Microscopía Confocal de córnea: A Novel una técnica no invasiva para cuantificar pequeñas de fibra de Patología en neuropatías periféricas

Este video demuestra un procedimiento para obtener imágenes de las fibras C corneales utilizando la técnica no invasiva de microscopía confocal corneal o CCM, lo que permite la cuantificación del daño en las fibras nerviosas. Primero, se ajusta el plano focal del lente en el CCM y se aplica gel lagrimal viscoso sobre el lente antes de colocar la cubierta desechable. Luego, se aplican gotas anestésicas y gel lagrimal viscoso en el ojo.

A continuación, se ajusta la cámara para establecer el contacto entre el gel en la parte frontal de la lente y la córnea del paciente. Finalmente, se ajusta la profundidad del plano de enfoque y se capturan imágenes de los nervios corneales de la parte central de la capa de Bowman. Pueden observarse cambios morfológicos en las fibras nerviosas corneales para cuantificar la neuropatía.

Esta es una técnica muy novedosa que en realidad ya se ha utilizado anteriormente en el campo de la optometría y la oftalmología, pero durante los últimos ocho años aproximadamente, la hemos empleado de manera muy eficaz para estudiar y evaluar la neuropatía diabética y otras neuropatías periféricas. La principal ventaja de esta técnica es que permite cuantificar el daño en las fibras pequeñas en una etapa muy temprana, y luego estratificar la gravedad de la neuropatía en los pacientes de forma completamente no invasiva. Además, podemos hacerlo muy rápidamente mediante un escaneo de dos minutos, que luego puede cuantificarse en términos de severidad de la neuropatía. Por ello, esperamos que este método supere a otras técnicas mucho más invasivas, como la biopsia de piel y la biopsia de nervio. Aunque en conjunto parece una técnica sencilla, en realidad requiere pasos definidos para capturar la imagen de forma óptima y luego cuantificarla.

Y realmente queremos hacer que todo ese proceso sea claro y evidente para cualquier otra persona que desee utilizar esta técnica. El primer paso en el examen mediante el microscopio confocal corneal HRT es la preparación de la punta del objetivo en el tubo objetivo de la cámara de barrido láser. Ajuste la refracción a +12 dioptrías, luego coloque la cámara en la posición más baja y fije el objetivo girándolo en sentido antihorario.

Aplique una gota grande, homogénea y sin burbujas del tamaño P de visco tears sobre la punta de la lente. Retire una tapa tomo de su recipiente estéril y colóquela sobre la punta de la lente lo más lejos posible sobre el soporte, de modo que el gel forme un menisco entre la lente objetivo y la tapa. Tenga cuidado de no tocar la superficie frontal de la tapa tomo durante la colocación.

Ahora, mueva la cámara de escaneo láser todo lo posible hacia atrás en el soporte de la cámara, hasta alcanzar la superficie interna y externa de la tapa del tomo. Ambas aparecen como un reflejo brillante del láser en el monitor de visualización. Ajuste la rueda de ajuste del plano focal hasta observar un reflejo brillante, lo que indica que el objetivo está enfocado dentro de la parte frontal de la tapa.

El valor de profundidad que aparece en la pantalla de posición de enfoque ahora debe estar entre menos 150 micrómetros y más 150 micrómetros. Restablezca la configuración de profundidad a cero. Ahora veamos cómo preparar al paciente.

Después de anestesiar los ojos del sujeto con una gota de clorhidrato de proparacaína al 0,4 %, lubricar la parte frontal del ojo con lágrimas viscosas. Coloque al sujeto cómodamente con el mentón sobre el reposo para el mentón, asegurándose de que su frente esté presionada firmemente contra la barra frontal. El examen se facilita instruyendo al paciente para que fije la mirada en la luz de fijación externa.

Con el ojo que no se está examinando, el tamaño compacto de la cabeza del microscopio garantiza que no se obstruya el ojo contralateral del sujeto, permitiendo el uso de objetivos distantes. Coloque la cámara CCD de manera que su acceso óptico sea perpendicular al acceso óptico de la cámara de escaneo láser.

La cámara debe estar en el lado derecho del paciente al obtener imágenes del ojo derecho y viceversa. En esta posición, la superficie frontal de la tomo cápsula se ve en el centro de la cámara CCD. Imagen en vivo.

Mueva la cámara de escaneo láser hacia el paciente hasta que la córnea del paciente se encuentre a una distancia de aproximadamente cinco a diez milímetros del tomo cap. Luego, utilice los controles de ajuste vertical y horizontal del soporte de la cámara para mover la cámara de escaneo láser hacia arriba y abajo, y hacia la izquierda y la derecha, hasta que el tomo cap esté posicionado en el centro de la córnea del paciente. Ahora pida al paciente que abra los ojos lo más posible.

Mueva lentamente la cámara de escaneo láser hacia el paciente hasta que la tapa tomográfica entre en contacto con la córnea del paciente. En esta etapa, verifique que la luz láser roja esté en el centro de la córnea y que el reflejo del haz láser procedente de la córnea ocurra exactamente en el polo anterior de la córnea. Existe un contacto mínimo entre la lente y la córnea con un ajuste óptimo.

Un puente de gel delgado entre la tapa tomográfica y la córnea es visible en la imagen en vivo de la cámara CCD. Si hay demasiada presión entre la tapa tomográfica y la córnea, entonces se observa una apariencia aplanada en la córnea mediante la cámara CCD. La imagen en vivo y el estrayo aparecen en la imagen de microscopía confocal corneal (CCM).

Después de ajustar al paciente, encienda la cámara láser HR tres, y aparecerá en la pantalla la ventana de adquisición de imágenes. Utilice la imagen CCD para posicionar el casquete tomográfico y la luz láser sobre la córnea del paciente. El CCM tiene tres opciones para capturar imágenes.

El escaneo de secuencia permite adquirir hasta 100 imágenes con una frecuencia de cuadros ajustable. Se selecciona una frecuencia de cuadros entre 30 y un cuadro por segundo. Y en función de esto, se puede adquirir una película con una duración de tres a 100 segundos.

En el modo de escaneo volumétrico, la cámara adquiere automáticamente una serie de 40 imágenes en planos focales consecutivos. Se puede escanear una profundidad total de 85 micrómetros, y la distancia focal entre dos imágenes consecutivas es aproximadamente de 2,1 micrómetros. La última opción es el modo de sección, que se utilizará para este experimento.

Este modo permite obtener imágenes óptimas con imágenes individuales nítidas adquiridas y almacenadas cada vez que se presiona el interruptor de pedal. Este modo se utiliza para capturar imágenes de toda la capa corneal, incluyendo la capa de Bowman en el centro de la córnea. Después de capturar un número suficiente de imágenes, se pueden utilizar otros modos, incluyendo secuencia y volumen.

Después de unos pocos escaneos, se puede cambiar el plano focal de la lente para medir la profundidad de una capa de células corneales con respecto a la superficie corneal, enfocando primero la capa de células epiteliales y luego haciendo clic en el botón de reinicio para establecer el valor de profundidad en cero. Una vez finalizado el examen, apague la cámara haciendo clic en el botón de encendido de la cámara en la ventana de adquisición. Asegúrese de informar al paciente de que no debe frotarse los ojos hasta que la anestesia local haya desaparecido.

Retire la tapa del tomógrafo de la cámara, deséchela y luego limpie la lente del microscopio con un hisopo de algodón humedecido con agua destilada. Ahora veamos cómo analizar una imagen y cuantificar los parámetros de las fibras nerviosas para revisar y analizar exámenes existentes. Primero, seleccione el historial del paciente adecuado en la ventana de la base de datos.

La ventana de visualización de imágenes proporciona una visión general de los exámenes corneales existentes para el paciente seleccionado. Los exámenes realizados en diferentes días se almacenan en pestañas de visita separadas. Los tres tipos diferentes de escaneo están representados por tres iconos distintos. En la pestaña de visita de córnea HRT tres, de la ventana de visualización de imágenes del Heidelberg Eye Explorer.

Para examinar la imagen de la córnea, haga doble clic en el icono de imagen correspondiente y luego presione mostrar ahora para exportar las imágenes adecuadas para un análisis posterior; haga clic en exportar en la barra de herramientas y luego seleccione la carpeta donde desea guardar las imágenes. Dado que el enfoque principal de esta investigación se centra en la capa de Bowman y los nervios corneales, solo se analizarán las imágenes de esta capa. Se seleccionan de cinco a seis cuadros de la capa de Bowman para cada sujeto a diferentes profundidades de la córnea.

El análisis de imágenes se realiza con un software especializado desarrollado por nuestro grupo llamado CCM Image Analysis Tools, versión 0.64. Los parámetros principales de los nervios corneales se miden con el software: la densidad de fibras nerviosas, definida como el número de nervios principales por cuadro. La densidad de ramificación nerviosa es el número total de ramas principales por cuadro.

La longitud de la fibra nerviosa es la longitud total de los nervios principales y sus ramas principales por cuadro de fibra nerviosa. La tortuosidad es la tortuosidad de los nervios principales por cuadro. Para abrir una imagen de CCM, vaya al archivo y luego seleccione abrir.

Una vez que la imagen se carga, su tamaño y tipo se muestran en el cuadro de información de la imagen en la parte superior izquierda del panel de control; la escala predeterminada se muestra en la línea de edición del cuadro de información de la imagen. Si la escala es diferente, modifique el número en la línea de edición. Para comenzar a analizar la imagen, seleccione el parámetro que desea medir desde el cuadro de métricas en la parte superior derecha del panel de control.

En el cuadro de resultados en la parte inferior de la página, NFD y MBD se presentan como un número real. NFL se presenta en milímetros y la tortuosidad como un coeficiente de tortuosidad. Los resultados pueden exportarse a una hoja de Excel.

Cuando abra la página de Excel, los resultados se presentarán en número por milímetro cuadrado para NFD y MBD, milímetros por milímetro cuadrado para NFL y coeficiente de tortuosidad para NFT. Para realizar estas mediciones, comience marcando cada nervio principal, luego marque cada rama del nervio principal. Finalmente, trace cada nervio dentro del cuadro.

Puede utilizarse un bolígrafo digital para obtener una mayor precisión. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en un minuto si se lleva a cabo correctamente al intentar este procedimiento. Es importante seguir detalladamente las instrucciones.

Después de ver este video, esperamos que tenga una buena comprensión de cómo trabajar y capturar imágenes de la capa de movimiento de la córnea mediante microscopía confocal corneal, y cómo cuantificar y analizar las imágenes de esta capa en pacientes con neuropatía periférica, en particular neuropatía diabética. Y no olvide que trabajar con CCM requiere experiencia y se ha recomendado que los profesionales capacitados en el examen ocular realicen el procedimiento.