidades mediante inmunotransferencia. Las subunidades beta dos y MCP 21 pudieron detectarse como puntos individuales dispuestos verticalmente, lo que indica que forman parte de los mismos complejos. PA 28 se encuentra en una misma línea vertical con beta dos y CP 21, y por lo tanto forma parte del mismo complejo.Al observar las líneas horizontales, se puede ver que beta dos y MCP 21 forman parte de tres complejos distintos. PA 28 solo se encuentra en uno de esos complejos. Por lo tanto, estos complejos MultiPro podrían identificarse como el proteasoma 20 S y el proteasoma 20 s.Junto con P 28 y el proteasoma 20 S por separado, acabamos de mostrarle cómo separar y caracterizar complejos MultiPro nativos a partir de un lisado celular utilizando electroforesis en gel nativo azul. Al realizar este procedimiento, es importante recordar dializar cuidadosamente la muestra. Para evitar el contacto con SDS y trabajar siempre a cuatro grados, recomendamos comparar diferentes detergentes para la lisis celular con el fin de lograr tanto la integridad de complejos de motores como la mejor solubilización posible.Así que eso es todo. Gracias por vernos y buena suerte con sus experimentos. Me retiro.

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Azul nativos electroforesis en gel de poliacrilamida (BN-PAGE) para el análisis de los complejos Multiproteinas de lisados ​​celulares (Video) | JoVE Journal

Azul nativos electroforesis en gel de poliacrilamida (BN-PAGE) para el análisis de los complejos Multiproteinas de lisados ​​celulares

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