Name: Microinyección de A. aegypti embriones para obtener los mosquitos transgénicos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 39 s
Description: Aprende a generar mosquitos Aedes aegypti transgénicos mediante microinyección de embriones. Este método demuestra la preparación de agujas, desecación de embriones y técnicas de inyección para estudios de biología de vectores y control del dengue.

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Preparación antes de la microinyección <ol><li> Los mosquitos la sangre de alimentación: para la inyección de lunes a viernes en hembras se alimentan el jueves anterior. </li><li> Prepare las agujas de vidrio mediante el programa de 3 o 2 (ver Materiales). </li><li> Por la que se tubo para los embriones de Drosophila vial cultura. Algodón húmedo en la parte inferior, con un disco de papel de filtro húmedo que lo cubre. </li><li> Prepare cubreobjetos de plástico adhesiva de doble cara de la cinta a un extremo. Cinta de ajuste para cubrir deslizamiento de forma que termine en el borde del cubreobjetos. </li><li> Preparar el aceite para la desecación (ver Materiales) </li><li> 150 ml vaso de plástico con un algodón húmedo en la parte inferior, cubierto con un disco de papel de filtro húmedo (80 mm Whatman) para mantener los embriones después de la inyección. </li></ol> Puesta en marcha de por la que se obligó <ol><li> Recoger 60-10 hembras alimentadas con sangre con el uso de un aspirador y transferirlos a la cultura vial Drosophila con algodón húmedo y papel de filtro. </li><li> Puesto que los mosquitos de nuevo en condiciones insectory en la oscuridad, y permitir a poner huevos durante 1 hora y 15 minutos. </li><li> Permiten a los adultos vuelan en la jaula y retire el disco de papel filtro con embriones. </li><li> Para alinear los huevos, lo hacen bajo microscopio de disección. Con unas pinzas finas N º 5 o un pincel fino, de color gris a recoger oscuro-gris embriones y los arreglos en línea en la plaza de papel Whatman 3MM empapado de agua. Todos los embriones debe estar en la misma orientación, como la inyección tiene que estar en el polo posterior. El extremo anterior del embrión es ligeramente más ancha que la posterior. Seque el papel de filtro con embriones pulsando un papel de filtro seco para (ropa mojada no se pegue a la cinta). Para transferir los huevos, invertir la diapositiva que contiene la cinta de doble cara y presione suavemente contra los huevos. El extremo posterior de los huevos tienen que estar muy cerca de la orilla de la cinta de doble cara. </li><li> Desecar los embriones de 1 min. a temperatura ambiente. Empiezan a hoyuelo poco cuando se secan. </li><li> Cubrir los embriones desecados con aceite para evitar la desecación de halocarbonos más. </li></ol> Microinyección de los embriones <ol><li> El aspecto más importante de la inyección es la calidad de la aguja (ver Materiales). </li><li> Llenará una aguja con la solución de ADN que se inyecta mediante una microloader. Muy solución inyectable que se necesita poco: 1 a 2 l. </li><li> Conecte la aguja a la Transjector, que controla el tiempo de inyección (Manu) y presión (600), y la contrapresión (250). Microinyección se realizó con un microscopio con una etapa de movimiento (Leica) en x 10 aumentos y un micromanipulador. Si es necesario, una platina del microscopio puede ser levantado por el apilamiento preparar diapositivas 5.4 microscopio. Coloque la hoja de la cubierta lleva los embriones en etapa levantada. Inyectar embriones horizontal para evitar la ruptura de la endochorion, la penetración debe ser en el polo posterior. Para la inyección, que mantener la aguja fija y mover la platina del microscopio. </li><li> Inyectan 0.2-0.5 nl de solución, que corresponde a aproximadamente 1.5% del volumen del embrión. Controlar el volumen de inyección mediante el ajuste de la presión de inyección y el tiempo. El se inclinó ligeramente, los embriones desecados debe recuperar su turgencia después de la aparición de la inyección. </li><li> Recoger los embriones de la hoja de la cubierta con unas pinzas finas o un pincel fino, y colocarlos en un recipiente de plástico con algodón húmedo y papel de filtro húmedo. Cubrir vaso con papel de seda. Mantenga en su lugar con una banda elástica alrededor de la llanta y el retorno a las condiciones de insectario para 4 días. </li></ol> Después de la inyección <ol><li> Cuatro días después, se coloca cuidadosamente el papel del embrión, el embrión hacia abajo, sobre el agua en la caja grande de plástico con una pequeña cantidad de comida. Embriones eclosionan en un periodo muy largo: no se deshaga de la cultura por lo menos hasta 4-5 semanas después de la inyección. </li></ol> Notas ADN para la inyección Solución de ADN plásmido para la inyección fue aislado utilizando el kit plásmido EndoFree. Construir y mezclar plásmido ayudante juntos en la concentración de la derecha, se precipitó con izopropanol. El sedimento se lavó con etanol al 70% antes de resuspender en tampón de inyección. Antes de la inyección, el ADN limpia utilizando Millex-GV columna.

<table><tbody><tr><td>Solución de inyección 1x</td><td>Tampón</td><td></td><td></td><td>5 mM KCl, 0,1 mM fosfato sódico, pH 6,8</td></tr><tr><td>Plásmido del constructo</td><td>ADN</td><td></td><td></td><td>0,5 mg/mL</td></tr><tr><td>Plásmido auxiliar</td><td>ADN</td><td></td><td></td><td>0,3 mg/mL</td></tr><tr><td>Kit EndoFree Plasmid</td><td>Kit</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Columna Millex-GV</td><td></td><td></td><td>SLGV RO4 NL</td><td>Para limpiar el ADN.</td></tr><tr><td>Tractor de vidrio</td><td>Instrumento</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Modelo P-87</td><td>Calor-815, Tracción-10, Vel-10, Tiempo-100. Calor-700, Tracción-30, Vel-36, Tiempo-50</td></tr><tr><td>Tractor de cuarzo</td><td>Instrumento</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Modelo P-2000</td><td>Calor-275, Fil-3, Vel-38, Ret-250, Tracción-141</td></tr><tr><td>Agujas de vidrio para inyección</td><td></td><td></td><td></td><td>Preparadas estirando tubos capilares hasta obtener una punta fina de 3-8 µm con un vástago de aproximadamente 100-300 µm mediante un tractor de micropipetas. Cuando la aguja es nueva, la punta está sellada y suele romperse en la primera o segunda inyección, o bien la punta de la aguja de vidrio puede biselarse utilizando un biselador de micropipetas tipo Brown (Sutter Instrument).</td></tr><tr><td>Aedes aegypti</td><td>Animal</td><td></td><td></td><td>Moscas macho y hembra, para obtener embriones.</td></tr><tr><td>Vial de cultivo de Drosophila</td><td></td><td></td><td></td><td>Para la puesta de huevos de mosquitos.</td></tr><tr><td>Aceite de halocarbono</td><td>Reactivo</td><td></td><td></td><td>Aceite para desecación: aceite de halocarbono 700 : aceite de halocarbono 27 (1:1)</td></tr><tr><td>Pinzas No5</td><td>Herramienta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pincel fino</td><td></td><td>Kolinsky Sable</td><td>No. 0000</td><td></td></tr><tr><td>Papel Whatman</td><td>Herramienta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microloader</td><td>Herramienta</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>Transjector</td><td>Herramienta</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Con platina móvil y micromanipulador.</td></tr><tr><td>Papel Whatman 3MM</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cinta de doble cara</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

microinyección de a. aegypti embriones para obtener los mosquitos transgénicos

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

En este video, Nijole Jasinskiene demuestra la metodología utilizada para generar transgénicos mosquito Aedes aegypti, que son vectores de la fiebre del dengue. Las técnicas para la correcta preparación de las agujas de microinyección, desecación embriones, y la realización de la microinyección se demuestran.

Microinyección de A. aegypti embriones para obtener los mosquitos transgénicos

En este video, Nijole Jasinskiene demuestra la metodología empleada para generar mosquitos Aedes aegypti transgénicos, los cuales son vectores del dengue...

Yo soy ya. Estoy trabajando en el laboratorio de Anton James. Hoy voy a mostrarle cómo realizar microinyecciones en embriones de ADIs de Egipto con el fin de obtener mosquitos transgénicos.Para obtener embriones para microinyecciones, necesitamos hembras alimentadas con sangre. Se espera que las hembras se alimenten el jueves. Si desea realizar una microinyección desde el lunes hasta el viernes, esto también es posible.Estoy tomando el algodón e introduciéndolo y vertiendo el agua. El algodón debe estar húmedo; tome un círculo blanco de tres mm, colóquelo en la parte superior y presiónelo hacia abajo. Y necesito verter el agua, la cubierta limpia, la servilleta y cerrar con algodón.Esto está listo. Ahora mismo voy a recolectar seis grupos de 10 hembras y voy a transferir a las hembras para retirarlas por un breve período; luego las colocaré en condiciones oscuras y las introduciré en la cámara, que se encuentra a 27 grados Celsius durante una hora y 15 minutos. Estoy fabricando agujas para microinyección utilizando agujas de vidrio, y estamos usando el instrumento de la empresa Polar Shuttle Corporation, modelo P 87. Coloco una aguja de vidrio en el anillo y la fijo por ambos lados

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Invertir enfoques genéticos han demostrado ser extremadamente útil para determinar qué genes de resistencia a patógenos vector subyacente en los mosquitos. Este protocolo de vídeo ilustra un método usado por el laboratorio de James para inyectar dsRNA en hembras de A. aegypti, que albergan el virus del dengue. La técnica para la calibración de agujas de inyección, la manipulación de la configuración de la inyección, y la inyección de dsRNA en el tórax se ilustra.

La inyección de dsRNA en Mujer A. aegypti mosquitos

Los mosquitos Anopheles stephensi son vectores de la malaria que habitan en la India y en toda Asia. Este video muestra la técnica para la realización de micro-inyecciones de esta especie con transgenes que confieren resistencia a la malaria a los mosquitos. Gran parte de la metodología se demuestra en este vídeo es aplicable a las técnicas de microinyección de otras especies de mosquitos.

La inyección de una. Los embriones stephensi para generar la malaria resistente a los mosquitos

En este vídeo, demostramos la integración de transgenes específicos del sitio mediada por phiC31 en el embrión de Anopheles mediante microinyección. Este método ayuda a introducir los genes deseados en un sistema huésped para aplicaciones industriales y de investigación.

phiC31-Integración de transgenes dirigidos en el sitio mediada por integrasa: una técnica de microinyección para la integración de transgenes específicos del sitio en un vector Anopheles

En este video, demostramos la entrega de una construcción de impulsor genético en el embrión del mosquito Anopheles gambiae a través de la técnica de microinyección de embriones. Este procedimiento permite la integración de la construcción de ADN entregada, a través de la recombinación homóloga, en las células de la línea germinal para generar una población de mosquitos transformada.

Microinyección de embriones de mosquitos: una técnica para introducir ADN exógeno en la yema del embrión de Anopheles gambiae para generar mutaciones de la línea germinal

La mosca mediterránea de la fruta (mosca del mediterráneo) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) es una plaga mundial de la agricultura. Una comprensión más profunda de su biología es clave para controlar las poblaciones de moscamed y, por lo tanto, reducir el impacto económico. La microinyección embrionaria es una herramienta fundamental que permite tanto la transformación de la línea germinal como los estudios de genética inversa en esta especie.

Entrega de ácidos nucleicos mediante microinyección de embriones en el Mundial de la Agricultura de plagas de insectos,<em&gt; Ceratitis capitata</em

Nos informe utilizando una artificial pequeño intronic RNA expresión estrategia para desarrollar un recombinante defectuoso no Aedes aegypti densovirus (AaeDV) en vivo el sistema de entrega. Se describe un procedimiento detallado para la construcción, envases y análisis cuantitativo de los vectores rAaeDV, así como por infección larval.

Uso de un Mosquito recombinante Densovirus como un Vector de la entrega de genes para el análisis funcional de Genes en larvas de mosquitos

Este protocolo describe procedimientos de microinyección para embriones de Culex quinquefasciatus que están optimizados para trabajar con herramientas de edición de genes CRISPR/Cas9. Esta técnica puede generar de manera eficiente mutaciones de la línea germinal heredables y específicas del sitio que se pueden usar para construir tecnologías genéticas en este vector de enfermedad poco estudiado.

Técnicas de microinyección embrionaria para una mutagénesis eficiente site-specific en Culex quinquefasciatus

CRISPR/Cas9 se utiliza cada vez más para caracterizar la función génica en organismos no modelo. Este protocolo describe cómo generar líneas eliminatorias de Culex pipiens,desde la preparación de mezclas de inyección, hasta la obtención e inyección de embriones de mosquitos, así como la forma de criar, cruzar y detectar mosquitos inyectados y su progenie para detectar mutaciones deseadas.

Preparación e inyección de embriones de mosquitos Culex para generar mutaciones nulas utilizando CRISPR/Cas9

El protocolo describe cómo lograr modificaciones dirigidas al sitio en el genoma de los mosquitos de la malaria Anopheles utilizando el sistema φC31 . Las modificaciones descritas incluyen tanto la integración como el intercambio de casetes transgénicos en el genoma de las líneas de acoplamiento que llevan attP.

Integración mediada por φC31 dirigida por sitios e intercambio de casetes en anopheles vectores de malaria

Las técnicas de microinyección son esenciales para introducir genes exógenos en los genomas de los mosquitos. Este protocolo explica un método utilizado por el laboratorio James para microinyectar construcciones de ADN en embriones de Anopheles gambiae para generar mosquitos transformados.

Método de microinyección para embriones de Anopheles gambiae

En este trabajo describimos un protocolo detallado para la edición del genoma mediante microinyección embrionaria en el mosquito A. aegypti utilizando la tecnología CRISPR-Cas9.

Edición del genoma del mosquito Aedes aegypti de la fiebre amarilla mediante CRISPR-Cas9

Aprende a generar mosquitos Aedes aegypti transgénicos mediante microinyección de embriones. Este método demuestra la preparación de agujas, desecación de embriones y técnicas de inyección para estudios de biología de vectores y control del dengue.

Microinyección de A. aegypti embriones para obtener los mosquitos transgénicos

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