Los ratones con Transnuclear predefinidos Especificidades receptor de células T contra la Toxoplasma gondii Obtenidos a través de la SCNT

Los ratones transgénicos para receptores de células T específicos de antígeno han sido indispensables en el estudio del desarrollo y la función de las células T para generar modelos de ratón con especificidades de receptores de células T predefinidas mediante la transferencia nuclear de células somáticas o TCNC. Un ratón se infecta con un patógeno de interés. Las células T se aíslan del ratón y luego se purifican mediante clasificación fluorescente activada de células.

Las células T purificadas se utilizan entonces para la transferencia nuclear de células somáticas. Después de que los embriones alcancen la etapa de blastocisto, se aíslan células madre embrionarias. Estas células se inyectan luego en blastocistos, los cuales se transfieren a continuación a ratones pseudoembarazados.

Las crías resultantes expresan un aumento pronunciado en la población de linfocitos T de interés, lo cual puede validarse mediante análisis de PAX. Hola, mi nombre es Okta AK y soy posdoctorado aquí en el Instituto White de Investigación Biomédica. Hoy les mostraré cómo realizar inyecciones somáticas de transferencia de blastocistos con ayuda de CLE, así como transferencia embrionaria.

La principal ventaja de la transferencia somática es que se pueden generar modelos de ratón que expresan su receptor de células T a partir del locus endógeno, y por lo tanto bajo el control del promotor endógeno, y que los modelos de ratón se pueden generar muy rápidamente. La transferencia somática en estado líquido puede utilizarse como una herramienta para generar modelos de ratón con especificidades predeterminadas de receptores de células T o receptores de células B. Esto es de especial interés para personas que trabajan en campos como la autoinmunidad, las enfermedades infecciosas y el cáncer.

Para aislar linfocitos T específicos para un patógeno como Toxoplasma gondii, se infecta al ratón donador mediante inyección intraperitoneal y se obtiene el bazo del ratón sacrificado en el pico de la respuesta inmunitaria. Las células donadoras se homogenizan, aíslan e incubarán con anticuerpos marcados con fluorescencia y el tetrámero apropiado. Finalmente, se realiza la clasificación por citometría de flujo para obtener linfocitos T específicos para el patógeno. La noche anterior al procedimiento de enucleación de ovocitos.

Prepare agujas de inyección de piso de cuatro, cinco y siete micrómetros utilizando una jeringa para cargarlas en sentido retrógrado con mercurio. Al día siguiente, inicie el protocolo de transferencia nuclear de células somáticas recolectando ovocitos y luego, mediante una pipeta de succión bucal, transfiéralos a gotas de medio K-S-O-M-A-A en una placa de Petri. En la tapa de la placa de Petri.

Prepare aate para realizar la transferencia nuclear de células somáticas o SCNT colocando aproximadamente 10 gotas de PVP. Aproximadamente 10 gotas de HCZB que contienen cinco microgramos por mililitro de citob (cyto B) y alrededor de 10 gotas de HCCB que contienen 2,5 microgramos por mililitro de citob (cyto B). Esta placa se denominará placa S-C-N-T-A. Coloque la placa S-C-N-T-A sobre la platina de un microscopio compuesto invertido.

A continuación, coloque una aguja de enucleación de siete micrómetros en el micromanipulador y lávela retirando y descartando la solución de PVP de cinco a 10 veces. Luego transfiera de 10 a 30 ovocitos arrestados en metafase II desde la placa de Petri a una de las gotas de HCCB con cinco microgramos por mililitro de citocalasina B en la placa S-C-N-T-A, e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente. Durante la incubación, alinee los ovocitos horizontalmente.

Después de que hayan transcurrido cinco minutos, use la aguja de enucleación para colocar un ovocito frente a la aguja de sujeción. Mediante un microinyector, aplique vacío para fijar el ovocito a la aguja de micropipeta de sujeción.

A continuación, utilizando la aguja de enucleación, gire el ovocito hasta que el complejo del huso cromosómico, que aparece hipertransparente en comparación con el citoplasma opaco, se sitúe en la posición de las tres en punto. Inicie un pulso de pizo presionando el pedal para penetrar la zona pelúcida. Un pulso de pizo es un pulso mecánico que viaja longitudinalmente y hace vibrar la punta de la aguja de enucleación. Las vibraciones de la punta facilitan la perforación de la zona pelúcida.

Una vez que se atraviese la zona pelúcida, coloque la abertura de la aguja de nucleación adyacente al huso de metafase II y aplique el vacío. El complejo de cromosomas y huso se moverá lentamente hacia el interior de la aguja. Una vez retirada la aguja, la membrana debe sellarse por sí sola.

Finalmente, utilizando una pipeta bucal, transfiera los citoplasmas enucleados de regreso a las gotas de K-S-O-M-A-A. Luego, utilizando la misma pipeta, lávelos transfiriéndolos de gota a gota de KSOM AA. Para realizar la transferencia nuclear, sustituya la aguja de enucleación de siete micrómetros en el micromanipulador por una aguja de transferencia nuclear de cuatro a cinco micrómetros. Lave la aguja con PVP como antes.

Coloque las células T CD8 positivas aisladas previamente en una gota de PVP sobre la placa S-C-N-D-A. Mezcle bien e incube durante al menos 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, transfiera de 10 a 30 células ANUCLEADAS a una gota de HCZB con 2,5 microgramos por mililitro.

Citob en la placa S ct. Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. Durante la incubación, utilice la aguja de transferencia nuclear para alinear horizontalmente los citoes utilizando la aguja de inyección.

Recoger una célula donadora CD8 positiva del medio PVP y aspirarla entrando y saliendo hasta que la membrana externa se haya roto. Si es necesario, aplicar un pulso piezoeléctrico; deberían observarse fragmentos de la membrana y del citosol. Aspirar el núcleo dentro de la aguja.

Luego, continúe recogiendo núcleos hasta que haya entre 10 y 30. A continuación, muévase a la gota que contiene los citoplasmas anucleados alineados. Aplique vacío para fijar un ovocito a la aguja de sujeción.

Luego coloque la aguja de transferencia nuclear NU adyacente a la zop lucita con los núcleos orientados lejos de la abertura. Aplique un pulso de pizo hasta que la aguja atraviese la zop lucita. Empuje el micromanipulador para mover cuidadosamente un núcleo hasta la punta de la aguja.

Introduzca la aguja en el ovocito hasta que la punta de la aguja esté a dos tercios de camino dentro. Aplique una pequeña presión negativa para que un poco de la membrana del ovocito quede dentro de la aguja. El siguiente paso es muy crítico.

Dado que es la única ocasión en que el ovocito está realmente abierto, aplique un solo pulso ZO. Luego, aplique presión positiva para expulsar el núcleo fuera de la aguja.

Retire cuidadosamente la aguja de modo que la punta quede aproximadamente a un tercio de camino dentro del ovocito, luego aplique presión negativa y continúe retirando la aguja. Para sellar el ovocito. Repita este paso con cada ovocito.

Después de que todos los ovocitos hayan recibido un núcleo, transfiérelos al recipiente de Petri y lávelos pasándolos de una gota a otra de medio KS OM AA; incúbelos a 37 grados Celsius durante al menos 30 minutos. Tras la incubación, transfiera los embriones SCN T a gotas de medio de activación sin calcio que contenga cloruro de estroncio. El cloruro de estroncio activa el ovocito induciendo las oscilaciones de calcio que ocurrirían de manera similar durante la fecundación.

Incubar durante seis horas. Si se desea, AÑADIR TSA, que es un inhibidor inespecífico de las histonas diacetilasas, al medio de activación. Para mejorar la eficiencia tras la activación, examinar los embriones bajo el microscopio invertido para determinar la cantidad de pseudo pronúcleos o embriones SCNT positivos para PPN. Los PPN pueden identificarse según su apariencia.

Parecen huevos. Lave y cultive al estilo sol sobre. Los embriones y las gotas de K-S-O-M-A-A durante tres días y medio a 37 grados Celsius hasta que alcancen la etapa de blastocisto.

Al principio, debe centrarse en realizar correctamente los procedimientos que acaba de mostrar para la nucleación y la transferencia nuclear NU. Una vez dominadas estas técnicas, los siguientes procedimientos son más fáciles de manejar. Las células madre embrionarias o células ES utilizadas aquí se obtuvieron mediante técnicas estándar.

Estos deben prepararse el día de la inyección asistida por estallido, tres días y medio después del cópula. Prepare la tapa de un recipiente bacteriano estéril colocando gotas que contengan PVP y HCZP. Luego prepare una aguja de inyección de 15 micrómetros para el pulso piso como antes.

A continuación, coloque la aguja de inyección en el micromanipulador y lávela con transferencia de PVP. Realice de 10 a 30 pulsos de soplado en una gota de HCZB. Luego, coloque de cinco a 50 microlitros de la suspensión de ESL en otra gota de HCZB.

Debe haber suficientes células ES para que puedan recogerse fácilmente, pero sin estar apiñadas. A continuación, recoga entre 30 y 100 células ES con la aguja de inyección. Muévase a la gota con la ayuda de blastocisto.

Alinee el asistente de blastocisto horizontalmente y fije uno con la aguja de sujeción aplicando vacío. Utilice la aguja de inyección para girar el asistente de blastocisto hasta que la masa celular interna esté a las nueve en punto. Coloque la aguja de inyección a las tres en punto.

Asegúrese de que no haya células ES en la punta de la aguja y aplique un pulso piso hasta que la aguja de inyección atraviese la zop lucita y la trifecta, llegando al sello blastular. Libere de cinco a 15 células ES para que se adhieran a la masa celular interna. Continúe hasta que se hayan inyectado todos los blastoayudantes; finalice después de completar las inyecciones.

Lavado dos veces en K-S-O-M-A-A y proceder a la transferencia quirúrgica de embriones en hembras pseudogestantes. Coloque y anestesie a la hembra receptora pseudogestante en el área quirúrgica. Utilizando una afeitadora eléctrica, retire el vello del cuadrante inferior derecho. Desinfecte el área utilizando una solución a base de yodo y etanol al 70 % bajo un microscopio estereoscópico.

Use tijeras para abrir la piel, luego coloque las tijeras cerradas entre la piel y el peritoneo y ábralas para separar el peritoneo de la piel. Localice el ovario a través del peritoneo, que debe aparecer como un punto rojo. A continuación, use las tijeras para abrir el peritoneo en esa región.

Utilice pinzas para agarrar cuidadosamente el CTU o la grasa circundante y extraiga el útero usando una pipeta capilar conectada a una pipeta de boca. Tome un grupo de aproximadamente 10 blastocistos sosteniendo el oviducto y el útero con pinzas. Use una aguja para hacer un pequeño orificio en el útero.

Luego inserte el capilar con la ayuda de chorro en la luz del útero y libere los embriones. Empuje el útero de vuelta hacia la cavidad abdominal. Localice los bordes del peritoneo y cierre con algunas puntadas.

Cierre la piel del ratón con algunas grapas. Administre medicación analgésica por vía subcutánea. Luego, transfiera al ratón de vuelta a su jaula bajo una lámpara de calor.

Monitoree la respiración del ratón hasta que despierte. Tras la enucleación y la transferencia nuclear de células somáticas. Aproximadamente el 70 % de los embriones fueron positivos para pseudo pronúcleos.

Como se muestra en esta figura. El tratamiento con TSA durante seis o diez horas no tuvo efecto. Después de tres días y medio en cultivo, del 5 al 10 % de los embriones se desarrollaron en blastocistos.

Nuevamente, la adición de TSA no tuvo ningún efecto sobre la tasa de desarrollo del blastocisto auxiliar. Los blastocistos auxiliares de TCNS se utilizaron luego para obtener células madre embrionarias. TSA mejoró significativamente la tasa a la cual se derivaron las LCE a partir del blastocisto auxiliar.

Las células S-C-N-T-E-S se utilizan para generar ratones quiméricos. Se extrae sangre de estos ratones y se analiza la presencia de linfocitos T específicos mediante análisis de citometría de flujo, como se muestra aquí. Cuando la sangre se tiñe con anticuerpo anti CDA y tetrámero específico, puede identificarse una población doble positiva.

Lo que indica que la célula donante utilizada para la transferencia nuclear de células somáticas tenía la especificidad correcta. Acabo de mostrarle cómo realizar la transferencia de células somáticas LU, inyecciones asistidas por blastocisto y transferencia de embriones. El punto más importante a considerar es la pureza de sus células T o células B.

Una vez que haya aprendido cómo realizar la transferencia somática y sus embriones hayan alcanzado la etapa de blastocisto, puede optar por transferirlos directamente a hembras pseudoembarazadas o utilizarlos para obtener células madre embrionarias y generar ratones quiméricos.