Microscopía Confocal de córnea: A Novel una técnica no invasiva para cuantificar pequeñas de fibra de Patología en neuropatías periféricas

Este video muestra un procedimiento para obtener imágenes de las fibras C de la córnea utilizando la técnica no invasiva de microscopía confocal corneal o CCM que permite la cuantificación del daño de las fibras nerviosas. En primer lugar, se ajusta el plano focal de la lente en el CCM y se aplica gel lagrimal viscoso a la lente antes de colocar el gorro desechable. A continuación, se aplican gotas anestésicas y gel viscolagrimal en el ojo.

A continuación, se ajusta la cámara para que entre el gel de la parte frontal de la lente y la córnea del paciente. Finalmente, se ajusta la profundidad del plano de enfoque y se capturan imágenes de los nervios corneales de la parte central de la capa de Bowman. Los cambios morfológicos en las fibras nerviosas corneales se pueden observar en la neuropatía cuantificada.

Se trata de una técnica muy novedosa que se ha utilizado anteriormente en el mundo de la optometría y la oftalmología, pero en los últimos ocho años, aproximadamente, la hemos utilizado de forma muy eficaz para estudiar y evaluar la neuropatía diabética y otras neuropatías periféricas. Y la principal ventaja de esta técnica es que permite cuantificar el daño de pequeñas fibras en una etapa muy temprana, y luego estratificar la gravedad de la neuropatía en los pacientes de forma totalmente no invasiva, y podemos hacerlo muy rápidamente con una exploración de dos minutos, que luego se puede cuantificar en términos de gravedad de la neuropatía y, por lo tanto, esperamos que esto reemplace a algunas de las otras técnicas mucho más invasivas, como la piel biopsia y biopsia de nervio. Si bien en general parece una técnica simple, en realidad, requiere pasos definidos mediante los cuales se captura la imagen de manera óptima y luego se cuantifica la imagen.

Y realmente queremos hacer que todo ese proceso sea claro y evidente para cualquier otra persona que desee usar esta técnica. El paso inicial en el examen con el microscopio confocal corneal HRT es la preparación de la punta de la lente del objetivo en el tubo del objetivo de la cámara de escaneo láser. Establezca la refracción en más 12 dioptrías y, a continuación, ajuste la cámara a la posición más baja y bloquee el objetivo girándolo en sentido contrario a las agujas del reloj.

Aplique una gota grande y homogénea de lágrimas de visco de tamaño P sin burbujas en la punta de la lente. Retire una tapa de tomo de su recipiente estéril y móntela sobre la punta de la lente lo más lejos posible sobre el soporte, de modo que el gel forme un menisco entre la lente del objetivo y la tapa. Tenga cuidado de no tocar la superficie frontal de la tapa del tomo durante el montaje.

Ahora, mueva la cámara de escaneo láser lo más atrás posible en el soporte de la cámara, la superficie interior y exterior de la tapa del tomo. Ambos aparecen como un reflejo láser brillante en la pantalla. Ajuste la rueda de ajuste del plano focal hasta que se observe un reflejo brillante, lo que indica que la lente está enfocada dentro de la parte delantera de la tapa.

El valor de profundidad que se muestra en la pantalla de posición de enfoque ahora debe estar entre menos 150 micrómetros y más 150 micrómetros. Restablezca el ajuste de profundidad a cero. Ahora veamos cómo preparar al paciente.

Después de anestesiar los ojos del sujeto con la gota de clorhidrato al 0,4%, lubrique la parte frontal del ojo con lágrimas visco. Observe al sujeto cómodamente con la barbilla en la mentonera, asegurándose de que su frente esté firmemente presionada contra la barra de la frente. El examen se facilita al indicar al paciente que se fije en la luz de fijación externa.

Al no examinarse el ojo, el tamaño compacto del cabezal del microscopio garantiza que el ojo contralateral del sujeto no quede oscurecido. Permitir el uso de objetivos de distancia. Coloque la cámara CCD de manera que su acceso óptico sea perpendicular al acceso óptico de la cámara de escaneo láser.

La cámara debe estar en el lado derecho del paciente cuando se toman imágenes del ojo derecho y viceversa. En esta posición, la superficie frontal de la tapa del tomo se ve en el centro de la cámara CCD. Imagen en vivo.

Mueva la cámara de escaneo láser hacia el paciente hasta que la córnea del paciente esté a una distancia de aproximadamente cinco a 10 milímetros del tomo capuchón. A continuación, utilice los mandos de ajuste de acceso vertical y horizontal del soporte de la cámara para mover la cámara de escaneo láser hacia arriba y hacia abajo y hacia la izquierda y hacia la derecha hasta que el tapón tomo se coloque en el centro de la córnea del paciente. Ahora pídale al paciente que abra los ojos lo más posible.

Mueva lentamente la cámara de escaneo láser hacia el paciente hasta que el capuchón del tomo entre en contacto con la córnea del paciente. En esta etapa, verifique que la luz láser roja esté en el centro de la córnea y que la reflexión del rayo láser de la córnea ocurra exactamente en el polo anterior de la córnea. El contacto entre el cristalino y la córnea es mínimo y se ajusta de forma óptima.

Un delgado puente de gel entre el tomo y la córnea es visible en la imagen en vivo de la cámara CCD. Si hay demasiada presión entre el tomo y la córnea, se produce una apariencia aplanada en la córnea a través de la cámara CCD. La imagen en vivo y el strayer aparecen en la imagen CCM.

Después de ajustar el giro del paciente en la cámara láser HR tres, aparecerá la ventana de adquisición de imágenes en la pantalla. Utilice la imagen CCD para colocar el tomo cap y la luz láser en la córnea del paciente. El CCM tiene tres opciones para capturar imágenes.

El escaneo de secuencia permite adquirir hasta 100 imágenes con una velocidad de fotogramas ajustable. Se selecciona una velocidad de fotogramas entre 30 y un fotograma por segundo. Y en base a esto, se puede adquirir una película con una duración de tres a 100 segundos.

En el modo de escaneo de volumen, la cámara adquiere automáticamente una serie de 40 imágenes en planos focales consecutivos. Se puede escanear una profundidad total de 85 micrómetros y la distancia focal entre dos imágenes consecutivas es de aproximadamente 2,1 micrómetros. La última opción es el modo de sección, que se utilizará para este experimento.

Este modo permite obtener imágenes óptimas con imágenes individuales claras adquiridas y almacenadas cada vez que se presiona el interruptor de pie. Este modo se utiliza para capturar imágenes de toda la capa corneal, incluida la capa de Bowman en el centro de la córnea. Después de capturar un número suficiente de imágenes, se pueden utilizar otros modos, como la secuencia y el volumen.

Después de algunos escaneos, el plano focal de la lente se puede cambiar para medir la profundidad de una capa de células corneales en relación con la superficie de la córnea enfocando la capa de células epiteliales y luego haciendo clic en el botón de reinicio para establecer el valor de profundidad en cero. Una vez finalizado el examen, apague la cámara haciendo clic en el botón de encendido de la cámara en la ventana de adquisición. Haga que el paciente sea consciente de que no debe frotarse los ojos hasta que haya pasado el efecto de la anestesia local.

Retire la tapa del tomo de la cámara, deséchela y, a continuación, limpie la lente del microscopio con un bastoncillo de algodón humedecido con agua destilada. Ahora veamos cómo analizar una imagen y cuantificar los parámetros de las fibras nerviosas para revisar y analizar los exámenes existentes. En primer lugar, seleccione el registro del paciente adecuado en la ventana de la base de datos.

La ventana de visualización de imágenes proporciona una visión general de los exámenes de córnea existentes para el paciente seleccionado. Los exámenes realizados en diferentes días se almacenan en pestañas de visita separadas. Los tres tipos de escaneo diferentes están representados por tres iconos diferentes. En la pestaña de visita de tres córneas HRT de la ventana de visualización de imágenes del Heidelberg Eye Explorer.

Para examinar la imagen de la córnea, haga doble clic en el icono de la imagen correspondiente y, a continuación, pulse Mostrar ahora para exportar las imágenes adecuadas para su posterior análisis, haga clic en exportar en la barra de herramientas y, a continuación, seleccione la carpeta en la que desea guardar las imágenes. Debido a que el enfoque principal de esta investigación está en la capa de Bowman y los nervios corneales, solo se analizarán las imágenes de esta capa. Se seleccionan cinco o seis fotogramas de la capa de Bowman para cada sujeto a diferentes profundidades de la córnea.

El análisis de imágenes se realiza con un software especializado desarrollado por nuestro grupo llamado CCM Image Analysis Tools, versión 0.64. Los parámetros principales de los nervios corneales se miden con el software Nerve Fiber Density, que se define como el número de nervios principales por fotograma. La densidad de las ramas nerviosas es el número total de ramas principales por fotograma.

La longitud de la fibra nerviosa es la longitud total de los nervios principales y las ramas principales por fibra nerviosa del cuadro. La tortuosidad es la tortuosidad de los nervios principales por fotograma. Para abrir una imagen CCM, vaya al archivo y, a continuación, ábralo.

Una vez que se carga la imagen, su tamaño y tipo se muestran en el cuadro de información de la imagen en la parte superior izquierda del panel de control, la escala predeterminada se muestra en la línea de edición de la información de la imagen. Si la escala es diferente, modifique el número en la línea de edición. Para comenzar a analizar la imagen, seleccione el parámetro que desea medir en el cuadro métrico en la parte superior derecha del panel de control.

En el cuadro de resultados en la parte inferior de la página, NFD y MBD se presentan como un número real. La NFL se presenta en milímetros y la tortuosidad como un coeficiente de tortuosidad. Los resultados se pueden exportar a una hoja de Excel.

Al abrir la página de Excel, los resultados se presentarán en número por milímetro cuadrado para NFD y MBD, milímetros por milímetro cuadrado para NFL y coeficiente de tortuosidad para NFT. Para realizar estas mediciones, comience marcando cada nervio principal, luego marque cada rama del nervio principal. Por último, traza cada nervio del encuadre.

Se puede utilizar un bolígrafo digital para una mayor precisión. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en un minuto si se realiza correctamente mientras se intenta este procedimiento. Es importante seguir las instrucciones detalladas.

Después de ver este vídeo, esperamos que tenga una buena comprensión de cómo trabajar y capturar imágenes de la capa de movimiento de la córnea con microscopía confocal corneal, y cuantificar y analizar las imágenes de esta capa en pacientes con neuropatía periférica, en particular neuropatía diabética. Y no olvide que trabajar con CCM requiere experiencia y se ha aconsejado que los profesionales capacitados en el examen ocular deben realizar el procedimiento.