Mutagénesis y análisis funcional de los canales iónicos heteróloga se expresa en células de mamífero

Los canales de potasio rectificadores entrantes activados por proteínas G, o grk, son importantes para regular la excitabilidad de las neuronas. Los gks pueden activarse tanto por receptores acoplados a proteínas G (GPCR), como el receptor muscarínico M2R, como por el alcohol, para estudiar los efectos de mutaciones en el sitio de unión al alcohol en gerk. Tras su activación, se introduce una mutación puntual en el ADNc de grk mediante mutagénesis dirigida al sitio; los constructos purificados de gerk se transfectan, junto con constructos de YFP, en células mamíferas, y la eficiencia de transfección se evalúa mediante imágenes de fluorescencia.

Posteriormente se realiza un análisis de registro de membrana total con parche para comparar la activación dependiente del alcohol y de las proteínas G. Esta demostración visual del experimento le proporcionará información clave sobre cómo estudiar la función de los canales LY. Hoy analizaremos una pregunta sobre cómo el alcohol activa los canales de grupo.

La técnica de neogénesis dirigida al sitio mostrada aquí puede proporcionar información sobre la función de los canales iónicos. Esta técnica también puede aplicarse a otros sistemas en los que se sabe que una mutación en un gen causa enfermedades humanas. Estas son demostraciones del método de registro en parche de células en ascenso, lo cual es fundamental porque existen muchos pasos que requieren precisión, compensación electrónica adecuada y práctica para generar datos utilizables.

El ADN utilizado para la transfección en este protocolo se prepara de la siguiente manera. Primero, la subunidad GRK, el ADN proveniente de la PCR se clona directamente en la expresión mamífera. Se introducen mutaciones puntuales en el plásmido PC DNA 3.1 utilizando cebadores diseñados adecuadamente junto con el kit de mutagénesis dirigida en dos sitios Quick Change XL.

Utilizando este sistema, se realiza una PCR en la cual se replica todo el plásmido, y se introducen mutaciones puntuales codificadas por los cebadores. Tras la PCR, los plásmidos replicados se digieren con la enzima de restricción DPN I y luego se transforman mediante choque térmico en E. coli XL10-Gold ultracompetentes. Las bacterias transformadas se cultivan en placas de agar LB con ampicilina; las bacterias que portan el plásmido son resistentes a la ampicilina y formarán colonias.

Se seleccionan las colonias aisladas y se cultivan en cultivos miniatura. Se realizan minipreparaciones para aislar el ADN plasmídico. Luego, el ADN se secuencia para identificar los mutantes que se transformaron con éxito.

Se cultivan E coli en un lote más grande y se realizan preparaciones maxi para obtener mayores cantidades de ADN plasmídico. Siembre aproximadamente una vez 10 a la cinco células HEC 2 9 3 T en cada uno de dos pozos de una placa de 12 pozos, uno para el mutante y uno para el control. Incube el canal tipo silvestre a 37 grados Celsius.

Después de ocho a 24 horas, las células se adherirán a su sustrato y estarán listas para la transfección. Transfecte las células con lipo 2000 según las instrucciones del fabricante, utilizando 0,2 microgramos de ADNc del canal, 0,4 microgramos de ADNc del receptor M2R y 0,04 microgramos de ADNc-YFP. Para identificar las células transfectadas con éxito, incube las células durante 24 horas.

Una vez transcurrido el tiempo de incubación deseado, coloque las células en la platina de un microscopio de fluorescencia invertido para determinar la eficiencia de transfección. Compare las imágenes fluorescentes con las de contraste de interferencia diferencial (DIC) para determinar el porcentaje de células transfectadas. Devuelva la placa de cultivo al incubador.

Limpie cubreobjetos de vidrio de 12 milímetros y guárdelos en etanol hasta su uso. Elimine el etanol residual mediante flambado en el gabinete estéril. Coloque los cubreobjetos en una placa de 24 pocillos y revístalos con 0.2 miligramos por mililitro.

24 horas después de la transfección, se trata con tripsina las células y se siembran cuatro por diez a la tres células por pocillo. En cuatro a ocho pocillos de un plato de 24 pocillos que contienen cubreobjetos de vidrio recubiertos con poli-l-lisina, incubar durante 24 a 48 horas adicionales antes de realizar el registro de parche en modo convencional. Preparar los electrodos de registro utilizando un tirador vertical de dos pasos y vidrio borosilicatado para electrodos.

Lo ideal es que el electrodo terminado tenga una resistencia de tres a siete megaohmios y que no requiera manipulaciones adicionales, como el pulido térmico. Para el registro de parche, coloque un cubreobjetos con células transfectadas en una placa de 35 milímetros que contenga solución externa de potasio 20 milimolar o 20 K. Coloque la placa sobre la platina de un microscopio de fluorescencia invertido.

La configuración de registro por parche utilizada aquí emplea un sistema de perfusión. Este sistema contiene las soluciones extracelulares que se aplicarán a las células, las cuales se suministran por gravedad a través de tubos conectados a una válvula múltiple. Cada solución se controla a distancia mediante una válvula de compresión electromagnética.

Utilice el contraste de interferencia diferencial (DIC) para enfocar y encontrar células. Cambie al filtro YFP para localizar las células positivas para YFP. Una vez identificadas las células positivas para YFP, coloque la punta del sistema de perfusión, célula neurofluorescente, a 20-30 micrómetros o dos a tres longitudes celulares de distancia.

Llene un electrodo con solución interna para el electrodo. Utilizando una jeringa y una aguja flexible, golpee suavemente el electrodo lleno para eliminar las burbujas de aire de la punta. Conecte los electrodos a la etapa de cabezal de un amplificador AXO patch 200 B.

Verifique nuevamente que la configuración del amplificador coincida con una configuración determinada. El interruptor de célula completa está en beta igual a uno, y el filtro paso bajo está ajustado a 10 kilohercios. Aplique presión positiva con la jeringa y la pinza para mantener limpia la punta del electrodo.

Luego, utilice un micromanipulador para colocar la punta del electrodo en el baño y muévalo por encima de la célula. Cambie el amplificador al modo V track y el botón del medidor al modo V track. A continuación, use el medidor de potencial de compensación de la pipeta en el amplificador para ajustar a cero el potencial de la pipeta, llevando el voltaje en la pantalla del medidor del amplificador a 0,00.

Alternativamente, cambie al modo de sujeción de voltaje en el amplificador y seleccione el botón de pulso de prueba para aplicar un escalón de voltaje de prueba. El escalón rectangular de voltaje aparecerá en la ventana de prueba de sellado del sujeción. Ajuste el offset de la pipeta en el amplificador para llevar la corriente de línea base a cero nanoamperios.

La prueba de sellado mostrará la resistencia del electrodo, que debe estar entre tres y siete megaohmios. A continuación, cierre la ventana de la prueba de sellado. Seleccione adquirir protocolo abierto en el menú desplegable.

Luego, seleccione un protocolo de voltaje guardado. Aquí, el protocolo seleccionado ha sido programado previamente para aplicar un único escalón de voltaje desde menos 100 milivoltios hasta más 40 milivoltios cada dos segundos. Este protocolo de rampa permite observar el potencial de inversión y la propiedad de rectificación interna de los canales GK.

Para los canales iónicos regulados por voltaje, puede ser más adecuado un escalón rectangular de voltaje utilizando el ajuste fino del micromanipulador para acercarse a la célula, liberar la presión positiva y, tras tocar la superficie celular, aplicar una ligera presión negativa. Monitoree el aumento resultante en la resistencia durante la prueba de sellado. Una vez que la resistencia alcance el rango de gigaohmios, el electrodo se habrá sellado sobre la membrana.

Esto se conoce como sello gigaohm. Mediante una jeringa, aplique un pulso de presión negativa para romper la membrana y obtener acceso a la célula. Una vez en la configuración de célula íntegra, la prueba del sello registrará corrientes capacitivas grandes que son visibles como picos o transitorios al principio y al final de la prueba.

Pulso en la prueba de sellado. A continuación, haga clic en el botón de prueba de membrana. En el clamp X, registre la resistencia de acceso y la resistencia de la membrana.

Una capacitancia de membrana en un cuaderno verifica visualmente el ajuste exponencial. La capacitancia de membrana es proporcional al tamaño celular y se utilizará para calcular la densidad de corriente accesible. La resistencia y la resistencia de membrana se emplean para evaluar si la grabación será satisfactoria para continuar.

Una buena grabación tendrá una baja resistencia de acceso. Ahora cierre la ventana de prueba de membrana y haga clic nuevamente en el botón de prueba de sello en la ventana de prueba de sello. Establezca V out en menos 40 milivoltios para compensar la capacitancia de la membrana y la resistencia en serie en el amplificador, active el condensador de celda completa (whole cell cap), y ajuste hacia adelante y hacia atrás el condensador de celda completa y la resistencia en serie hasta que el transitorio se minimice y la corriente sea una línea plana. Si es necesario, ajuste la capacitancia de la pipeta con el botón de capacitancia rápida (fast cap) en el amplificador.

Una compensación excesiva o insuficiente dejará un transitorio de capacidad residual. A continuación, gire el mando de porcentaje de predicción a entre 60 y 80 % y reajuste la resistencia en serie del condensador de célula completa y el condensador rápido según sea necesario para obtener una línea plana en la prueba de sellado. Finalmente, gire la compensación porcentual a aproximadamente 100 % sin hacer oscilar la célula, intentando mantener el pulso lo más lineal posible mediante el reajuste de los potenciómetros de resistencia en serie del condensador de célula completa y del condensador rápido.

Una vez lograda la compensación de resistencia y capacitancia, anote en un cuaderno el valor establecido para el porcentaje de resistencia en serie de capacitancia del amplificador, el porcentaje de predicción de compensación y el tiempo de retardo, encienda la válvula de solución externa para la solución de baño control 20 K. Establezca el filtro del vaso de paso bajo en el amplificador a dos kilohercios. Luego, comience a registrar las corrientes haciendo clic en el botón de grabación en el software.

Busque la propiedad de rectificación interna de la corriente ger. Esto se observa como una corriente entrante grande negativa respecto al potencial de reversión del potasio, que se determina mediante la ecuación de Nernst EK, y una corriente saliente pequeña positiva respecto a ek. Tras registrar una línea base estable, determine la activación mediada por receptores de las corrientes aplicando la solución extracelular 20 k más carbacol.

Una vez que se observe la activación máxima y la corriente alcance un estado estable, cambie nuevamente a la solución de baño K y espere hasta que la corriente regrese al nivel basal. A continuación, para estudiar la activación por alcohol de las corrientes gert, cambie a la solución externa con 20 k más etanol 100 milimolar y espere la respuesta máxima.

Luego, regrese a la solución de baño de 20 K y espere hasta que se alcance el nivel de corriente basal. Finalmente, para determinar las corrientes basales de gert, cambie a la solución de 20 K más 20 K de bario y espere la respuesta aquí. La inhibición de la corriente gerk debe ser evidente, siendo más pronunciada a menos 100 milivoltios durante todo el procedimiento.

Observe el número de barrido de la traza correspondiente a la aplicación de diferentes soluciones extracelulares. Un solo archivo de ajuste de tipo clamp contendrá todos los barridos para todo el experimento. Para analizar los datos de GK, utilice el software Clamp FIT 8.2.

De acuerdo con las instrucciones del protocolo escrito adjunto, se obtuvieron dos grabaciones diferentes al por mayor de células HEC 2 9 3 T que expresaban canales GK de tipo silvestre o mutantes, y se analizaron según las instrucciones de este video, como se muestra aquí para GK tipo silvestre dos. El panel izquierdo contiene una ventana con varias corrientes superpuestas que fueron producidas por el protocolo de rampa de voltaje en presencia de diferentes soluciones. Observe la rectificación entrante.

Esa es la corriente entrante más grande a −100 milivoltios alrededor de los 50 milisegundos en el trazado de corriente. La pequeña corriente saliente entre cero y +40 milivoltios alrededor de los 200 a 260 milisegundos en el trazado de corriente proviene de un canal de potasio regulado por voltaje endógeno. No es la corriente Gert cursor.

Uno se coloca sobre la corriente entrante máxima, y los valores del cursor se escriben en la hoja de cálculo. En la hoja de cálculo, se observan el número de trazado y la corriente a menos 100 milivoltios.

Los datos incluyen la corriente basal, corrientes inducidas por carbachol y corrientes evocadas por alcohol, así como una corriente inhibida por bario. Asimismo, se muestran las corrientes durante una rampa de voltaje en presencia de diferentes soluciones: 20 k más 100 milimolares de etanol o 20 k más cinco milimolares de carbachol o 20 k más bario, para el canal mutante L 2 57 w.

Observe las corrientes inducidas por alcohol y carboalcohol significativamente más pequeñas. Estos hallazgos sugieren que este residuo desempeña un papel importante en la regulación de los canales GK por el alcohol y las subunidades g beta gamma. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo construir una mutación en un gen y comenzar a estudiar su efecto sobre la función del canal utilizando técnicas electrofisiológicas avanzadas.

Una vez dominada, esta técnica de neogénesis dirigida por sitio puede realizarse en dos o tres días y ampliarse hasta incluir cinco o más mutaciones. El desarrollo de estas técnicas allanó el camino para que los biofísicos de canales iónicos exploraran las propiedades fundamentales de la función y la compuerta de los canales iónicos. Además, permiten a los investigadores estudiar las enfermedades humanas causadas por una única mutación en un gen de canal iónico.