Name: Los ratones con Transnuclear predefinidos Especificidades receptor de células T contra la Toxoplasma gondii Obtenidos a través de la SCNT (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Aprenda a generar ratones transgénicos con receptores de células T específicos mediante transferencia nuclear de células somáticas (SCNT). Este método permite estudiar respuestas inmunitarias contra patógenos como Toxoplasma gondii con control endógeno de la expresión.

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Los autores agradecen al H. Eisen, Gubbels M., K. van Grinsven, Guillén E., A. Drake, V. Mahajan, Gao P. y G. Yap para un debate fructífero y reactivos. Agradecemos a J. Dausman, Flannery R., y J. Jackson para obtener ayuda con la gestión de la colonia de ratones. Agradecemos a P. Wisniewski para FACSorting. EMF fue apoyada por el Programa de Ciencias de Fronteras Humanas. RJ fue apoyada por el Instituto Nacional de Salud subvenciones RO1-HD045022 y R37 CA084198. HLP fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional de Salud.

Este método se utilizó en la investigación publicada en <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/328/5975/243">Kirak et al., Science 328 (5975), desde 243 hasta 248 (2010)</a> . 1. El aislamiento de las células del donante Antes de T específicos o de células B se puede utilizar como donantes de células para generar modelos de transnuclear ratón, ratones necesidad de estar infectados con un patógeno de interés o inmunizados con un antígeno de interés. Puesto que hemos utilizado las células CD8 + específicas para Toxoplasma gondii, el siguiente protocolo se describe la generación y el aislamiento de estas células y tiene que adaptarse de acuerdo al interés personal. <ol><li> Quistes derivados de un homogeneizado de cerebro de ratón (40) se inyectan intraperitonealmente en BL / 6 x Balb / c F1 (B6CF1) ratones, lo que permite el aislamiento de H-2 b y H-2 d restringido células T CD8 +. </li><li> En el pico de la respuesta inmune, el ratón infectado es la eutanasia, el bazo aisladas y se coloca en un plato con 6 ml de células rojas de la sangre (glóbulos rojos) de tampón de lisis. </li><li> Utilizando los lados mate de dos diapositivas de cobertura, el bazo es cuidadosamente suelo y se incubaron en el buffer de lisis durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 14 ml de PBS, filtrar la suspensión de células a través de un colador de células (40 o 70 micras) en un tubo Falcon de 50 ml y centrifugar durante 5 minutos a 300 gramos. </li><li> Extraer el sobrenadante, resuspender el botón celular en 1 ml de PBS y la transferencia en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Centrifugar durante 5 minutos a 300g y eliminar el sobrenadante después. </li><li> Resuspender el botón celular en 50 l de PBS, añadir anticuerpos marcados con fluorescencia para identificar el tipo de células de interés (por ejemplo, CD3, B220, CD8 y CD4), y marcados con fluorescencia tetrámero MHC-I (MHC-II tetrámero de las células T CD4) que se carga con el péptido de interés para la suspensión de células y se incuba durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Añadir 1 ml de PBS, centrifugar durante 5 min a 300 g de pellets, resuspender en 3 ml de PBS, y el filtro de la suspensión celular a través de un colador de células (40 o 70 micras) en un tubo. </li><li> FACSorting realizar mediante el establecimiento de las puertas de la estricta (fig. 1B). </li></ol> 2. Transferencia nuclear de células somáticas Hay algunos protocolos para la transferencia nuclear de células somáticas. El que se describe aquí hace uso de ovocitos detenidos en metafase II y la inhibición de la segunda división meiótica con citocalasina B. Por lo tanto, las células del donante son necesarios que se encuentran en la fase G0/G1. <ol><li> Preparación de los ovocitos <ol><li> Los ratones hembra de BDF1 fondo se inyectan intraperitonealmente con 5IU PMS por ratón 17:00-19:00. </li><li> Alrededor de 47 horas más tarde, cada ratón se inyecta intraperitonealmente con 5IU HCG. </li><li> Prepare una placa de cultivo (KSOM-AA petróleo cae por debajo) de los ovocitos en el mismo día de la inyección de hCG y se colocan en una incubadora 37 ° C, 5% de CO 2. Además, preparan las agujas necesarias para la SCNT (7μm de enucleación y 4 o 5μm para la transferencia nuclear de los núcleos de linfocitos) cargándolos con mercurio. </li><li> La eutanasia a los ratones y aislar a los oviductos de 13h después de HCG (aproximadamente las 8 AM). Recoge los oviductos en 1-2 gotas de HCZB. </li><li> Uno por uno, los oviductos se mueven en un desplegable que contiene M2 w / hialuronidasa. Nick el oviducto cuidadosamente con una pinza y mover el ovocito-cumulus-compleja en la caída. Después de todo ovocitos cumulus-complejos se han aislado, el plato se incuba a 37 ° C. </li><li> Después de 2-5 minutos (el tiempo exacto depende de la hornada de hialuronidasa) recoger los ovocitos, lávate en HCZB y la placa que en KSOM-AA gotas. </li></ol></li><li> Enucleación de ovocitos <ol><li> Use la tapa de una caja de Petri para preparar el plato SCNT. Configurar el microscopio, y el micromanipulador. </li><li> Lave la aguja enucleación (7 m) en PVP antes de comenzar con la enucleación. </li><li> De enucleación, colocar un grupo de ovocitos (10-30) en una gota de HZCB con citocalasina B (5 mg / mL). Mientras se incuba (min. 5 minutos) hasta la línea de los ovocitos en posición horizontal. </li><li> Tome un ovocito y lo coloca en frente de la aguja de la celebración. Fijar el ovocito de la celebración de la aguja mediante la aplicación de un vacío. Con la aguja de la enucleación, a su vez el ovocito hasta que el cromosoma eje del complejo (CSC, a menudo llamado el "núcleo") se encuentra en la posición de las 3. </li><li> Utilizando piezo-pulso penetrar la zona pelúcida con cuidado, sin dañar el óvulo. Lugar la apertura de la aguja al lado del eje de la metafase II y aplicar vacío. El "núcleo" debe moverse lentamente hacia la aguja, y la membrana se debe sellar una vez que se elimina por completo. </li><li> La transferencia de los ovocitos enucleados de nuevo en las gotas KSOM-AA, y lavarlos varias veces. Repita el correomedidas de nucleación con un nuevo grupo de ovocitos. Continúe hasta que todos los huevos se enucleado o hasta unos 11. </li></ol></li><li> Transferencia nuclear <ol><li> Para la transferencia nuclear, el intercambio de la aguja de la enucleación (7 m) con una aguja de transferencia nuclear (4 o 5 m) y se lava con PVP. </li><li> Lugar a las células de interés (por ejemplo, las células CD8 + T) en una gota de PVP, mezclar bien e incubar durante un mínimo de 10 min. </li><li> Lugar a un grupo de ovocitos enucleados (10-30) en una gota de HCZB con citocalasina B (2,5 mg / mL). Mientras se incuba (min. 5 min) línea de ovocitos horizontal mediante el uso de la aguja de transferencia nuclear. </li><li> Recoger una célula donante de la suspensión de PVP-célula y aspirado que dentro y fuera, hasta que la membrana externa se ha roto (fragmentos de la membrana y el citosol debe ser visible). Si es necesario un piezo-pulso se puede aplicar. Una vez que el núcleo ha sido aislado, moverlo un poco en la aguja, y continuar a recoger a los núcleos hasta que tenga 10 a 30. </li><li> Mover a la caída que contienen los ovocitos enucleados alineados. Fijar un ovocito para la celebración de la aguja mediante la aplicación de vacío. Coloque la aguja de transferencia nuclear (el núcleo debe estar lejos de la apertura), adyacente a la zona pelúcida y aplicar piezo-pulso hasta que la aguja ha atravesado la zona pelúcida. Cuidadosamente el movimiento de un núcleo a la punta de la aguja, introduzca la aguja en el óvulo hasta que la punta de la aguja es de 2 / 3 en el interior. Aplique una pequeña presión negativa, de modo que un poco de la membrana del ovocito está en la aguja. </li><li> El siguiente paso es muy importante, ya que es la única vez que el ovocito es en realidad "abierta". Aplicar un pulso de piezo, empuje el núcleo de la aguja mediante la aplicación de presión positiva, cuidadosamente retire la aguja de modo que la punta es aproximadamente 1 / 3 en el ovocito, y luego aplicar presión negativa y siguen a retirar la aguja sellar el ovocito. Repita este paso con cada ovocito. </li><li> Después de todos los ovocitos de un grupo han recibido un núcleo, se lavan y se cultivan en KSOM-AA medios de comunicación. Repita este procedimiento con todos los ovocitos. </li><li> Después de que el último grupo ha sido en las culturas KSOM-AA por un mínimo de 30 minutos, la SCNT-embriones son transferidos en forma de gotas de los medios de activación de Ca-libre que contiene SrCl2. </li><li> Después de 6 horas de la activación, la cantidad de pseudo-pronúcleos (PPN)-positivos SCNT-embriones se determina. Los embriones se lavan y se cultivaron en KSOM-AA gotas de otros 3,5 días hasta que han llegado a la etapa de blastocisto. </li><li> Drogas o productos químicos de la elección (por ejemplo, tricostatina A) se puede agregar a la activación y medios de cultivo. </li></ol></li></ol> 3.Derivation de células madre embrionarias Los blastocistos SCNT, se puede utilizar a cualquiera de ellos en la transferencia de pseudo-embarazadas las mujeres (también conocida como clonación directa o un paso) o para obtener células madre embrionarias (también conocida como clonación indirecta o de dos). Ya que es mucho más eficiente para generar células madre embrionarias, se elige el procedimiento de dos pasos. En caso de que el científico está interesado en la clonación directa, los blastocitos se pueden transferir directamente a las mujeres embarazadas pseudo-como se describe en la sección 5. Existen muchos protocolos que describen la obtención de células madre embrionarias. El que se describe aquí es una técnica estándar, que utiliza células alimentadoras, y suero fetal bovino. <ol><li> El segundo día después de la transferencia nuclear, preparar una placa de 96-U-y para la derivación de células ES. </li><li> Añadir 100 ml de gelatina en cada pocillo de una placa de 96 U, bueno, se incuba durante un mínimo de 10 minutos y retirarla después. </li><li> Descongelar las células de alimentación y resuspender en un volumen de medio de la EDS de acuerdo, por ejemplo células de alimentación equivale a un área de 25 cm 2 se resuspenden en 10 ml de medio EDS y 200 l de la suspensión celular, se añade en cada una de las de gelatina bien tratados. </li><li> Colocar la placa en una incubadora y la cultura a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Después de 3,5 días, los embriones debe estar en el estadio de blastocisto. </li><li> Preparar un plato de bacterias en placas estériles ES un medio de unas gotas de células y thyrode ácido. </li><li> Los blastocistos se transfieren primero de las gotas KSOM-AA en gotas que contienen medio normal de las células ES y lavado dos veces. </li><li> Con cuidado, la transferencia de un grupo de blastocistos (blastocistos 5-10) en una gota de ácido thyrode y mantenerse en ella hasta la zona pelúcida se haya disuelto. </li><li> Los blastocistos se transfieren a una caída con el medio ES, se lavaron dos veces, y luego se colocan en el alimentador recubiertos de 96 U y placa (un blastocisto en un pozo). </li><li> Los embriones son cultivados durante 5-7 días en una incubadora a 37 ° C CO, 5% 2 sin molestarlos. Esto permite que el embrión de unattach a la capa de alimentación, y para formar una consecuencia. </li><li> Prepare 24 y placas, por sistemas de siembra en medio de la EDS en cada pozo, por ejemplo, volver a suspender el equivalente de 50 cm 2 de alimentación en 12 ml de medio ESD, y añadir 500 l de la suspensión celular en cada pocillo. </li><li> Retire con cuidado el medio de la EDS de la placa de 96-U-bien con los embriones, lave cada pocillo dos veces con 250 l Hepes (o PBS), se añaden 50 l de tripsina y se incuba durante 5 min a 37 ° C. </li><li> Pipeta hacia arriba y abajo varias veces, hasta que fruto se ha derrumbado en una suspensión de una sola célula, el traslado en una placa de 24 pocillos y se incuba a 37 ° C CO, 5% 2. </li><li> Si la derivación de ESC fue un éxito, las colonias de ESC debe ser visible después de 7-10 días. </li></ol> 4.Blastocyst inyección La inyección de blastocistos es una técnica de rutina para generar cualquier tipo de modelo de ratón transgénico. Es importante mencionar que la inyección de blastocistos y el posterior traslado en pseudo-embarazadas las mujeres tiene que ser oportuna. <ol><li> Primer ratones hembra con el síndrome premenstrual y HCG como se describe en la sección 2.1. Después de la inyección de HCG poner los ratones hembra con ratones macho (una hembra y un ratón macho por jaula). </li><li> Al día siguiente, marque las mujeres para los enchufes. Esto se cuenta como 0.5dpc (días después del coito). </li><li> Embriones fecundados se aisló del oviducto como se describe en la sección 2.1, y se cultivan en KSOM-AA durante 3 días. </li><li> Prepare las células ES en el día de la inyección de blastocisto (3.5dpc). </li><li> Quitar medio de células madre embrionarias, lavar dos veces con Hepes (o PBS), agregar la tripsina y se incuba durante 5 min a 37 ° C. </li><li> Resuspender trypsinized células con medio de ES, la placa en un plato, y se incuba durante 45-60 min a 37 ° C, 5% de CO 2 para reducir la cantidad de células alimentadoras (células alimentadoras se adhieren más rápido que las células ES). </li><li> Transferir la suspensión celular a través de un colador de células (40 o 70 micras) en un tubo y centrifugar durante 5 min a 1000 rpm. </li><li> Extraer el sobrenadante, resuspender el sedimento celular en 500 l medio ES y almacenar en hielo hasta que se necesite. </li><li> Prepare la tapa de un recipiente estéril de bacterias en forma de gotas que contienen placas PVP y HCZB. </li><li> Prepare una aguja 15 micras por la carga de mercurio, colocándolo en posición y lavarlo con PVP. </li><li> Lugar a un grupo de blastocistos (10-30 blastocistos) en una caída con HCZB, y añadir 5-50 l suspensión de células ES (depende de la concentración) en una gota de HCZB. </li><li> Recoger células madre embrionarias (50-100 células) con la aguja de inyección. </li><li> Mover a la caída de los blastocitos. Alinear los blastocitos en posición horizontal, y fijar una con la aguja de la celebración mediante la aplicación de vacío. </li><li> Con la aguja de la inyección a su vez el blastocisto hasta que la masa celular interna (ICM) se encuentra en la posición de las 9. </li><li> Coloque la aguja de inyección a las 3 horas, asegúrese de que no hay células madre embrionarias en la punta de la aguja, y aplicar piezo-el pulso hasta que la aguja penetra a través de la zona pelúcida y la trophectoderm en el blastocele. </li><li> Lanzar una células madre embrionarias pocos (5-15 células), de modo que las células madre embrionarias se adhieren a la ICM. Continúe hasta que todos los blastocistos del grupo han sido inyectados con células madre embrionarias. </li><li> Después de un grupo de blastocistos es terminado, lavar dos veces en KSOM-AA y mantenerlos en una caída con KSOM-AA hasta que todos los blastocistos se inyectan. </li></ol> 5. Transferencia de Embriones La transferencia de embriones en mujeres embarazadas pseudo-representa un procedimiento quirúrgico, que debe llevarse a cabo con mucho cuidado y de acuerdo con las directrices del Instituto del investigador. <ol><li> Anestesiar a los ratones hembra receptora, afeitarse el cuadrante inferior derecho, y desinfectar. </li><li> Utilizando unas tijeras abiertas en la piel, y separar el peritoneo de la piel. </li><li> Localizar el ovario a través del peritoneo (punto rojo), y abrir el peritoneo, en las proximidades del ovario. </li><li> Con una pinza, coger con cuidado el oviducto y sacar el útero. </li><li> Recoger a un grupo de alrededor de 10 blastocistos con un capilar conectado a una pipeta de boca. </li><li> Fijar el útero con una pinza, abra un conjunto pequeño en él con una pequeña aguja e insertar el tubo capilar con los blastocistos en el lumen del útero. </li><li> Con cuidado, la liberación de los embriones en el útero, y quitar el capilar. </li><li> Empujar el útero en la cavidad abdominal. </li><li> Localizar los bordes del peritoneo y cerrar con unas cuantas puntadas. </li><li> Cerca de la piel del ratón con algunas grapas. </li><li> Para el dolor postoperatorio, administrar 5 mg por Carprofen mg de peso corporal. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2168/2168fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Nuclear de células somáticastransferencia de pre-definidas las células T en B6CF1 fondo. Número absoluto y relativo de los embriones generados a partir de las células CD8 + T y las células madre embrionarias derivadas de blastocistos SCNT. <img src="/files/ftp_upload/2168/2168fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Análisis de flujo de citometría de Representante de los ratones quiméricos inyectados con SCNT células madre embrionarias. Puerta y el número (porcentaje total de células T CD8 +) indica la presencia de determinadas células CD8 + T en ratones quiméricos.

<ol><li>Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V%28D%29J+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">V(D)J recombination.</a> Immunol. Rev. 200, 5-5 (2004).</li>
<li>Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R., R, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+TCR+expression+in+transgenic+mice+constructed+using+cDNA-based+alpha-+and+beta-chain+genes+under+the+control+of+heterologous+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements.</a> Immunol. Cell Biol. 76, 34-34 (1998).</li>
<li>Eggan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+vigor%2C+fetal+overgrowth%2C+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 6209-6209 (2001).</li>
<li>Kishigami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significant+improvement+of+mouse+cloning+technique+by+treatment+with+trichostatin+A+after+somatic+nuclear+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer.</a> Biochem Biophys Res Commun. 340, 183-183 (2006).</li>
<li>Wakayama, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+cloning+with+nucleus+donor+cells+of+different+age+and+type%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Mouse cloning with nucleus donor cells of different age and type.</a> Mol Reprod Dev. 58, 376-376 (2001).</li>
</ol>

Hemos demostrado aquí que la SCNT puede ser utilizado para generar ratones transnuclear de las células T con especificidad predefinida. Aunque no se muestra aquí, la técnica también podría ser útil para generar ratones transnuclear de las células B, con pre-definidos de especificidad. Una cosa importante a considerar es la cepa y el sexo del ratón, que está infectado o vacunado y se utiliza para aislar células T o B de interés. Dado que las células T y B tienen una muy baja eficiencia de reprogramación en general, se recomienda el uso de híbridos F1 haplotipo deseado. Debido a que la célula donante también determina el sexo, se recomienda el uso de T o células B de ratones machos. Esto significa que sólo los ratones quiméricos hombres que transmiten el TCR o BCR a través de la línea germinal, con ratones machos ser más fácil y más rápido para reproducirse. En conjunto, creemos que a través de la reprogramación epigenética SCNT representa una poderosa herramienta para generar un nuevo tipo de modelos de ratón, que será de gran ventaja para el campo inmunológico.

<table><tbody><tr><td>Buffer de lisis de glóbulos rojos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Filtro para células</td><td>BD Biosciences</td><td>REF 352340</td><td></td></tr><tr><td>Suero de yegua preñada (PMS)</td><td>Calbiochem</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>Gonadotropina coriónica humana (HCG)</td><td>Calbiochem</td><td>230734</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4272</td><td>Tipo IV-S</td></tr><tr><td>KSOM-AA</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>HCZB</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-173-D</td><td>Medio personalizado</td></tr><tr><td>Medio sin Ca para activación</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-174-D</td><td>Medio personalizado</td></tr><tr><td>SrCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255521</td><td>100 mM = 10x</td></tr><tr><td>AlbuMAX I</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>11020-021</td><td></td></tr><tr><td>PVP</td><td>MP Biomedicals</td><td>102787</td><td>Preparar una solución al 10 % en HCZB y añadir AlbuMAX I al 0,1 %</td></tr><tr><td>Citocalasina B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td>500&amp;#x03BC;g/ml = 100x</td></tr><tr><td>Tricostatina A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8552</td><td>5 mM = 1000x</td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de sujeción</td><td>Humagen</td><td>MPH-SM-30</td><td></td></tr><tr><td>Agujas de inyección y transferencia</td><td>Humagen</td><td>4-15, 7-15, 15-15</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de boca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Fine Science Tools</td><td>14088-10</td><td>o algo similar</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>o algo similar</td></tr><tr><td>Aplicador de clips para heridas</td><td>BD Biosciences</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>Clips para heridas</td><td>BD Biosciences</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>Hilo de sutura</td><td>Ethicon Inc.</td><td>K871H</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>SFB</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>15 %</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-602E</td><td>100x</td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>MP Biomedicals</td><td>101806</td><td>200 mM = 100x</td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>11140050</td><td>100x</td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercapto&amp;#8211;etanol</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>21985-023</td><td>5&amp;#x03BC;l en 500 ml</td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1106</td><td>1000x</td></tr><tr><td>Inhibidor de MEK</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9900L</td><td>Solo para obtención de células ES; añadir al medio ES (concentración final 50&amp;#x03BC;M)</td></tr></tbody></table>

los ratones con transnuclear predefinidos especificidades receptor de células t contra la toxoplasma gondii obtenidos a través de la scnt

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Linfocitos, como las células T, se someten genética V (D) J recombinación, para generar un receptor con una cierta especificidad 1. Ratones transgénicos para reorganizar el antígeno específico de los receptores de células T (TCR) ha sido una herramienta indispensable para estudiar el desarrollo de células T y la función. Sin embargo, los TCR son por lo general aislado de las células T después de la correspondiente a largo plazo la cultura a menudo después de la estimulación repetida de antígenos, que inevitablemente selecciona las células T con alta afinidad. Integración al azar del genoma de la TCR α-β y de la cadena y la expresión de la no endógena promotores pueden dar lugar a variaciones en el nivel de expresión y la cinética. Reprogramación epigenética mediante transferencia nuclear de células somáticas es una herramienta para generar células madre embrionarias y los ratones de cualquier célula de interés. En consecuencia, cuando SCNT se aplica a las células T de especificidad conocida, estos recursos genéticos V (D) J reordenamientos se transfieren a las células madre embrionarias-SCNT (CES) y los ratones derivadas de ellos, mientras que las marcas epigenéticas se restablecen. Hemos demostrado que las células T con pre-definido las especificidades contra Toxoplasma gondii se puede utilizar para generar modelos de ratones que expresan el TCR específicos de sus loci endógena, sin modificación genética introducida experimentalmente. La relativa facilidad y rapidez con que estos modelos transnuclear se puede obtener una promesa para la construcción de modelos de otras enfermedades.

Estamos aquí demostrar que la reprogramación epigenética mediante transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) puede ser utilizado como una herramienta para generar modelos de ratones con la pre-definido de receptores de células T (TCR) especificidades. Estos ratones transnuclear expresar la correspondiente TCR de su locus endógeno bajo el control del promotor endógeno.

Los ratones con Transnuclear predefinidos Especificidades receptor de células T contra la Toxoplasma gondii Obtenidos a través de la SCNT

Los linfocitos, como las células T, experimentan la recombinación genética V(D)J para generar un receptor con una especificidad determinada1. Los ratones transgénicos para un ...

Los ratones transgénicos para receptores de células T específicos de antígeno han sido indispensables en el estudio del desarrollo y la función de las células T para generar modelos de ratón con especificidades de receptores de células T predefinidas mediante la transferencia nuclear de células somáticas o SCNT. Un ratón se infecta con un patógeno de interés. Las células T se aíslan del ratón y luego se purifican mediante clasificación fluorescente activada de células.Las células T purificadas se utilizan entonces para la transferencia nuclear de células somáticas. Después de que los embriones alcancen la etapa de blastocisto, se aíslan células madre embrionarias. Estas células se inyectan luego en blastocistos, los cuales se transfieren a continuación a ratones pseudoembarazados.Las crías resultantes expresan un aumento pronunciado en la población de linfocitos T de interés, lo cual puede validarse mediante análisis de PAX. Hola, mi nombre es Okta AK y soy posdoctorado aquí en el Instituto White de Investigación Biomédica. Hoy les mostraré cómo realizar inyecciones somáticas de transferencia de blastocistos con ayuda de CLE, así como transferencia embrionaria.La principal ventaja de la transferencia somática es que se pueden generar modelos de ratón que expresan su receptor de células T a partir del locus endógeno, y por lo tanto bajo el control del promotor endógeno, y que los modelos de ratón se pueden generar muy rápidamente. La transferencia somática de líquidos puede utilizarse como una herramienta para generar modelos de ratón con especificidades predeterminadas de receptores de células T o receptores de células B. Esto es de especial interés para personas que trabajan en campos como la autoinmunidad, las enfermedades infecciosas y el cáncer.Para aislar linfocitos T específicos para un patógeno como Toxoplasma gondii, se infecta al ratón donador mediante inyección intraperitoneal y se obtiene el bazo en el pico de la respuesta inmunitaria. El bazo se aísla del ratón eutanasiado, se homogenizan las células donadoras y luego se incuban con anticuerpos marcados con fluorescencia y el tetrámero apropiado. Finalmente, se realiza la clasificación por citometría de flujo para obtener linfocitos T específicos para el patógeno. La noche anterior al procedimiento de enucleación de ovocitos.Prepare agujas de inyección de piso de cuatro, cinco y siete micrómetros utilizando una jeringa para cargarlas en sentido retrógrado con mercurio. Al día siguiente, inicie el protocolo de transferencia nuclear de células somáticas recolectando ovocitos y luego, mediante una pipeta de succión bucal, transfiéralos a gotas de medio K-S-O-M-A-A en una placa de Petri. En la tapa de la placa de Petri.Prepare la aate para realizar la transferencia nuclear de células somáticas o SCNT colocando aproximadamente 10 gotas de PVP. Aproximadamente 10 gotas de HCZB que contienen cinco microgramos por mililitro de citoblasina B y alrededor de 10 gotas de HCCB que contienen 2,5 microgramos por mililitro de citoblasina B. Esta placa se denominará placa S-C-N-T-A. Coloque la placa S-C-N-T-A sobre la platina de un microscopio compuesto invertido.A continuación, coloque una aguja de enucleación de siete micrómetros en el micromanipulador y lávela retirando y descartando la solución de PVP entre cinco y 10 veces. Luego, transfiera de 10 a 30 ovocitos arrestados en metafase II desde la placa de Petri a una de las gotas de HCCB con cinco microgramos por mililitro de citocalasina B en la placa S-C-N-T-A, e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente. Durante la incubación, alinee los ovocitos horizontalmente.Después de que hayan transcurrido cinco minutos, use la aguja de enucleación para colocar un ovocito frente a la aguja de sujeción. Mediante un microinyector, aplique vacío para fijar el ovocito a la aguja de micropipeta de sujeción.A continuación, utilizando la aguja de enucleación, gire el ovocito hasta que el complejo del huso cromosómico, que aparece hipertransparente en comparación con el citoplasma opaco, se sitúe en la posición de las tres en punto. Inicie un pulso de pizo presionando el pedal para penetrar la zona pelúcida. Un pulso de pizo es un pulso mecánico que viaja longitudinalmente y hace vibrar la punta de la aguja de enucleación. Las vibraciones de la punta facilitan la perforación de la zona pelúcida.Una vez que se atraviese la zona pelúcida, coloque la abertura de la aguja de nucleación adyacente al huso de metafase II y aplique el vacío. El complejo de cromosomas y huso se moverá lentamente hacia la aguja. Una vez retirada la aguja, la membrana debe sellarse por sí sola.Finalmente, utilizando una pipeta bucal, transfiera los citoplasmas enucleados nuevamente a las gotas de K-S-O-M-A-A. Luego, con la misma pipeta, lávelos transfiriéndolos de gota en gota de KSOM AA. Para realizar la transferencia nuclear, cambie la aguja de enucleación de siete micrómetros en el micromanipulador por una aguja de transferencia nuclear de cuatro a cinco micrómetros. Lave la aguja con PVP como antes.Coloque las células T CD8 positivas aisladas previamente en una gota de PVP sobre la placa S-C-N-D-A. Mezcle bien e incube durante al menos 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, transfiera de 10 a 30 células ANUCLEADAS a una gota de HCZB con 2,5 microgramos por mililitro.Cultive el citoplasma B en la placa S ct. A durante cinco minutos a temperatura ambiente. Durante la incubación, utilice la aguja de transferencia nuclear para alinear horizontalmente los citoplasmas utilizando la aguja de inyección.Recoger una célula donadora CD8 positiva del medio PVP y aspirarla entrando y saliendo hasta que la membrana externa se haya descompuesto. Si es necesario, aplicar un pulso piezoeléctrico; deberían observarse fragmentos de la membrana y del citosol. Aspirar el núcleo dentro de la aguja.Luego, continúe recogiendo núcleos hasta tener entre 10 y 30. A continuación, muévase a la gota que contiene los citoplasmas anucleados alineados. Aplique vacío para fijar un ovocito a la aguja de sujeción.Luego coloque la aguja de transferencia nuclear NU adyacente a la zop lucita con los núcleos orientados lejos de la abertura. Aplique un pulso de pizo hasta que la aguja atraviese la zop lucita. Presione el micromanipulador para mover cuidadosamente un núcleo hasta la punta de la aguja.Introduzca la aguja en el ovocito hasta que la punta de la aguja esté a dos tercios de camino hacia el interior. Aplique una pequeña presión negativa para que una pequeña parte de la membrana del ovocito quede dentro de la aguja. El siguiente paso es muy crítico.Dado que es la única ocasión en que el ovocito está realmente abierto, aplique un solo pulso ZO. A continuación, aplique presión positiva para expulsar el núcleo fuera de la aguja.Retire cuidadosamente la aguja de modo que la punta quede aproximadamente a un tercio de camino dentro del ovocito, luego aplique presión negativa y continúe retirando la aguja. Para sellar el ovocito. Repita este paso con cada ovocito.Después de que todos los ovocitos hayan recibido un núcleo, transfiérelos al recipiente de Petri y lávelos trasladándolos de gota a gota de medio KS OM AA, e incúbelos a 37 grados Celsius durante al menos 30 minutos. Tras la incubación, transfiera los embriones SCN T a gotas de medio de activación sin calcio que contenga cloruro de estroncio. El cloruro de estroncio activa el ovocito induciendo las oscilaciones de calcio que ocurrirían de manera similar durante la fertilización.Incubar durante seis horas. Si se desea, AÑADIR TSA, que es un inhibidor inespecífico de las histonas diacetilasas, al medio de activación. Para mejorar la eficiencia tras la activación, examinar los embriones bajo el microscopio invertido para determinar la cantidad de pseudo pronúcleos o embriones SCNT positivos para PPN. Los PPN pueden identificarse según su apariencia.Parecen huevos. Lave y cultive al estilo sol sobre. Los embriones y las gotas de K-S-O-M-A-A durante tres días y medio a 37 grados Celsius hasta que alcancen la etapa de blastocisto.Al principio, debe centrarse en realizar correctamente los procedimientos que acaba de mostrar para la nucleación y la transferencia nuclear NU. Una vez dominadas estas técnicas, los siguientes procedimientos son más fáciles de manejar. Las células madre embrionarias o células ES utilizadas aquí se obtuvieron mediante técnicas estándar.Estos deben prepararse el día de la inyección asistida por descarga, tres días y medio después del coito. Prepare la tapa de un plato bacteriano estéril colocando gotas que contengan PVP y HCZP. Luego prepare una aguja de inyección de 15 micrómetros para el pulso piso como antes.A continuación, coloque la aguja de inyección en el micromanipulador y lávela con transferencia de PVP. Realice de 10 a 30 impulsos de blast en una gota de HCZB. Luego, coloque de cinco a 50 microlitros de la suspensión de ESL en otra gota de HCZB.Debe haber suficientes células ES de modo que puedan recogerse fácilmente, pero sin estar apiñadas. A continuación, recoga entre 30 y 100 células ES con la aguja de inyección. Muévase a la gota con la ayuda de blastocisto.Alinee el asistente de blastocisto horizontalmente y fije uno con la aguja de sujeción aplicando vacío. Utilice la aguja de inyección para girar el asistente de blastocisto hasta que la masa celular interna esté a las nueve en punto. Coloque la aguja de inyección a las tres en punto.Asegúrese de que no haya células ES en la punta de la aguja y aplique un pulso piso hasta que la aguja de inyección atraviese la zop lucita y la trifecta, llegando al sello blastular. Libere de cinco a 15 células ES para que se adhieran a la masa celular interna. Continúe hasta que todos los blastoayudantes hayan sido inyectados tras finalizar las inyecciones.Se lavó dos veces en K-S-O-M-A-A y proceda a la transferencia quirúrgica de embriones en hembras pseudoembarazadas. Coloque y anestesie a la hembra receptora pseudoembarazada en el área quirúrgica. Con una afeitadora eléctrica, retire el vello del cuadrante inferior derecho. Desinfecte el área utilizando una solución a base de yodo y etanol al 70 % bajo un microscopio estereoscópico.Utilice tijeras para abrir la piel, luego coloque las tijeras cerradas entre la piel y el peritoneo y ábralas para separar el peritoneo de la piel. Localice el ovario a través del peritoneo, que debe aparecer como un punto rojo. A continuación, use las tijeras para abrir el peritoneo en esa región.Utilice pinzas para agarrar cuidadosamente el CTU o la grasa circundante y extraiga el útero usando una pipeta capilar conectada a una pipeta de boca. Tome un grupo de aproximadamente 10 blastocistos sosteniendo el oviducto y el útero con pinzas. Use una aguja para hacer un pequeño orificio en el útero.Luego inserte la capilar con ayuda de chorro en la luz del útero y libere los embriones. Empuje el útero de vuelta hacia la cavidad abdominal. Localice los bordes del peritoneo y cierre con algunas puntadas.Cierre la piel del ratón con algunas grapas. Administre medicación analgésica por vía subcutánea. Luego, transfiera al ratón de vuelta a su jaula bajo una lámpara de calor.Monitoree la respiración del ratón hasta que despierte. Tras la enucleación y la transferencia nuclear de células somáticas. Aproximadamente el 70 % de los embriones fueron positivos para pseudo-pronúcleos.Como se muestra en esta figura. El tratamiento con TSA durante seis o diez horas no tuvo efecto. Después de tres días y medio en cultivo, del 5 al 10 % de los embriones se desarrollaron en blastocistos.Nuevamente, la adición de TSA no tuvo ningún efecto sobre la tasa de desarrollo del blastoasistente. Los blastoasistentes de TCNI se utilizaron luego para derivar células madre embrionarias. TSA mejoró significativamente la tasa a la que se derivaron las ESL a partir del blastoasistente.Las células S-C-N-T-E-S se utilizan para generar ratones quiméricos. Se toma sangre de estos ratones y se analiza la presencia de linfocitos T específicos mediante análisis de facts, como se muestra aquí. Cuando la sangre se tiñe con anticuerpo anti CDA y tetrámero específico, puede identificarse una población doble positiva.Lo que indica que la célula donante utilizada para la TCNS tenía la especificidad correcta. Acabo de mostrarle cómo realizar la transferencia de células somáticas LU, inyecciones con ayuda de blastocistos y transferencia de embriones. El punto más importante a considerar es la pureza de sus células T o células B.Una vez que haya aprendido a realizar la transferencia somática y sus embriones hayan alcanzado la etapa de blastocisto, puede optar por transferirlos directamente a hembras pseudoembarazadas o utilizarlos para obtener células madre embrionarias y generar ratones quiméricos.

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