Name: Microscopía Confocal de córnea: A Novel una técnica no invasiva para cuantificar pequeñas de fibra de Patología en neuropatías periféricas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-03T17:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Aprenda a utilizar la microscopía confocal de córnea para cuantificar daño en fibras nerviosas de manera no invasiva. Esta técnica permite evaluar cambios morfológicos en nervios corneales y estratificar la severidad de neuropatías periféricas.

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Este trabajo fue financiado por la Juvenile Diabetes Research International Foundation (subvención 17-2008-1031) y los Institutos Nacionales de Salud (subvención 1R01DK077903-01A1).

Introducción: La cuantificación precisa de la neuropatía periférica es importante para definir a los pacientes de riesgo, anticipar el deterioro, y evaluar nuevas terapias. Los métodos convencionales de evaluar los déficit neurológicos y electrofisiología y pruebas sensoriales cuantitativas cuantifica las alteraciones funcionales para detectar la neuropatía. Sin embargo, los primeros daños parece ser la de las pequeñas fibras y, sin embargo estas pruebas principalmente evaluar la disfunción de fibras grandes y tienen una capacidad limitada para demostrar la regeneración y reparación. Las únicas técnicas que permiten un examen directo del daño de fibras nerviosas amielínicas y reparación biopsia del nervio sural con el microscopio electrónico y la biopsia de la piel-punch. Sin embargo, ambos son procedimientos invasivos y requieren largos procedimientos de laboratorio y una considerable experiencia. La microscopía confocal de córnea es una técnica clínica no invasiva que ofrece imágenes en vivo de las fibras nerviosas corneales. HRT III-Módulo Rostock corneal (RCM) Manual de Operación 1. Preparación de la cámara El paso inicial en el examen de uso de la TRH es la preparación de la punta del lente del objetivo. <ol><li> Por primera vez en el tubo de objetivo de la cámara de barrido láser, establezca la refracción de 12 dioptrías y luego ajustar la cámara a la posición más baja. </li><li> Aplique una gran burbuja homogéneo, libre, la caída de tamaño de un guisante, de Viscotears en la punta de la lente. </li><li> Eliminar un TomoCap de su envase estéril y montarlo sobre la punta de la lente de modo que el gel forma un menisco entre el objetivo y la tapa. Empújelo tanto como sea posible sobre el titular. Tenga cuidado de no tocar la superficie frontal de TomoCap durante el montaje. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Preparación de la punta del lente objetivo (arriba) la aplicación de viscotear gel (abajo) La aplicación de la TomoCap. </li><li> Mueva la cámara de barrido láser en la medida de lo posible hacia atrás en la montura de la cámara. </li><li> La superficie interior y exterior de la TomoCap ambos aparecen como un reflejo de láser brillante. La rueda de ajuste plano focal debe ser ajustada hasta que un reflejo luminoso que se observa, lo que indica que el objetivo está enfocado en la parte frontal de la tapa. El valor de la profundidad se muestra en la pantalla la posición de enfoque ahora debe estar entre -150 my 150 m. </li><li> Restablecer la configuración de profundidad a cero. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Ajuste del plano focal. </li></ol> 2. Preparación del paciente Los ojos del sujeto están anestesiados utilizando una caída de 0,4% de hidrocloruro de benoxinato y Viscotears se utiliza en la parte frontal del ojo para la lubricación. El sujeto está sentado cómodamente, con la barbilla en la mentonera y pidió a la prensa su frente con firmeza contra la barra de la frente. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Preparación del paciente 3. La alineación de la cámara Esto hace que el examen más fácil si usted instruir al paciente para fijar en la luz de fijación externa con el ojo ni está siendo examinada. El tamaño compacto de la cabeza del microscopio significa que el ojo contralateral del sujeto no se oculta, lo que permite el uso de objetivos de distancia. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Lente objetivo del módulo de la córnea. <ol><li> Posición de la cámara CCD de tal manera que su eje óptico es perpendicular al eje óptico de la cámara de barrido láser. La cámara debe estar en el lado derecho del paciente cuando la imagen del ojo derecho y viceversa. En esta posición, debería ver la superficie frontal de la TomoCap en el centro de la imagen de la cámara CCD en vivo. </li><li> Mueva la cámara de barrido láser hacia el paciente hasta que la córnea del paciente está a una distancia de unos 5 a 10 mm de la TomoCap, luego mueva la cámara de barrido láser hacia arriba / abajo y derecha / izquierda con los mandos de negro en la montura de la cámara hasta que el TomoCap se coloca en el centro de la córnea del paciente. En esta etapa se puede comprobar que la luz del láser rojo está en el centro de la córnea y el ajuste fino, observar el reflejo del rayo láser de la córnea, que es visible en la imagen de la cámara CCD. Esta reflexión debe ocurrir exactamente en el polo anterior de la córnea. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Alineación del haz de láser en el polo anterior de la córnea para capturar las imágenes centrales de córnea. </li><li> Pedir al paciente que abra los ojos de su / su lo más amplia posible. Mueva la cámara de barrido láser lentamente hacia adelante hacia el paciente hasta que los contactos TomoCap la córnea del paciente. Si es necesariopara corregir la posición de la cámara de barrido láser, luego mueva la cámara lejos de la paciente en primer lugar, hacer la corrección, entonces avanzar de nuevo en contacto con la córnea. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Demostración del puente entre la delgada capa de gel TomoCap y la córnea. </li><li> Un contacto mínimo entre la cámara y la córnea es suficiente. En un ajuste óptimo, un puente entre la delgada capa de gel TomoCap y la córnea se ve en la imagen de la cámara CCD en vivo. </li></ol> Si pulsa el TomoCap o mover la córnea demasiado cerca de la cámara, entonces usted verá la presión sobre la córnea con un aspecto aplanado en la córnea a través de la imagen de la cámara CCD en vivo. También en las imágenes obtenidas de una línea que muestra la presión aparecerá, por tanto, no ejerza demasiada presión en la córnea. Una vez que se ha establecido contacto, no se mueva la posición de la headrestto evitar el deslizamiento de la córnea en el TomoCap. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig7.jpg" alt="Figura 7" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 7"> Figura 7 (izquierda) Aparición de una straie debido a la aplicación de un exceso de presión en la córnea por el TomoCap;. (Derecha) Una imagen con apariencia normal, sin exceso de presión. 4. Examinar al paciente Después de que el campo de visión ha sido seleccionado, el HRT III cámara láser se enciende y la ventana de adquisición de la imagen aparece en la pantalla. Usar la imagen CCD a la posición de la TomoCap y la luz láser sobre la córnea del paciente. Examen utilizando el modo seleccionado entonces se puede comenzar. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig8.jpg" alt="Figura 8" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 8"> Figura 8. Modalidad de visualización en el monitor durante la adquisición de las imágenes. El modo de adquisición En el modo de sección, una única imagen que se adquiere y almacena cada vez que se pulsa el interruptor de pie. Utilizamos este modo para capturar imágenes de toda la capa corneal, incluyendo la capa de Bowman en el centro de la córnea. Y luego después de la captura de un número suficiente de imágenes, se puede tratar a los otros modos como la secuencia y el volumen. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig9.jpg" alt="Figura 9" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 9"> Figura 9. Display con la elección de los diferentes modos de adquisición de imágenes. Con el análisis de secuencias, se puede adquirir una secuencia de hasta 100 imágenes con una velocidad de fotogramas ajustable. Usted puede elegir una velocidad de 30 cuadros y un cuadro por segundo (fps) y sobre la base de esta modalidad que le permite adquirir una película con una duración de 3 a 100 segundos. En el modo de escaneo de volumen, la cámara adquiere una serie de 40 imágenes consecutivas en los planos focales. La profundidad total de 85 micras se pueden escanear con el "campo de visión 400 micras" lente de campo y la distancia focal entre dos imágenes consecutivas será de aproximadamente 2,1 micras. Después de las exploraciones de unos pocos el plano de enfoque de la lente se puede modificar para medir la profundidad de una capa de células corneales en relación con la superficie de la córnea por lo que el capa de células epiteliales en el enfoque y luego haciendo clic en el botón de reinicio para establecer el valor de la profundidad a 0. A los efectos del presente estudio, se obtiene imágenes de la córnea central a diferentes profundidades. Por lo tanto, no mover la cámara de barrido láser alrededor de la córnea en horizontal o vertical, apenas nos movemos hacia atrás y hacia adelante y captura de imágenes de todas las profundidades de la capa de Bowman en el punto de la córnea mismo. La distancia entre cada imagen es de aproximadamente 1 micra, por lo tanto, si la profundidad de Bowman es de 10 micras, que contará con 10 imágenes. Sin embargo, para el análisis final, podemos seleccionar las imágenes con una distancia de aproximadamente 3.2 m entre ellos. Después de completar el examen apague la cámara, haga clic en el botón de encendido de la cámara en la ventana de adquisición. Hacer que el paciente sea consciente de que él o ella no debe frotar sus ojos hasta que la anestesia local ha desaparecido. Como medida de precaución, es posible que desee llevar a cabo un examen con lámpara de hendidura de la córnea del paciente después del examen. Retire la TomoCap de la cámara y disponer y luego limpiar la lente de un microscopio con un hisopo de algodón humedecido con agua destilada. 5. El análisis de un examen a. Selección de los marcos Para revisar y analizar los exámenes actuales, la historia clínica correspondiente (s) se debe seleccionar en la ventana de base de datos. La ventana de visualización de imágenes proporciona una visión general de los exámenes de córnea existentes para el paciente seleccionado. Los exámenes realizados en días diferentes se almacenan en las fichas visita independiente. Los tres tipos diferentes de análisis están representados por tres diferentes iconos de la ficha HRT III visita córnea de la ventana de visualización de imágenes de la Heidelberg ojos Explorer. Para estudiar la imagen de la córnea, haga doble clic en el icono de imagen adecuada y el "Show" la función se abre la siguiente ventana: <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig10.jpg" alt="Figura 10" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 10"> Figura 10. Visualización de todas las imágenes capturadas después de un examen. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig11.jpg" alt="Figura 11" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 11"> Figura 11. Visualización de la imagen seleccionada antes de la exportación con vista de la cámara CCD del ojo para mostrar la alineación correcta. Para exportar las imágenes adecuadas para su posterior análisis, haga clic en "Exportar" en la barra de herramientas y luego seleccione la carpeta que desea guardar las imágenes. Se obtiene y la captura de imágenes de todas las capas de la córnea de cada paciente, pero como el foco principal de esta investigación se encuentra en la membrana de Bowman y los nervios de la córnea, sólo las imágenes de esta capa se analizarán. Seleccionamos a 06.05 fotogramas de la capa de Bowman para cada sujeto a diferentes profundidades de la córnea. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig12.jpg" alt="Figura 12" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 12"> Figura 12. Visualización de todas las capas de la córnea de un sujeto sano. En promedio, 6.5 fotogramas de la capa de Bowman en el centro de la córnea a diferentes profundidades son seleccionados al azar para las mediciones y análisis cuantitativos. b. El análisis de imágenes Para el análisis de las imágenes capturadas a partir de la membrana de Bowman de la córnea central con HRT III, que usamos un software especializado que se ha desarrollado dentro de nuestro grupo denominado "Herramientas de análisis de imagen CCM v 0.6". Cuatro parámetros principales de nervios de la córnea se miden con este software: <ul><li> Densidad de las fibras nerviosas (DFN), que se define como el número de los nervios principales / marco. </li><li> Rama del nervio densidad (NBD) el número de ramas principales / marco. </li><li> La longitud de las fibras nerviosas (NFL), que es la longitud total de todos los nervios / marco. </li><li> Tortuosidad de fibra nerviosa (NFT) de los nervios principales / marco. </li></ul> Para abrir la imagen CCM, ir al archivo&gt; abrir. <ul><li> Una vez que se carga la imagen, su tamaño y el tipo se muestra en el cuadro de Información de la imagen en la parte superior izquierda del lado del panel de control. </li><li> La escala predeterminada se muestra en la línea de edición de la Información de la imagen. Si la escala es diferente, modifique el número en la línea de edición. </li><li> Para comenzar a analizar la imagen, seleccionar el parámetro que desea medir el cuadro de métrica en la parte superior del lado derecho del panel de control. </li><li> En el cuadro de resultado en la parte inferior de la página el número de Terranova, NBD se presenta en el número real, de la NFL en mm y la tortuosidad de un coeficiente de tortuosidad (TC). </li><li> Sin embargo, después de exportar los resultados a una hoja de Excel, los resultados serán presentados en no / mm 2 para NFD y NBD y mm / mm 2 para la NFL. </li><li> Para este propósito después de terminar las mediciones, haga clic en Agregar mediciones, y luego ir a Archivo&gt; Guardar como y abra los resultados guardan con Excel. </li></ul><img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig13.jpg" alt="Figura 13" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 13"> Figura 13. Visualización de la imagen del nervio corneal con el rastreo en la herramienta de análisis de uso de "Imagen CCM herramienta de análisis". 6. Los resultados representativos: Hemos demostrado un progresivo aumento en la degeneración del nervio corneal con la mayor gravedad de la neuropatía diabética y un daño a los nervios a principios de la diabetes, que precede a la pérdida de fibras nerviosas intraepidérmica en biopsias de piel 2 junto con la estratificación de la gravedad neuropático y la reparación de Trasplante de páncreas después de 3 en pacientes diabéticos. También hemos demostrado el daño nervioso en la neuropatía idiopática pequeña fibra 4 y 5 la enfermedad de Fabry. <img src="/files/ftp_upload/2194/2194fig14.jpg" alt="Figura 14" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 14"> Figura 14. Córnea imágenes de microscopía confocal con la TRH III de la capa de la córnea de Bowman (a) sujetos de control en comparación con (b) los pacientes con neuropatía y daño nervioso severo.

<ol><li>Abbott, C. A., Kallinikos, P., Marshall, A., Finnigan, J., Morgan, P., Efron, N., Boulton, A. J. M., Malik, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+Confocal+Microscopy%3A+A+Novel+Non-invasive+Test+to+Diagnose+and+Assess+Progression+of+Human+Diabetic+Neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Test to Diagnose and Assess Progression of Human Diabetic Neuropathy.</a> Diabetes Care. 33, 1792-1797 (2010).</li>
<li>Quattrini, C., Tavakoli, M., Jeziorska, M., Kallinikos, P., Tesfaye, S., Marshall, A., Finnigan, J., Boulton, A. J. M., Efron, N., Malik, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surrogate+Markers+of+Small+Fiber+Damage+in+Human+Diabetic+Neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Surrogate Markers of Small Fiber Damage in Human Diabetic Neuropathy.</a> Diabetes. 56, 2148-2154 (2007).</li>
<li>Mehra, S., Tavakoli, M., Efron, N., Boulton, A. J. M., Augustine, T., Malik, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+Confocal+Microscopy+Detects+Early+Nerve+Regeneration+After+Pancreas+Transplantation+in+Patients+with+Type+1+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Corneal Confocal Microscopy Detects Early Nerve Regeneration After Pancreas Transplantation in Patients with Type 1 Diabetes.</a> Diabetes Care. 30, 2608-2612 (2007).</li>
<li>Tavakoli, M., Marshall, A., Pitceathly, R., Fadavi, H., Gow, D., Roberts, M. E., Efron, N., Boulton, A. J. M., Malik, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+confocal+microscopy%3A+A+novel+means+to+detect+nerve+fibre+damage+in+patients+with+impaired+glucose+tolerance+and+idiopathic+small+fibre+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Corneal confocal microscopy: A novel means to detect nerve fibre damage in patients with impaired glucose tolerance and idiopathic small fibre neuropathy.</a> Experimental Neurology. 223, 245-250 (2010).</li>
<li>Tavakoli, M., Marshall, A., Thompson, L., Kenny, M., Waldek, S., Efron, N., Malik, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+confocal+microscopy%3A+A+novel+technique+to+detect+small-fibre+neuropathy+in+patients+with+Fabry+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+%26+Nerve%22%5BJournal%5D)">Corneal confocal microscopy: A novel technique to detect small-fibre neuropathy in patients with Fabry disease.</a> Muscle & Nerve. 40, 976-984 (2009).</li>
</ol>

Las figuras 4 - 6: Cortesía de Heidelberg Engineering

Microscopía confocal la córnea (CCM) es una técnica no invasiva clínico que puede ser utilizado para detectar daños en los nervios principios y cuantificar pequeñas de fibra de patología en las neuropatías periféricas, como la diabetes, la enfermedad de Fabry y la idiopática neuropatías de fibras pequeñas (ISFN). El impacto inmediato clínica de esta técnica representa un enorme salto adelante en términos de nuestra capacidad para diagnosticar, para seguir el progreso y evaluar la respuesta terapéutica en pacientes con n...

<table><tbody><tr><td>Máquina HRT III CCM - El Módulo de Córnea de Rostock</td><td></td><td></td><td>Heidelberg Engineering</td></tr><tr><td>Software de análisis de imágenes CCM v0.6</td><td></td><td></td><td>Universidad de Manchester</td></tr></tbody></table>

microscopía confocal de córnea: a novel una técnica no invasiva para cuantificar pequeñas de fibra de patología en neuropatías periféricas

Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Technique to Quantify Small Fibre Pathology in Peripheral Neuropathies

La cuantificación precisa de la neuropatía periférica es importante para definir a los pacientes de riesgo, anticipar el deterioro, y evaluar nuevas terapias. Los métodos convencionales de evaluar los déficit neurológicos y electrofisiología y pruebas sensoriales cuantitativas cuantifica las alteraciones funcionales para detectar la neuropatía. Sin embargo, los primeros daños parece ser la de las pequeñas fibras y, sin embargo estas pruebas principalmente evaluar la disfunción de fibras grandes y tienen una capacidad limitada para demostrar la regeneración y reparación. Las únicas técnicas que permiten un examen directo del daño de fibras nerviosas amielínicas y reparación biopsia del nervio sural con el microscopio electrónico y la biopsia de la piel-punch. Sin embargo, ambos son procedimientos invasivos y requieren largos procedimientos de laboratorio y una considerable experiencia. La microscopía confocal de córnea es una técnica clínica no invasiva que ofrece imágenes en vivo de las fibras nerviosas corneales. Hemos demostrado el daño nervioso temprano, que precede a la pérdida de fibras nerviosas intraepidérmica en biopsias de piel junto con la estratificación de la gravedad neuropático y el trasplante de páncreas después de la reparación de los pacientes diabéticos. También hemos demostrado el daño nervioso en la neuropatía idiopática pequeña fibra y la enfermedad de Fabry.

La microscopía confocal de córnea es una técnica clínica no invasiva que puede ser utilizado para cuantificar los daños fibras C para diagnosticar y estratificar a los pacientes con mayor gravedad neuropático.

Microscopía Confocal de córnea: A Novel una técnica no invasiva para cuantificar pequeñas de fibra de Patología en neuropatías periféricas

La cuantificación precisa de la neuropatía periférica es importante para definir a los pacientes en riesgo, anticipar el deterioro y evaluar nuevas terapias. ...

Este video demuestra un procedimiento para obtener imágenes de las fibras C corneales utilizando la técnica no invasiva de microscopía confocal corneal o CCM, lo que permite la cuantificación del daño en las fibras nerviosas. Primero, se ajusta el plano focal del lente en el CCM y se aplica gel lagrimal viscoso sobre el lente antes de colocar la cubierta desechable. Luego, se aplican gotas anestésicas y gel lagrimal viscoso en el ojo.A continuación, se ajusta la cámara para establecer el contacto entre el gel en la parte frontal de la lente y la córnea del paciente. Finalmente, se ajusta la profundidad del plano de enfoque y se capturan imágenes de los nervios corneales de la parte central de la capa de Bowman. Pueden observarse cambios morfológicos en las fibras nerviosas corneales para cuantificar la neuropatía.Esta es una técnica muy novedosa que en realidad ya se ha utilizado anteriormente en el campo de la optometría y la oftalmología, pero durante los últimos ocho años aproximadamente, la hemos empleado de manera muy eficaz para estudiar y evaluar la neuropatía diabética y otras neuropatías periféricas. La principal ventaja de esta técnica es que permite cuantificar el daño en las fibras pequeñas en una etapa muy temprana, y luego estratificar la gravedad de la neuropatía en los pacientes de forma completamente no invasiva. Además, podemos hacerlo muy rápidamente mediante un escaneo de dos minutos, que luego puede cuantificarse en términos de severidad de la neuropatía. Por ello, esperamos que este método supere a otras técnicas mucho más invasivas, como la biopsia de piel y la biopsia de nervio. Aunque en conjunto parece una técnica sencilla, en realidad requiere pasos definidos para capturar la imagen de forma óptima y luego cuantificarla.Y realmente queremos hacer que todo ese proceso sea claro y evidente para cualquier otra persona que desee utilizar esta técnica. El primer paso en el examen mediante el microscopio confocal corneal HRT es la preparación de la punta del objetivo en el tubo objetivo de la cámara de barrido láser. Ajuste la refracción a +12 dioptrías, luego coloque la cámara en la posición más baja y fije el objetivo girándolo en sentido antihorario.Aplique una gota grande, homogénea y sin burbujas del tamaño P de visco tears sobre la punta de la lente. Retire una tapa tomo de su recipiente estéril y colóquela sobre la punta de la lente lo más lejos posible sobre el soporte, de modo que el gel forme un menisco entre la lente objetivo y la tapa. Tenga cuidado de no tocar la superficie frontal de la tapa tomo durante la colocación.Ahora, mueva la cámara de escaneo láser todo lo posible hacia atrás en el soporte de la cámara, hasta alcanzar la superficie interna y externa de la tapa del tomo. Ambas aparecen como un reflejo brillante del láser en el monitor de visualización. Ajuste la rueda de ajuste del plano focal hasta observar un reflejo brillante, lo que indica que el objetivo está enfocado dentro de la parte frontal de la tapa.El valor de profundidad que aparece en la pantalla de posición de enfoque ahora debe estar entre menos 150 micrómetros y más 150 micrómetros. Restablezca la configuración de profundidad a cero. Ahora veamos cómo preparar al paciente.Después de anestesiar los ojos del sujeto con una gota de clorhidrato de proparacaína al 0,4 %, lubricar la parte frontal del ojo con lágrimas viscosas. Coloque al sujeto cómodamente con el mentón sobre el reposo para el mentón, asegurándose de que su frente esté presionada firmemente contra la barra frontal. El examen se facilita instruyendo al paciente para que fije la mirada en la luz de fijación externa.Con el ojo que no se está examinando, el tamaño compacto de la cabeza del microscopio garantiza que no se obstruya el ojo contralateral del sujeto, permitiendo el uso de objetivos distantes. Coloque la cámara CCD de manera que su acceso óptico sea perpendicular al acceso óptico de la cámara de escaneo láser.La cámara debe estar en el lado derecho del paciente al obtener imágenes del ojo derecho y viceversa. En esta posición, la superficie frontal de la tomo cápsula se ve en el centro de la cámara CCD. Imagen en vivo.Mueva la cámara de escaneo láser hacia el paciente hasta que la córnea del paciente se encuentre a una distancia de aproximadamente cinco a diez milímetros del tomo cap. Luego, utilice los controles de ajuste vertical y horizontal del soporte de la cámara para mover la cámara de escaneo láser hacia arriba y abajo, y hacia la izquierda y la derecha, hasta que el tomo cap esté posicionado en el centro de la córnea del paciente. Ahora pida al paciente que abra los ojos lo más posible.Mueva lentamente la cámara de escaneo láser hacia el paciente hasta que la tapa tomográfica entre en contacto con la córnea del paciente. En esta etapa, verifique que la luz láser roja esté en el centro de la córnea y que el reflejo del haz láser procedente de la córnea ocurra exactamente en el polo anterior de la córnea. Existe un contacto mínimo entre la lente y la córnea con un ajuste óptimo.Un puente de gel delgado entre la tapa tomográfica y la córnea es visible en la imagen en vivo de la cámara CCD. Si hay demasiada presión entre la tapa tomográfica y la córnea, entonces se observa una apariencia aplanada en la córnea mediante la cámara CCD. La imagen en vivo y el estrayo aparecen en la imagen de microscopía confocal corneal (CCM).Después de ajustar al paciente, encienda la cámara láser HR tres, y aparecerá en la pantalla la ventana de adquisición de imágenes. Utilice la imagen CCD para posicionar el casquete tomográfico y la luz láser sobre la córnea del paciente. El CCM tiene tres opciones para capturar imágenes.El escaneo de secuencia permite adquirir hasta 100 imágenes con una frecuencia de cuadros ajustable. Se selecciona una frecuencia de cuadros entre 30 y un cuadro por segundo. Y en función de esto, se puede adquirir una película con una duración de tres a 100 segundos.En el modo de escaneo volumétrico, la cámara adquiere automáticamente una serie de 40 imágenes en planos focales consecutivos. Se puede escanear una profundidad total de 85 micrómetros, y la distancia focal entre dos imágenes consecutivas es aproximadamente de 2,1 micrómetros. La última opción es el modo de sección, que se utilizará para este experimento.Este modo permite obtener imágenes óptimas con imágenes individuales nítidas adquiridas y almacenadas cada vez que se presiona el interruptor de pedal. Este modo se utiliza para capturar imágenes de toda la capa corneal, incluyendo la capa de Bowman en el centro de la córnea. Después de capturar un número suficiente de imágenes, se pueden utilizar otros modos, incluyendo secuencia y volumen.Después de unos pocos escaneos, se puede cambiar el plano focal de la lente para medir la profundidad de una capa de células corneales con respecto a la superficie corneal, enfocando primero la capa de células epiteliales y luego haciendo clic en el botón de reinicio para establecer el valor de profundidad en cero. Una vez finalizado el examen, apague la cámara haciendo clic en el botón de encendido de la cámara en la ventana de adquisición. Asegúrese de informar al paciente de que no debe frotarse los ojos hasta que la anestesia local haya desaparecido.Retire la tapa del tomógrafo de la cámara, deséchela y luego limpie la lente del microscopio con un hisopo de algodón humedecido con agua destilada. Ahora veamos cómo analizar una imagen y cuantificar los parámetros de las fibras nerviosas para revisar y analizar exámenes existentes. Primero, seleccione el historial del paciente adecuado en la ventana de la base de datos.La ventana de visualización de imágenes proporciona una visión general de los exámenes corneales existentes para el paciente seleccionado. Los exámenes realizados en diferentes días se almacenan en pestañas de visita separadas. Los tres tipos diferentes de escaneo están representados por tres iconos distintos. En la pestaña de visita de córnea HRT tres, de la ventana de visualización de imágenes del Heidelberg Eye Explorer.Para examinar la imagen de la córnea, haga doble clic en el icono de imagen correspondiente y luego presione mostrar ahora para exportar las imágenes adecuadas para un análisis posterior; haga clic en exportar en la barra de herramientas y luego seleccione la carpeta donde desea guardar las imágenes. Dado que el enfoque principal de esta investigación se centra en la capa de Bowman y los nervios corneales, solo se analizarán las imágenes de esta capa. Se seleccionan de cinco a seis cuadros de la capa de Bowman para cada sujeto a diferentes profundidades de la córnea.El análisis de imágenes se realiza con un software especializado desarrollado por nuestro grupo llamado CCM Image Analysis Tools, versión 0.64. Los parámetros principales de los nervios corneales se miden con el software: la densidad de fibras nerviosas, definida como el número de nervios principales por cuadro. La densidad de ramificación nerviosa es el número total de ramas principales por cuadro.La longitud de la fibra nerviosa es la longitud total de los nervios principales y sus ramas principales por cuadro de fibra nerviosa. La tortuosidad es la tortuosidad de los nervios principales por cuadro. Para abrir una imagen de CCM, vaya al archivo y luego seleccione abrir.Una vez que la imagen se carga, su tamaño y tipo se muestran en el cuadro de información de la imagen en la parte superior izquierda del panel de control; la escala predeterminada se muestra en la línea de edición del cuadro de información de la imagen. Si la escala es diferente, modifique el número en la línea de edición. Para comenzar a analizar la imagen, seleccione el parámetro que desea medir desde el cuadro de métricas en la parte superior derecha del panel de control.En el cuadro de resultados en la parte inferior de la página, NFD y MBD se presentan como un número real. NFL se presenta en milímetros y la tortuosidad como un coeficiente de tortuosidad. Los resultados pueden exportarse a una hoja de Excel.Cuando abra la página de Excel, los resultados se presentarán en número por milímetro cuadrado para NFD y MBD, milímetros por milímetro cuadrado para NFL y coeficiente de tortuosidad para NFT. Para realizar estas mediciones, comience marcando cada nervio principal, luego marque cada rama del nervio principal. Finalmente, trace cada nervio dentro del cuadro.Puede utilizarse un bolígrafo digital para obtener una mayor precisión. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en un minuto si se lleva a cabo correctamente al intentar este procedimiento. Es importante seguir detalladamente las instrucciones.Después de ver este video, esperamos que tenga una buena comprensión de cómo trabajar y capturar imágenes de la capa de movimiento de la córnea mediante microscopía confocal corneal, y cómo cuantificar y analizar las imágenes de esta capa en pacientes con neuropatía periférica, en particular neuropatía diabética. Y no olvide que trabajar con CCM requiere experiencia y se ha recomendado que los profesionales capacitados en el examen ocular realicen el procedimiento.

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Con el fin de estudiar los cambios en las fibras nerviosas nociceptivas intraepidérmicos (IENFs) en neuropatías dolorosas (PN), hemos desarrollado protocolos que podrían examinar directamente los cambios morfológicos observados en tres dimensiones en IENFs nociceptivas. El análisis tridimensional de IENFs tiene el potencial para evaluar los cambios morfológicos de IENF en PN.

Imagen tridimensional de nociceptivos Fibras Nerviosas intraepidérmicas en biopsias de piel humana

Se presenta el protocolo para la formación de imágenes longitudinal dinámico y lesión selectiva por láser de las terminaciones nerviosas en ratones transgénicos reportero.

En Vivo De dos fotones microscopía de terminaciones nerviosas individuales en la piel

La unión neuromuscular (NMJ) está alterada en una variedad de condiciones que a veces pueden culminar en una falla sináptica. Este informe describe los métodos basados en microscopios de fluorescencia para cuantificar dichos cambios estructurales.

La unión neuromuscular: Medición Synapse Tamaño, fragmentación y los cambios en la densidad de proteína sináptica Uso confocal microscopía de fluorescencia

Este protocolo utiliza técnicas de análisis y proyección de imagen (3D) tridimensionales para visualizar y cuantificar las mitocondrias del nervio específico. Las técnicas son aplicables a otras situaciones donde una señal fluorescente se utiliza para aislar un subconjunto de los datos de otra señal fluorescente.

Proyección de imagen tridimensional y análisis de las mitocondrias en las fibras de nervio humano Intraepidermal

Describimos el uso de microscopía de coherencia óptica de campo completo como un método para la evaluación de alta calidad del estroma del donante corneal. Este protocolo se puede utilizar para identificar características indicativas de salud o enfermedad, y tiene como objetivo mejorar la detección y selección de tejidos de donantes y, por lo tanto, los resultados de la queratoplastia.

Microscopía de coherencia óptica de campo completo para el análisis histológico de características estromales en injertos corneales

La capacidad de detectar con precisión los componentes de la unión neuromuscular es crucial en la evaluación de modificaciones en su arquitectura debido a procesos patológicos o de desarrollo. Aquí presentamos una descripción completa de un método sencillo para obtener imágenes de alta calidad de uniones neuromusculares de montaje completo que se pueden utilizar para realizar mediciones cuantitativas.

Disección De Fibras Musculares Esqueléticas Individuales Para Análisis Inmunofluorescentes Y Morfométricos De Las Uniones Neuromusculares De Montaje Completo

Este protocolo describe un método para el análisis morfométrico de uniones neuromusculares mediante microscopía combinada confocal y STED que se utiliza para cuantificar cambios patológicos en modelos de ratón de SMA y CMS relacionados con ColQ.

Caracterización de uniones neuromusculares en ratones mediante microscopía combinada confocal y de superresolución

Las pruebas de sensibilidad corneal proporcionan información sobre la salud de los nervios corneales y ayudan a diagnosticar enfermedades de la superficie ocular. Presentamos un protocolo conciso para evaluar cualitativamente la sensibilidad de la córnea que puede ser utilizado fácilmente por los proveedores de atención oftalmológica en entornos clínicos.

Procedimiento de prueba de sensibilidad corneal para pacientes oftalmológicos y optométricos

La capilaroscopia es una herramienta accesible para la visualización directa, económica y no invasiva de la microvasculatura. El objetivo de este protocolo es permitir a los investigadores utilizar la capilaroscopia para la visualización de la morfología microvascular periférica en los lechos ungueales de ratones.

Visualización no invasiva de la morfología microvascular del lecho ungueal en ratones mediante capilaroscopia

Este artículo demuestra el funcionamiento y el efecto de la microscopía confocal in vivo en el diagnóstico y tratamiento del ojo seco e investiga la aplicación y los resultados de la microscopía confocal in vivo para proporcionar una base para futuras investigaciones.

In vivo Microscopía confocal en el diagnóstico y manejo del ojo seco: un enfoque en los protocolos de imagen y la interpretación

Aprenda a utilizar la microscopía confocal de córnea para cuantificar daño en fibras nerviosas de manera no invasiva. Esta técnica permite evaluar cambios morfológicos en nervios corneales y estratificar la severidad de neuropatías periféricas.

Microscopía Confocal de córnea: A Novel una técnica no invasiva para cuantificar pequeñas de fibra de Patología en neuropatías periféricas (Video) | JoVE Journal

Microscopía Confocal de córnea: A Novel una técnica no invasiva para cuantificar pequeñas de fibra de Patología en neuropatías periféricas

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