Imagen de la posición vertical Drosophila Los embriones

Aquí se presenta un protocolo de montaje para teñido

El objetivo general del siguiente experimento es obtener imágenes de visualización coronal de embriones oph intactos utilizando microscopía confocal que se puede utilizar para medir con precisión el tamaño del embrión y cuantificar los niveles de expresión de proteínas y ARN. Esto se logra mediante el uso de un medio de montaje de consistencia gelatinosa para encerrar los embriones dentro de él y colocarlos en posición vertical. Como primer paso.

Los embriones se alinean sobre una capa delgada de gelatina de glicerina y luego se cubren con una segunda capa de este medio. A continuación, el medio de montaje que contiene los embriones se corta en bloques, que se pueden voltear verticalmente para sostenerlos. Los embriones en posición para los resultados de imagen se obtienen que muestran imágenes de corte transversal visualizadas con cualquier tipo de microscopio confocal.

Hola, mi nombre es Milu. Soy estudiante de posgrado en el Meso Lab en el departamento de biología de la Universidad Case Western Reserve. Hoy vamos a demostrar un protocolo de montaje para obtener imágenes de embriones PHI en posición extranjera utilizando un microscopio confocal.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la técnica de imagen Endon desarrollada por el Laboratorio Mindin, es que permite una preparación y visualización sencillas de embriones fijos o tejidos de cualquier tamaño y forma. La idea de este método fue cuando necesitábamos visualizar secciones transversales de embriones muy pequeños de otras especies de yeso, que serían muy difíciles de cortar a mano. Este método puede ayudar a responder preguntas en el campo de la biología del desarrollo al permitir cuantificaciones precisas de la expresión génica y los niveles de proteínas a lo largo del eje ventral dorsal.

Por lo general, los embriones se montan longitudinalmente. Si bien es posible obtener reconstrucciones de Zack de secciones transversales, a menudo existe un problema de fotoblanqueo de la dispersión de la luz de los ojos fluorescentes, y lleva mucho tiempo. Nuestra técnica minimiza estos problemas porque las imágenes transversales de los embriones se visualizan a lo largo de un solo punto confocal.

En general, las personas nuevas en este método pueden experimentar algunas dificultades al cortar los bloques de glicerina cerca de la punta de los embriones. La demostración visual de este método es fundamental porque requiere un manejo cuidadoso. Hoy tenemos una demostración hecha por nuestros estudiantes, Catherine Chen y catty para preparar embriones de Drosophila para imágenes verticales.

Primero derrita la gelatina de glicerina en un baño de agua a 55 grados centígrados durante 20 a 30 minutos hasta que se convierta en un remolino líquido homogéneo. Pero no agite la botella para evitar la formación de burbujas. Con una punta de pipeta P 1000 cortada, pipetee con cuidado un mililitro de gelatina de glicerina derretida en el portaobjetos.

Para crear una primera capa delgada y uniforme libre de burbujas de aire, deje que la gelatina se solidifique durante cinco minutos sobre una superficie horizontal. Luego coloque el portaobjetos en un congelador a menos 20 grados centígrados durante cinco minutos. Alternativamente, cubra el portaobjetos con una envoltura de plástico y colóquelo a cuatro grados centígrados durante un máximo de cinco días.

Una vez que la primera capa de gelatina se haya solidificado, lleve el portaobjetos al endoscopio y proceda a la alineación del embrión. Pipetear una pequeña cantidad de embriones teñidos y glicerol PBS al 70% en el lado de la primera capa de gelatina. Debajo del endoscopio, alinee el embrión uno al lado del otro a lo largo de tres o cuatro columnas por portaobjetos.

Use una aguja hipodérmica para sacarlos usando el lado inclinado de la aguja. Como una cuchara. Oriente cuidadosamente las cabezas de todos los embriones en la misma dirección deslizándolas horizontalmente sobre el medio gelatinoso con la ayuda de la aguja.

La configuración final de los embriones alineados será similar a la descrita para la inyección de ADN. Con un trozo retorcido de toallita Kim, elimine el exceso de glicerol PBS de los embriones. Pipetee cuidadosamente entre 50 y 300 microlitros de gelatina de glicerina derretida sobre los embriones, dependiendo del número de embriones para hacer una segunda capa de gelatina.

Finalmente, enfríe el portaobjetos a menos 20 grados centígrados durante cinco a 10 minutos, o guárdelo a cuatro grados centígrados durante la noche. Para extraer los embriones incrustados en glicerol del portaobjetos para obtener imágenes bajo un endoscopio de disección, use una cuchilla de afeitar para cortar la gelatina muy cerca de los lados anterior y posterior de los embriones alineados. Sostén la hoja de afeitar en un ángulo de 90 grados.

Para hacer cortes rectos, agregue de 100 a 200 microlitros de PBT frío junto a los cortes. Raspar con cuidado la gelatina junto a los embriones. Con una espátula, el PBT ayuda a liberar el bloque de embriones.

Transfiera el bloque a un portaobjetos de microscopio seco para su posterior corte. Primero corta bloques más pequeños con cinco a siete embriones en su interior. Segundo recorte exceso de gelatina de glicerina que puede interferir con la imagen.

Finalmente, voltee los embriones incrustados a una posición vertical con la ayuda de una cuchilla de afeitar y una aguja. Para visualizar los embriones de Drosophila utilizando un microscopio confocal invertido, coloque el bloque de gelatina que contiene los embriones en un cubreobjetos. Asegúrese de que el sitio del embrión con la menor cantidad de gelatina esté en contacto más cercano con el objetivo.

Si usas un microscopio vertical para tomar imágenes, haz cuatro pilas de pegamento supra. Número uno, cubra los cubreobjetos que se utilizarán como soportes y coloque el bloque embrionario en glicerol entre los soportes. Conecte las pilas con un cubreobjetos más largo para el análisis confocal.

Coloque la muestra en la platina del microscopio. Compruebe la distancia de trabajo de los objetivos que se van a utilizar para averiguar si puede obtener imágenes de todo el embrión o si sólo puede configurar parcialmente la configuración confocal en el ordenador para iniciar la obtención de imágenes como se muestra aquí. Si el protocolo se realiza correctamente, se pueden observar imágenes transversales de embriones con morfología intacta porque los embriones se dejan intactos.

Este método se puede utilizar para tomar medidas precisas del tamaño de los embriones y los niveles de expresión génica en todo el eje ventral dorsal. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 30 a 45 minutos. Es importante eliminar el exceso de glicerol antes de verter la segunda capa de gelatina de glicerina sobre los embriones.

De lo contrario, las dos capas pueden dividirse y dificultar el paso de corte. Además, debe verificar la distancia de trabajo de los objetivos que está utilizando para asegurarse de que puede obtener imágenes de todo el embrión o solo de una parte, ya que la distancia de trabajo crea una limitación de la cantidad de imágenes que puede obtener imágenes. Asegúrate de cortar la gelatina muy cerca del lado del embrión en el que te colocarás hacia el objetivo.

De lo contrario, solo obtendrás imágenes de gelatina en lugar de los embriones. Después de ver este video, esperamos que tenga una buena comprensión de cómo tomar imágenes transversales de Joseph Embryos. Gracias por vernos y buena suerte con tus experimentos.