Name: Mutagénesis y análisis funcional de los canales iónicos heteróloga se expresa en células de mamífero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 28 s
Description: Aprende mutagénesis dirigida y electrofisiología de parche para analizar mutaciones puntuales en canales de potasio GRK expresados en células de mamífero. Este protocolo permite estudiar la función de canales iónicos.

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Nuestro trabajo fue posible gracias al apoyo financiero del Fondo de Dotación de McKnight para la Neurociencia (PAS), el Instituto Nacional sobre Abuso de Drogas (R01 DA019022; PAS) y un pre-doctoral NIH NRSA beca para PA (F31AA017042) del Instituto Nacional sobre Abuso del Alcohol y el Alcoholismo. El mutante GIRK2-L257W fue proporcionada por el Dr. Prafulla Aryal. Microscopio de fluorescencia y el patrocinio amablemente proporcionados por los equipos Leica.

1. Mutagénesis dirigida Utilizamos la expresión de mamíferos pcDNA3.1 plásmido que codifica para un cDNA de GIRK2 e introducir una mutación puntual utilizando Stratagene (Agilent Technologies) QuikChange XL II dirigida a un sitio kit de mutagénesis, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Secuencia de los cebadores se pueden generar fácilmente mediante el programa de diseño de la cartilla en línea disponible en: <a href="https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&amp;SubPageType=ToolQCPD&amp;PageID=15">https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&amp;SubPageType=ToolQCPD&amp;PageID=15</a> Nota: el uso estándar de Eppendorf de 1,5 ml en lugar de BD 14 ml tubos descritos en el protocolo. Sin embargo, el uso de XL10-Gold ultracompetent E. coli previamente con β-mercaptoetanol, 30s choque térmico y NZY + (o NZYM +) los medios de comunicación son fundamentales para el éxito de la mutagénesis. Si es posible, la ingeniería una mutación adicional en silencio que crea un nuevo sitio de restricción puede ser conveniente para la detección de colonias mutantes a continuación. 2. Miniprep, secuenciación de ADN y Maxiprep 2.1 Qiagen minipreparación y secuenciación. Individual colonias de bacterias se recogen y se cultivaron en caldo LB con ampicilina (AMP). Seguimos las instrucciones del fabricante para la purificación de la DNA. Un resumen simple restricción se puede utilizar confirmar la exitosa introducción de la mutación, si un sitio de restricción se ha incorporado en el paso 1. Secuenciación automática de ADN se realiza fuera del sitio, y es esencial para confirmar la presencia de la mutación en el cDNA, así como evaluar si hay alguna mutaciones no deseadas. Este paso es muy importante. Nos secuencia de la secuencia de codificación de toda la GIRK utilizando adelante promotor T7 y revertir BGH cebadores de secuenciación que flanquean el sitio de clonación múltiple del plásmido pcDNA3.1. Nota: Es importante inspeccionar cuidadosamente la secuencia electroferograma para asegurar la calidad suficiente de los datos de secuenciación. Electroferograma de alta calidad ha afilado, que no se superponen con los picos de ruido de fondo. 2.2 Qiagen maxiprep. Seguimos las instrucciones del fabricante. Nota: Este paso está incluido en nuestros experimentos para mejorar la pureza del cDNA, que nos encontramos es importante para la transfección eficiente. 3. La cultura y la transfección de células HEK293T Todos estos pasos deben realizarse en una campana de cultivo de tejido estéril. 3.1 de cultivo celular HEK293T células son convenientes porque son fáciles de la cultura (37 ° C, 5% de CO 2 incubadora humidificada), tienen el tiempo de replicación rápida, de alta eficiencia de transfección y son susceptibles de células enteras patch-clamp electrofisiología. HEK293T células expresan el antígeno T SV40 grande que asegura la replicación episomal de plásmido pcDNA3.1. HEK293T células se cultivan en bajos de glucosa en DMEM los medios suplementados con L-glutamina y el 10% de suero fetal bovino (FBS). Para las células pases, añadir 0,25% de tripsina / EDTA a las células confluentes HEK293T (90-95%), esperar hasta que las células se desprenden de la placa del tejido, y luego se detiene la actividad de la enzima por la adición de medio fresco que contiene FBS /. Placa de ~ 1 X 10 5 células / pocillo en una placa de cultivo de 12 células, junto con 1 ml de medio de cultivo libre de antibióticos por pozo. (1 X 10 5 células se ~ 350 l de suspensión celular obtenida a partir de confluencia T25 frasco resuspendió con 10 ml de medio). 3.2 Transfección Después de 8.24 horas, las células HEK se adhiere al plástico y están listos para la transfección. Transfectar células con el canal de 0,2 mg cDNA, 0,4 mg M2R receptor cDNA y 0,04 mg YFP cDNA utilizando Invitrogen Lipofectamine 2000. Nota: se utiliza una pequeña cantidad de YFP cDNA para determinar qué células son transfectadas con éxito (células verdes probable que contenga ambos canales GIRK y los receptores M2). La concentración de cDNA utilizar tendrá que ser ajustada para cada clon. 3.3 Visualización de fluorescencia de células transfectadas. Lugar de 12 y placa en el escenario de un microscopio de fluorescencia invertido, y examinar las células para la expresión de YFP. Compare la imagen de la CID y tome nota del número aproximado de células verdes. Esto proporciona una estimación de la eficiencia de transfección. 3.4 Preparación de los 24 y los platos y poli-D-lisina cubreobjetos recubiertos Limpia de 12 mm cubreobjetos de vidrio (Warner, CS-12R) agitando durante la noche con ellos Radiacwash, seguido de un lavado con agua destilada y agitación durante la noche en el 95% de etanol. Guarde el cubreobjetos limpios en el 70% de etanol hasta su uso. Coloque la tapa se desliza en una placa de Petri con etanol, etanol de fuego con las pinzas y el quemador, unad lugar en un pocillo de una placa estéril 24 también. Cubrir cada pocillo con 250 l de poli-D-lisina (PDL), solución [0,2 mg / ml] y dejar que la cubierta se desliza reposar toda la noche sumergido en una solución estéril PDL bajo el capó. Envuelva la placa de 24 pocillos en Parafilm para evitar la evaporación. A la mañana siguiente, aspirar y lavar PDL 2x con agua estéril. Deja las placas para secarse bajo el capó, luego cubra. Los 24 platos bien con cubreobjetos recubiertos pueden ser envueltos con papel de aluminio estéril y se almacena a temperatura ambiente durante semanas. 3.5 Revestimiento células transfectadas HEK293T en la cubierta se desliza 24 horas después de la transfección las células, dividida en 24 y plato (~ 4 x 10 3 células / pocillo) con cubierta de cristal se desliza recubiertos con poli-D-lisina. Nota: Las células transfectadas se puede utilizar hasta 24-72 horas después de la transfección. Las células se dividen para proporcionar hojas individuales cobertura de patch clamp experimentos de electrofisiología. 4. Electrofisiología 4.1 Preparación de Soluciones Extracelular (bañera) solución: 20 mM KCl, 140 mM NaCl, 0,5 mM CaCl 2, 2 mM de MgCl 2 y 10 mM HEPES (pH 7,4 conjunto con NaOH). Alícuota 20K baño de solución y añadir moduladores adecuados <ul><li> 20K + Ba 2 +: solución que contiene 1 mM BaCl 2: un inhibidor específico de las entradas de corrientes de rectificar </li><li> 20K + Carbachol: solución con M Carbachol 5: un agonista M2R específicos; parejas M2R a proteínas G que se abren los canales GIRK </li><li> 20K + etanol: baño de solución que contiene 100 mM EtOH para activar los canales GIRK directamente </li></ul> Soluciones de baño en lugar de jeringas (contenedores de solución) del sistema de intercambio de perfusión rápida. Nota: Usamos una pizca Warner sistema de válvulas de control de las soluciones de baño. Tubería de PE se recomienda. Internos / electrodo solución: 140 mM KCl, 20 mM NaCl, 5 mM EGTA, 5,4 mM MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7,4) con 2,5 mM K 2 ATP y 0,3 M Li 2 GTP. Hacemos la solución de electrodos sin ATP y GTP. Hemos separado preparar alícuotas de la ATP y GTP, que se almacenan a -80 ° C, y añadir a la solución de electrodos en el día del experimento. Mantenemos una jeringa con la solución definitiva del electrodo en el hielo para preservar la ATP / GTP. Nos filtro estéril (0,2 micras), las soluciones internas / externas para inhibir el crecimiento microbiano y reducir la posibilidad de obstrucción de las trompas y el electrodo. 4.2 electrodos tira Usamos Narishige dos pasos tirador vertical y electrodo de vidrio borosilicato de Warner Instrumento (1,5 mm de diámetro exterior, diámetro interior de 0,86 mm y 7,5 cm de longitud) para obtener electrodos con 3.7 mW de la resistencia cuando se llena con solución intracelular. Nota: Es necesario determinar experimentalmente los parámetros para el extractor de electrodos y el tipo de electrodo de vidrio en el laboratorio. Para nuestro extractor vertical, se utiliza un ajuste de calor de 60,2 para el primer tirón y 43 ~ para el segundo tirón. 4,3 de células enteras patch clamp <ol><li> Monte cubreobjetos en una placa de 35 mm con una pequeña cantidad de vaselina, cubrir con una solución externa y el plato lugar en el escenario de un microscopio de fluorescencia invertido. Use DIC para concentrarse y encontrar las células, cambiar a YFP fluorescencia para localizar YFP células positivas. </li><li> Posición de la punta del colector de la perfusión cerca de una célula verde (20-30 m de la célula de interés longitud de la fibra = 2.3 de diferencia). </li><li> Rellene los electrodos con solución, se adhieren a la headstage de Axopatch amplificador 200B (Axon Instruments) con los siguientes valores iniciales: Ganancia 1, Configuración: conjunto de células β = 1, el modo V-clamp. </li><li> Aplique una presión positiva en el electrodo para evitar la obstrucción de la pipeta, y el uso manipulador de colocar la punta del electrodo justo por encima de la celda. </li><li> A cero la posibilidad de una pipeta, seleccione el botón de prueba del sello para ofrecer un escalón de tensión de prueba. El paso 5 mV de tensión rectangular aparecerá en la ventana de prueba Sello de Clampex. Ajuste el potenciómetro con una pipeta de desplazamiento en el amplificador para que la línea de base actual a 0 nA. Por otra parte, poner a cero el potencial de la pipeta al cambiar el modo de amplificador de selección para el modo V-track y el mando del metro de Vtrack y utilizar el potenciómetro con una pipeta de desplazamiento en el amplificador para que el voltaje en la pantalla del medidor amplificador a "0.00". </li><li> Revise la resistencia del electrodo con el comando sello de calidad de la Clampex 8,2 software (debe ser 7.3 MW). </li><li> Abrir un archivo de protocolo guardado o cree un nuevo protocolo. Para abrir el archivo de protocolo de seleccionar desde el menú principal Adquirir Protocolo luego Abrir y seleccione un archivo de protocolo de tensión salvo. Para este experimento, el protocolo ha sido creada para mantener el potencial de membrana de-40mV, entregar un solo escalón de tensión 50 ms a 100 mV y 40 mV rampa de más de 200 ms. Este protocolo se ejecuta cada dos segundos. El protocolo de rampa permite la observación de la rectificación de una posible regresión y hacia el interior de los canales GIRK. Para los canales iónicos dependientes de voltaje, un escalón de tensión rectangular puede ser más apropiado. </li><li> Celular con enfoque de ajuste fino del manipulador, de liberación de presión positiva, después de tocar la superficie de la célula aplicar presión negativa, y el monitor aumento de la resistencia en la ventana del osciloscopio Sello de prueba. Una vez que la resistencia está en el rango GΩ, el electrodo se ha sellado en la membrana (Gigaseal ha formado). </li><li> Aplicar un pulso de presión negativa para romper la membrana celular y tener acceso a la célula. Una vez en la configuración de célula completa, se registrará un aumento corrientes capacitivas. </li><li> Cambiar a la prueba de membrana en Clampex y anote la resistencia acceso a Ra, Rm resistencia de la membrana, la membrana Cm capacidad y verificar por el ojo de la forma exponencial de la curva teórica a la corriente capacitiva real. Capacitancia de la membrana es proporcional al tamaño de la celda y se utilizará más adelante para calcular la densidad de corriente. </li><li> Volver al sello de calidad, conjunto V de salida (potencial de membrana) a -40 mV y un filtro de 10 kHz </li><li> Compensar la capacitancia de la membrana y la resistencia en serie en el amplificador con los siguientes pasos: <ol class="lalpha"><li> Cambie el interruptor de la PAC CELULAR TODO en. Ajuste de la PAC de células enteras y marca resistencia en serie de ida y vuelta, hasta que llegue un pulso de prueba plana. También puede ser necesario ajustar la perilla pipeta de capacidad de la PAC FAST. </li><li> Gire la perilla% de predicción para aproximadamente el 60-80%, una vez más re-ajuste de la PAC de células enteras y el dial de la resistencia en serie (es posible que tengas que ajustar la capacitancia pipeta una rápida compensación mando de la PAC también). </li><li> Encienda% COMP-al 100% sin oscilación de la célula, mientras trata de mantener el pulso de plano por el reajuste de la PAC de células enteras y la resistencia en serie (es posible que tengas que ajustar la capacitancia pipeta mando de compensación de la PAC rápido también). Ajuste el retraso por la reducción de la constante de tiempo. </li><li> Anote los valores de Cm (capacitancia de la membrana), R (resistencia en serie), COMP%, PRED% y el tiempo de retardo establecido en el amplificador en el cuaderno. El CM y R debe ser aproximadamente la misma que la Cm y Rm medido en la prueba de la membrana de arriba. </li></ol></li><li> En la válvula de solución externa para controlar la solución del baño. Ajuste el amplificador de 8 polos del filtro de Bessel a 2 kHz, abra un protocolo de fijación de voltaje y corrientes comenzar la grabación. </li><li> Registramos corrientes GIRK utilizando un protocolo de rampa que los pasos a -100 mV a 50 ms y después de las rampas de 100 mV a 40 mV más de 200 ms y se entrega cada 2 segundos. El protocolo de rampa permite la observación del potencial de inversión y la propiedad de rectificación hacia el interior de los canales GIRK. A temperatura ambiente (22-25 ° C), la GIRK actual debe invertir cerca de -50 mV (con KCl 20 mM en el baño), que está cerca del potencial de equilibrio calculado para K (E K = -50 mV), entonces quedan bastante plana a potenciales positivos a E K. </li><li> Protocolo experimental: Después de grabar una línea de base estable, cambie a la solución de 20K + Carbachol y esperar a pico de la respuesta, vuelva a la solución de baño de 20K, a continuación, aplicar 20K + etanol y esperar la respuesta de pico, y luego cambiar a la solución del baño 20K, y finalmente 20K + Ba 2 + solución. Durante la aplicación de estos medicamentos que se producirán cambios en la amplitud de GIRK corrientes (más pronunciada a -100 mV). Anote el número de traza correspondiente a la aplicación de diferentes soluciones extracelular en el cuaderno. Un archivo de Clampfit single contendrá todos los barridos de todo el experimento. </li></ol> 5. Análisis de Datos Usamos Clampfit 9.2 de software para analizar los datos de las corrientes GIRK a -100 mV. <ol><li> Abra el archivo con la grabación, sitúa el cursor a -100 mV. Por defecto, se podrá ver todos los vestigios superpuestos en la pantalla. Pulsando el botón "Escribir cursores" icono que va a crear hojas de cálculo tipo Excel con datos numéricos. </li><li> X por asignar a la columna número de seguimiento y Y a la columna del cursor y pulsar "Crear gráfico" icono usted puede dibujar un gráfico de tiempo-curso del experimento. </li><li> Calcular basal actual restando actual en presencia de Ba 2 + de la corriente registrado en la solución de perfusión externos solo ("actual 20K" menos "20K + Ba 2 + actual"). Calcular las corrientes inducidas por restar actual basal de 20K de las corrientes activadas ("20K + Carbachol actual" menos "20K actual", "20K + etanol actual" menos "actual 20K"). Calcular la densidad de corriente (pA / pF), dividiendo el actual capacitancia de la membrana (leer directamente desde el amplificador). Calcular la activación por ciento al dividir las corrientes inducidas por las corrientes de base y multiplicando por 100. </li></ol> 6. Resultados representante Usted debe ser capaz de registro actual de las células transfectadas con los canales de tipo salvaje. Para medir los canales GIRKd en la solución extracelular que contiene 20 mM de K + (y 145 mM de K + intracelular) que debe exhibir rectificación fuerte hacia adentro y un potencial de inversión de ~ -50 mV, que es una propiedad esencial de los canales de potasio. La corriente de tipo salvaje se incrementará en gran medida de aplicación de carbacol (3-5 veces más que basal actual) y responden de manera similar a la de etanol 100 mM. Nota: la convención de signos para electrofisiología es que la corriente hacia el interior es negativo y la corriente hacia el exterior es positiva. Para la mutación L257W en el bolsillo de unión de alcohol GIRK2, podrás ver las respuestas atenuadas tanto carbacol y el etanol. Esto sugiere que la L 257 está implicado en el alcohol y la activación de la proteína G de GIRK2 canales. Para más ejemplos de los resultados de GIRK2 mutagénesis, vea la publicación reciente de Aryal et al. 1. <img src="/files/ftp_upload/2189/2189fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Ventana de Clampfit 8.0 muestra el archivo de datos para el registro de GIRK2 de tipo salvaje. Izquierda del panel superior muestra superpuesta barre registrado en respuesta a un protocolo de rampa de voltaje en la presencia de diferentes soluciones externas bah. El cursor se coloca en un -100 mV. Los valores de cursor se escriben en la hoja de cálculo (panel derecho). Panel inferior izquierdo muestra la representación gráfica del número de barrido frente, actual. Tenga en cuenta el aumento de la corriente (flecha hacia abajo) con etanol (EtOH) y carbacol (CARB) y la inhibición de la corriente con Ba 2 +. <img src="/files/ftp_upload/2189/2189fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Descripción de la ventana de Clampfit 8.0 muestra el archivo de datos para un mutante GIRK2-L257W grabación. Son los mismos que en la Figura 1. Tenga en cuenta la pérdida de carbacol (CARB) y la reducción de la activación de EtOH-corrientes inducidas en los canales de mutantes.

<ol><li>Aryal, P., Dvir, H., Choe, S., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+discrete+alcohol+pocket+involved+in+GIRK+channel+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A discrete alcohol pocket involved in GIRK channel activation.</a> Nature Neurosci. 12, 988-995 (2009).</li>
<li>Panchenko, V. A., Glasser, C. R., Mayer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+similarities+between+glutamate+receptor+channels+and+K%2B+channels+examined+by+scanning+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Phys%22%5BJournal%5D)">Structural similarities between glutamate receptor channels and K+ channels examined by scanning mutagenesis.</a> J Gen Phys. 117, 345-360 (2001).</li>
<li>Doyle, D. A., Cabral, M. orais, Pfuetzner, J., Kuo, R. A., Gulbis, A., Cohen, J. M., Chait, S. L., &amp, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+potassium+channel%3A+molecular+basis+of+K%2B+conduction+and+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity.</a> Science. 280, 69-77 (1998).</li>
<li>Nishida, M., Cadene, M., Chait, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+Kir3.1-prokaryotic+Kir+channel+chimera%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a Kir3.1-prokaryotic Kir channel chimera.</a> EMBO J. 26, 4005-4015 (2007).</li>
<li>Tao, X., Avalos, J. L., Chen, J., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+eukaryotic+strong+inward-rectifier+K%2B+channel+Kir2.2+at+3.1+%26Aring%3B+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the eukaryotic strong inward-rectifier K+ channel Kir2.2 at 3.1 &Aring; resolution.</a> Science. 326, 1668-1674 (2009).</li>
</ol>

La mutagénesis dirigida es un método clásico para estudiar relaciones estructura-función de los canales iónicos. Se basa en la premisa de que al cambiar un residuo crítico de los canales iónicos uno debe ser capaz de observar los cambios pronunciados en la función del canal. Por el contrario, muchas mutaciones que no son críticas en la posición pueden ser introducidos sin perturbaciones importantes en la función del canal. Por lo general, el residuo en cuestión es la primera mutación a alanina, una pequeña organización no polares de aminoácidos, seguida por la mutación de triptófano, el más grande de los aminoácidos 2. Si el residuo es importante para la función del canal, ambas mutaciones se va a cambiar la actividad del canal. Si un residuo menos esencial está mutado, los efectos de la mutación, especialmente a la alanina son a menudo insignificantes. Mutaciones triptófano son más propensos a causar cambios debido a los obstáculos estéricos asociados con el tamaño de triptófano. A menudo, cuando la información estructural que falta, la mutación sistemática a alanina y triptófano dentro de un fragmento de un canal (llamado alanina o escanear triptófano) puede ser utilizado para localizar restos críticos. Es importante señalar que varios clones con diferentes mutaciones puntuales se pueden preparar en paralelo que permite probar múltiples residuos dentro de un tiempo relativamente corto. Recientemente, múltiples estructuras cristalinas de los canales se han convertido en disponibles 3,4,5. Se pueden utilizar para proponer posibles residuos clave para ser probados utilizando el procedimiento descrito en este protocolo. Las mediciones de tipo salvaje del canal debe acompañar siempre a la medición de un canal de mutantes para servir como un control positivo para asegurar que los experimentos de transfección y electrofisiológicos se realizaron correctamente. Las mutaciones puntuales pueden conducir a la falta de una corriente funcional, similares a la regulación actual de tipo salvaje o alteración de la actividad del canal. La falta de corriente medible puede ser debido al tráfico indebido de plegado o alterada. En tal caso, puede ser útil para averiguar si el canal de tráficos correctamente a la superficie mediante un ensayo de inmunofluorescencia biotinilación o contra etiqueta extracelular (sin permeabilización celular) para distinguir entre los no funcionales de canales en la membrana plasmática y los canales de retenido en el interior de la célula . Por último, es aconsejable investigar no sólo la actividad basal del canal, sino también las consecuencias de la mutación en la regulación del canal. Diferentes mecanismos de modulación de la función del canal podría estudiarse en función del canal iónico de interés, incluyendo la regulación de las proteínas G, PIP2, iones, la concentración de ATP, la fosforilación (con tirosina, serina treonina o mutación), ubiquitinación o sumoylation (con la mutación de lisina) y abridores de canal directo o bloqueadores.

<table><tbody><tr><td>Productos químicos</td><td>Sigma</td><td>Varía</td><td></td></tr><tr><td>Kit de mini prep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Radiacwash</td><td>Biodex</td><td>005-100</td><td></td></tr><tr><td>Hidrobromuro de poli-D-lisina</td><td>BD Biosciences</td><td>CB40210</td><td>Se puede usar también poli-L-lisina</td></tr><tr><td>Kit de maxi prep</td><td>Qiagen</td><td>12263</td><td></td></tr><tr><td>Kit QuickChange XL II de mutagénesis dirigida por sitio</td><td>Stratagene</td><td>200512-5</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Láminas de cubreobjetos &amp;#710;&amp;#8230; 12 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>CS-12R</td><td></td></tr><tr><td>Tubo capilar de vidrio borosilicato—pared estándar</td><td>Warner Instruments</td><td>G150-3</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/clinical/inverted-microscopes/details/product/leica-dmi3000-b/" target="blank"&gt;Microscopio invertido de fluorescencia&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/clinical/inverted-microscopes/details/product/leica-dmi3000-b/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Leica</a></td><td>DMI3000 B</td><td></td></tr><tr><td>Electrofisiología</td><td>Nikon/&lt;br/&gt;Leica/&lt;br/&gt;Zeiss</td><td>Cualquier microscopio invertido DIC&lt;br/&gt;(Hoffmann)&lt;br/&gt;con fluorescencia</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador</td><td>Molecular Devices</td><td>Axon Axopatch 200B amplificador</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de perfusión</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-6 perfusión MM-6</td><td></td></tr><tr><td>Digitizador</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1320 digitizador</td><td></td></tr><tr><td>Manipuladores</td><td>Sutter Instruments</td><td>Manipulador: MP-85</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de electrodos</td><td>Narishige</td><td>PC10 extractor vertical de electrodos</td><td></td></tr><tr><td>Mesa de aislamiento</td><td>Technical Manufacturing Corporation</td><td>Mesa con aire</td><td></td></tr></tbody></table>

mutagénesis y análisis funcional de los canales iónicos heteróloga se expresa en células de mamífero

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Vamos a demostrar la forma de estudiar los efectos funcionales de la introducción de una mutación puntual en un canal iónico. Se estudia la proteína G-dependientes de potasio hacia el interior rectificación (en adelante, GIRK) canales, que son importantes para la regulación de la excitabilidad de las neuronas. Hay cuatro diferentes subunidades de mamíferos canal GIRK (GIRK1-GIRK4) - nos centramos en GIRK2 porque forma una homotetrámero. La estimulación de los diferentes tipos de acoplados a proteínas G-receptores (GPCR), como la de los receptores muscarínicos (M2R), conduce a la activación de los canales GIRK. El alcohol también activa directamente los canales GIRK. Vamos a mostrar cómo la mutación de un aminoácido, específicamente, el cambio de uno o más nucleótidos en el cDNA del canal GIRK. Esta secuencia de ADNc mutado será amplificado en bacterias, purifica, y la presencia de la mutación puntual se confirmó por secuenciación del ADN. El ADNc de la mutante y de tipo salvaje canales GIRK se transfectaron en células embrionarias humanas de riñón HEK293T cultivadas in vitro. Por último, el conjunto de células patch-clamp electrofisiología se utilizarán para estudiar las corrientes de potasio macroscópico a través de los canales GIRK expresó ectópica de tipo salvaje o mutado. En este experimento, vamos a examinar el efecto de una mutación L257W en GIRK2 canales en la activación M2R-dependientes y alcohólicos.

Vamos a demostrar la forma de estudiar el efecto de un único punto de mutación en la función de un canal iónico.

Mutagénesis y análisis funcional de los canales iónicos heteróloga se expresa en células de mamífero

Demostraremos cómo estudiar los efectos funcionales de la introducción de una mutación puntual en un canal iónico. Estudiamos los canales rectificadores entrantes regulados por proteínas G...

Los canales de potasio rectificadores entrantes activados por proteínas G, o grk, son importantes para regular la excitabilidad de las neuronas. Los gks pueden activarse tanto por receptores acoplados a proteínas G (GPCR), como el receptor muscarínico M2R, como por el alcohol, para estudiar los efectos de mutaciones en el sitio de unión al alcohol en gerk. Tras su activación, se introduce una mutación puntual en el ADNc de grk mediante mutagénesis dirigida al sitio; los constructos purificados de gerk se transfectan, junto con constructos de YFP, en células mamíferas, y la eficiencia de transfección se evalúa mediante imágenes de fluorescencia.Posteriormente se realiza un análisis de registro de membrana total con parche para comparar la activación dependiente del alcohol y de las proteínas G. Esta demostración visual del experimento le proporcionará información clave sobre cómo estudiar la función de los canales LY. Hoy analizaremos una pregunta sobre cómo el alcohol activa los canales de grupo.La técnica de neogénesis dirigida al sitio mostrada aquí puede proporcionar información sobre la función de los canales iónicos. Esta técnica también puede aplicarse a otros sistemas en los que se sabe que una mutación en un gen causa enfermedades humanas. Estas son demostraciones del método de registro en parche de células en ascenso, lo cual es fundamental porque existen muchos pasos que requieren precisión, compensación electrónica adecuada y práctica para generar datos utilizables.El ADN utilizado para la transfección en este protocolo se prepara de la siguiente manera. Primero, la subunidad GRK, el ADN proveniente de la PCR se clona directamente en la expresión mamífera. Se introducen mutaciones puntuales en el plásmido PC DNA 3.1 utilizando cebadores diseñados adecuadamente junto con el kit de mutagénesis dirigida en dos sitios Quick Change XL.Utilizando este sistema, se realiza una PCR en la cual se replica todo el plásmido, y se introducen mutaciones puntuales codificadas por los cebadores. Tras la PCR, los plásmidos replicados se digieren con la enzima de restricción DPN I y luego se transforman mediante choque térmico en E. coli XL10-Gold ultracompetentes. Las bacterias transformadas se cultivan en placas de agar LB con ampicilina; las bacterias que portan el plásmido son resistentes a la ampicilina y formarán colonias.Se seleccionan las colonias aisladas y se cultivan en cultivos miniatura. Se realizan minipreparaciones para aislar el ADN plasmídico. Luego, el ADN se secuencia para identificar los mutantes que se transformaron con éxito.Se cultivan E coli en un lote más grande y se realizan preparaciones maxi para obtener mayores cantidades de ADN plasmídico. Siembre aproximadamente una vez 10 a la cinco células HEC 2 9 3 T en cada uno de dos pozos de una placa de 12 pozos, uno para el mutante y uno para el control. Incube el canal tipo silvestre a 37 grados Celsius.Después de ocho a 24 horas, las células se adherirán a su sustrato y estarán listas para la transfección. Transfecte las células con lipo 2000 según las instrucciones del fabricante, utilizando 0,2 microgramos de ADNc del canal, 0,4 microgramos de ADNc del receptor M2R y 0,04 microgramos de ADNc-YFP. Para identificar las células transfectadas con éxito, incube las células durante 24 horas.Una vez transcurrido el tiempo de incubación deseado, coloque las células en la platina de un microscopio de fluorescencia invertido para determinar la eficiencia de transfección. Compare las imágenes fluorescentes con las de contraste de interferencia diferencial (DIC) para determinar el porcentaje de células transfectadas. Devuelva la placa de cultivo al incubador.Limpie cubreobjetos de vidrio de 12 milímetros y guárdelos en etanol hasta su uso. Elimine el etanol residual mediante flambado en el gabinete estéril. Coloque los cubreobjetos en una placa de 24 pocillos y revístalos con 0.2 miligramos por mililitro.24 horas después de la transfección, se trata con tripsina las células y se siembran cuatro por diez a la tres células por pocillo. En cuatro a ocho pocillos de un plato de 24 pocillos que contienen cubreobjetos de vidrio recubiertos con poli-l-lisina, incubar durante 24 a 48 horas adicionales antes de realizar el registro de parche en modo convencional. Preparar los electrodos de registro utilizando un tirador vertical de dos pasos y vidrio borosilicatado para electrodos.Lo ideal es que el electrodo terminado tenga una resistencia de tres a siete megaohmios y que no requiera manipulaciones adicionales, como el pulido térmico. Para el registro de parche, coloque un cubreobjetos con células transfectadas en una placa de 35 milímetros que contenga solución externa de potasio 20 milimolar o 20 K. Coloque la placa sobre la platina de un microscopio de fluorescencia invertido.La configuración de registro por parche utilizada aquí emplea un sistema de perfusión. Este sistema contiene las soluciones extracelulares que se aplicarán a las células, las cuales se suministran por gravedad a través de tubos conectados a una válvula múltiple. Cada solución se controla a distancia mediante una válvula de compresión electromagnética.Utilice el contraste de interferencia diferencial (DIC) para enfocar y encontrar células. Cambie al filtro YFP para localizar las células positivas para YFP. Una vez identificadas las células positivas para YFP, coloque la punta del sistema de perfusión, célula neurofluorescente, a 20-30 micrómetros o dos a tres longitudes celulares de distancia.Llene un electrodo con solución interna para el electrodo. Utilizando una jeringa y una aguja flexible, golpee suavemente el electrodo lleno para eliminar las burbujas de aire de la punta. Conecte los electrodos a la etapa de cabezal de un amplificador AXO patch 200 B.Verifique nuevamente que la configuración del amplificador coincida con una configuración determinada. El interruptor de célula completa está en beta igual a uno, y el filtro paso bajo está ajustado a 10 kilohercios. Aplique presión positiva con la jeringa y la pinza para mantener limpia la punta del electrodo.Luego, utilice un micromanipulador para colocar la punta del electrodo en el baño y muévalo por encima de la célula. Cambie el amplificador al modo V track y el botón del medidor al modo V track. A continuación, use el medidor de potencial de compensación de la pipeta en el amplificador para ajustar a cero el potencial de la pipeta, llevando el voltaje en la pantalla del medidor del amplificador a 0,00.Alternativamente, cambie al modo de sujeción de voltaje en el amplificador y seleccione el botón de pulso de prueba para aplicar un escalón de voltaje de prueba. El escalón rectangular de voltaje aparecerá en la ventana de prueba de sellado del sujeción. Ajuste el offset de la pipeta en el amplificador para llevar la corriente de línea base a cero nanoamperios.La prueba de sellado mostrará la resistencia del electrodo, que debe estar entre tres y siete megaohmios. A continuación, cierre la ventana de la prueba de sellado. Seleccione adquirir protocolo abierto en el menú desplegable.Luego, seleccione un protocolo de voltaje guardado. Aquí, el protocolo seleccionado ha sido programado previamente para aplicar un único escalón de voltaje desde menos 100 milivoltios hasta más 40 milivoltios cada dos segundos. Este protocolo de rampa permite observar el potencial de inversión y la propiedad de rectificación interna de los canales GK.Para los canales iónicos regulados por voltaje, puede ser más adecuado un escalón rectangular de voltaje utilizando el ajuste fino del micromanipulador para acercarse a la célula, liberar la presión positiva y, tras tocar la superficie celular, aplicar una ligera presión negativa. Monitoree el aumento resultante en la resistencia durante la prueba de sellado. Una vez que la resistencia alcance el rango de gigaohmios, el electrodo se habrá sellado sobre la membrana.Esto se conoce como sello gigaohm. Mediante una jeringa, aplique un pulso de presión negativa para romper la membrana y obtener acceso a la célula. Una vez en la configuración de célula íntegra, la prueba del sello registrará corrientes capacitivas grandes que son visibles como picos o transitorios al principio y al final de la prueba.Pulso en la prueba de sellado. A continuación, haga clic en el botón de prueba de membrana. En el clamp X, registre la resistencia de acceso y la resistencia de la membrana.Una capacitancia de membrana en un cuaderno verifica visualmente el ajuste exponencial. La capacitancia de membrana es proporcional al tamaño celular y se utilizará para calcular la densidad de corriente accesible. La resistencia y la resistencia de membrana se emplean para evaluar si la grabación será satisfactoria para continuar.Una buena grabación tendrá una baja resistencia de acceso. Ahora cierre la ventana de prueba de membrana y haga clic nuevamente en el botón de prueba de sello en la ventana de prueba de sello. Establezca V out en menos 40 milivoltios para compensar la capacitancia de la membrana y la resistencia en serie en el amplificador, active el condensador de celda completa (whole cell cap), y ajuste hacia adelante y hacia atrás el condensador de celda completa y la resistencia en serie hasta que el transitorio se minimice y la corriente sea una línea plana. Si es necesario, ajuste la capacitancia de la pipeta con el botón de capacitancia rápida (fast cap) en el amplificador.Una compensación excesiva o insuficiente dejará un transitorio de capacidad residual. A continuación, gire el mando de porcentaje de predicción a entre 60 y 80 % y reajuste la resistencia en serie del condensador de célula completa y el condensador rápido según sea necesario para obtener una línea plana en la prueba de sellado. Finalmente, gire la compensación porcentual a aproximadamente 100 % sin hacer oscilar la célula, intentando mantener el pulso lo más lineal posible mediante el reajuste de los potenciómetros de resistencia en serie del condensador de célula completa y del condensador rápido.Una vez lograda la compensación de resistencia y capacitancia, anote en un cuaderno el valor establecido para el porcentaje de resistencia en serie de capacitancia del amplificador, el porcentaje de predicción de compensación y el tiempo de retardo, encienda la válvula de solución externa para la solución de baño control 20 K. Establezca el filtro del vaso de paso bajo en el amplificador a dos kilohercios. Luego, comience a registrar las corrientes haciendo clic en el botón de grabación en el software.Busque la propiedad de rectificación interna de la corriente ger. Esto se observa como una corriente entrante grande negativa respecto al potencial de reversión del potasio, que se determina mediante la ecuación de Nernst EK, y una corriente saliente pequeña positiva respecto a ek. Tras registrar una línea base estable, determine la activación mediada por receptores de las corrientes aplicando la solución extracelular 20 k más carbacol.Una vez que se observe la activación máxima y la corriente alcance un estado estable, cambie nuevamente a la solución de baño K y espere hasta que la corriente regrese al nivel basal. A continuación, para estudiar la activación por alcohol de las corrientes gert, cambie a la solución externa con 20 k más etanol 100 milimolar y espere la respuesta máxima.Luego, regrese a la solución de baño de 20 K y espere hasta que se alcance el nivel de corriente basal. Finalmente, para determinar las corrientes basales de gert, cambie a la solución de 20 K más 20 K de bario y espere la respuesta aquí. La inhibición de la corriente gerk debe ser evidente, siendo más pronunciada a menos 100 milivoltios durante todo el procedimiento.Observe el número de barrido de la traza correspondiente a la aplicación de diferentes soluciones extracelulares. Un solo archivo de ajuste de tipo clamp contendrá todos los barridos para todo el experimento. Para analizar los datos de GK, utilice el software Clamp FIT 8.2.De acuerdo con las instrucciones del protocolo escrito adjunto, se obtuvieron dos grabaciones diferentes al por mayor de células HEC 2 9 3 T que expresaban canales GK de tipo silvestre o mutantes, y se analizaron según las instrucciones de este video, como se muestra aquí para GK tipo silvestre dos. El panel izquierdo contiene una ventana con varias corrientes superpuestas que fueron producidas por el protocolo de rampa de voltaje en presencia de diferentes soluciones. Observe la rectificación entrante.Esa es la corriente entrante más grande a −100 milivoltios alrededor de los 50 milisegundos en el trazado de corriente. La pequeña corriente saliente entre cero y +40 milivoltios alrededor de los 200 a 260 milisegundos en el trazado de corriente proviene de un canal de potasio regulado por voltaje endógeno. No es la corriente Gert cursor.Uno se coloca sobre la corriente entrante máxima, y los valores del cursor se escriben en la hoja de cálculo. En la hoja de cálculo, se observan el número de trazado y la corriente a menos 100 milivoltios.Los datos incluyen la corriente basal, corrientes inducidas por carbachol y corrientes evocadas por alcohol, así como una corriente inhibida por bario. Asimismo, se muestran las corrientes durante una rampa de voltaje en presencia de diferentes soluciones: 20 k más 100 milimolares de etanol o 20 k más cinco milimolares de carbachol o 20 k más bario, para el canal mutante L 2 57 w.Observe las corrientes inducidas por alcohol y carboalcohol significativamente más pequeñas. Estos hallazgos sugieren que este residuo desempeña un papel importante en la regulación de los canales GK por el alcohol y las subunidades g beta gamma. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo construir una mutación en un gen y comenzar a estudiar su efecto sobre la función del canal utilizando técnicas electrofisiológicas avanzadas.Una vez dominada, esta técnica de neogénesis dirigida por sitio puede realizarse en dos o tres días y ampliarse hasta incluir cinco o más mutaciones. El desarrollo de estas técnicas allanó el camino para que los biofísicos de canales iónicos exploraran las propiedades fundamentales de la función y la compuerta de los canales iónicos. Además, permiten a los investigadores estudiar las enfermedades humanas causadas por una única mutación en un gen de canal iónico.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Estrategia de transfección optimizados para la expresión y el registro electrofisiológico de los canales iónicos recombinantes del voltaje en las células HEK-293T

Se describen procedimientos para la reconstitución completa de un canal de potasio dependiente de voltaje prototipo en las membranas lipídicas. Los canales reconstituidas son adecuadas para los ensayos bioquímicos, grabaciones eléctricas, detección ligando y estudios de cristalografía de electrones. Estos métodos pueden tener aplicaciones generales a los estudios estructurales y funcionales de otras proteínas de membrana.

La reconstitución de un canal Kv en las membranas lipídicas de Estudios estructurales y funcionales

Descrito aquí es un procedimiento para la obtención de largos tramos de grabación actual de un canal de iones con la técnica de patch-clamp de células-adjunto. Este método permite observar, en tiempo real, el modelo de open-close conformaciones de canales que son la base de la señal biológica. Estos datos informan acerca de las propiedades de los canales en las membranas biológicas inalteradas.

Un canal celular conectado a Patch-clamp grabación

Descrito aquí es un procedimiento rápido y eficaz para la reconstitución funcional de tipo silvestre purificado y proteína CFTR mutante que conserva la actividad de este canal de cloro, que es defectuoso en la fibrosis quística. Flujo de salida de yoduro de proteoliposomas reconstituidas mediadas por CFTR permite estudios de actividad de los canales y los efectos de las moléculas pequeñas.

Reconstitución funcional y la actividad del canal Las mediciones de Purificada Wildtype y mutante CFTR Proteína

La primera parte de este artículo muestra cómo seleccionar líneas celulares mutantes que expresan intercambiadores vesiculares de Na+/H+ en su membrana plasmática. La segunda parte proporciona protocolos basados en mediciones de pH intracelular y absorción rápida de iones, que se utilizan para determinar la selectividad de iones y los parámetros cinéticos de estos intercambiadores.

Caracterización funcional de Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Intercambiadores de compartimentos intracelular usando selección Protón-matanza para expresarlos a la membrana plasmática

arritmias cardíacas hereditarias son a menudo causados ​​por mutaciones que alteran la entrega superficie de uno o más canales de iones. Aquí, adaptamos citometría de flujo ensayos para proporcionar una cuantificación de la expresión de la proteína total y la superficie celular relativa de los canales iónicos recombinantes expresadas en células TSA-201.

Determinación de la superficie celular y Expresión relativa total de canales de iones recombinante mediante citometría de flujo

El estudio de los canales iónicos a través de un sistema de expresión de forma heteróloga se ha convertido en una técnica básica en la investigación biomédica. En este manuscrito, se presenta un método eficiente de tiempo para conseguir la expresión del canal iónico fuertemente controlada mediante la realización de la transfección transitoria bajo el control de un promotor inducible.

Expresión Ion Channel controlable a través de la transfección transitoria inducible

La purificación de los canales iónicos es a menudo difícil, pero una vez alcanzado, pueden permitir en vitro las investigaciones de las funciones y estructuras de los canales. Aquí, describimos los procedimientos paso a paso para la expresión y purificación de proteínas de mamíferos bestrophin, una familia de Ca2 +-activa los canales de Cl– .

Expresión y purificación de los canales iónicos de mamíferos Bestrophin

Este protocolo describe las técnicas utilizadas para determinar las estructuras de canal de iones por microscopia del cryo-electrón, incluyendo un sistema de baculovirus para expresar eficientemente genes en células de mamíferos con el mínimo esfuerzo y toxicidad, extracción de proteínas, purificación, y comprobación de la calidad, preparación de la red muestra y proyección, así como recopilación de datos y procesamiento.

Expresión y purificación de los humanos sensibles a lípido catiónico canal TRPC3 para la determinación estructural por microscopia del Cryo-electrón de solo-partícula

Este protocolo describe un método para el estudio de proteínas de membrana electrogénicas midiendo los cambios en el potencial de membrana. Este ensayo proporciona una plataforma para la lectura funcional de múltiples canales iónicos expresados endógenamente en líneas celulares epiteliales.

Un ensayo basado en fluorescencia del potencial de membrana para el estudio funcional de alto rendimiento de dos canales iónicos endógenos en dos líneas celulares epiteliales

La focalización farmacológica de los canales iónicos es un enfoque prometedor para el tratamiento de tumores sólidos. Se proporcionan protocolos detallados para caracterizar la función de los canales iónicos en las células cancerosas y analizar los efectos de los moduladores de los canales iónicos en la viabilidad del cáncer.

Detección de canales iónicos en células cancerosas

Aprende mutagénesis dirigida y electrofisiología de parche para analizar mutaciones puntuales en canales de potasio GRK expresados en células de mamífero. Este protocolo permite estudiar la función de canales iónicos.

Mutagénesis y análisis funcional de los canales iónicos heteróloga se expresa en células de mamífero

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