Crecimiento y diferenciación de las células del hipocampo adulto ardilla de tierra del Ártico troncales nerviosas

El objetivo general de este procedimiento es sembrar, expandir y diferenciar células madre neurales que se prepararon a partir del hipocampo de ardillas terrestres árticas adultas de un año no hibernantes. Esto se logra sembrando primero las células madre neurales A GS. A continuación, expanda y siembre las células madre neurales en un medio de diferenciación.

El tercer paso del procedimiento es diferenciar y mantener las neuronas, y finalmente, las células se fijan o tratan y fijan para su análisis. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran que los progenitores neuronales de GS continúan dividiéndose a lo largo de dos semanas de diferenciación, mantenimiento e incluso en condiciones isquémicas. El número de neuronas se determina mediante técnicas de tinción y microscopía fluorescente que miden las proporciones de las neuronas.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el descubrimiento de terapias para el accidente cerebrovascular y el paro cardíaco. Dado que la ardilla terrestre ártica, las neuronas diferenciadas son tolerantes a todas las agresiones isquémicas Antes de comenzar este procedimiento, prepare el matraz que se utilizará en la expansión A-G-S-N-S-C recubriéndolos con poliol ornitina. Siga la solución de trabajo de Polyol Ornithine dejándola en la incubadora.

Una vez descongelada, la solución podría almacenarse hasta un mes a una temperatura de dos a ocho grados centígrados. Añada ocho mililitros de solución de trabajo de poliol ornitina a un matraz T 75 ventilado y distribuya uniformemente la solución por toda la superficie de cultivo del matraz. Incubar el matraz a 37 grados centígrados durante un mínimo de 24 horas, preferiblemente en una incubadora sin CO2 añadido antes de su uso.

Aspirar la solución de trabajo de poliol ornitina del matraz y lavar dos veces con cultivo de tejido estéril. Aspire el líquido hasta que el matraz esté casi seco antes de usarlo para descongelar y sembrar células madre neurales de ardilla terrestre ártica. Primero, retire un vial de A-G-S-N-S-C del hacedor de nitrógeno líquido y verifique que la tapa del vial esté bien sellada.

Sostenga la parte superior del vial mientras deja su mitad inferior en un baño de agua a 37 grados centígrados durante aproximadamente 60 a 90 segundos. Mantenga la tapa del vial fuera del agua para evitar una posible contaminación. Retire el vial del baño de agua cuando esté casi completamente descongelado.

Todavía debe verse una pequeña cantidad de hielo. No descongele en exceso, ya que puede dañar las células. Rocíe el exterior del vial con etanol al 70% o isopropanol y luego lleve el vial a un gabinete de seguridad biológica.

Retire la tapa con cuidado para evitar contaminación o salpicaduras. Con una pipeta estéril. Agregue un mililitro de medio basal en el vial y resus.

Suspende las celdas. Transfiera las celdas resuspendidas a 25 mililitros de medio basal tibio en un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugar las células a 150 g durante seis minutos mientras las células giran hacia abajo.

Agregue 10 mililitros de medio de expansión al matraz T 75 recubierto de poli L ornitina seco y luego agregue 40 microlitros de Rh FGF básico cuando se complete la centrifugación. Aspire el sate y el líquido con cuidado sin aspirar el pellet. Resus. Suspenda las células en 10 mililitros de medio de expansión.

Transfiera las células resuspendidas al medio en el matraz T 75. Mueva suavemente el matraz de lado a lado para distribuir uniformemente las células dentro del recipiente. Coloque el matraz sembrado en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados.

Las células deben adherirse al matraz y comenzar a formar procesos dentro de las dos horas posteriores a la siembra el día siguiente a la inoculación. Enriquezca el matraz de A-G-S-N-S-C con 40 microlitros de Rh FGF basic. Dos días después de la descongelación y siembra de las células, realice un reemplazo completo del medio utilizando 20 mililitros de medio de expansión más un pico de 40 microlitros de RH FGF básico al tercer o cuarto día después de la inoculación.

Se debe pasar el A-G-S-N-S-C, aspirar el medio para el matraz T 75 y agregar 2,5 mililitros de tripsina, agitar EDTA suavemente para asegurarse de que todas las celdas estén recubiertas con la tripsina. EDTA y golpea suavemente el recipiente de cultivo desde varios lados para fomentar el desprendimiento. Una vez que las células se hayan desprendido, agregue 10 mililitros de medio basal al matraz, agite suavemente para asegurarse de que toda la solución de tripsina se neutralice.

Pipetear las células en un tubo de centrífuga estéril que contenga 10 mililitros de medio basal. A continuación, lavar el matraz con 10 mililitros adicionales de medio basal y combinarlo con el primer lavado, centrifugar las células a 150 G durante seis minutos. Después de la centrifugación, las células deben formar un pellet limpio y suelto, aspirar la S natina del tubo de centrífuga.

Luego, con una pipeta de 10 mililitros, agregue 10 mililitros de medio basal precalentado y resus. Suspenda el pellet de celda pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo dos veces. Si se sigue de cerca este método, se puede esperar un rendimiento de tres o más duplicaciones dando una población de más de 4 millones de células a partir de un número inicial de aproximadamente 500.000, demostraremos la inoculación de A-G-S-N-S-C en una placa de 96 pocillos recubierta de poli L lisina para la diferenciación, aunque se puede utilizar cualquier formato de pocillos múltiples para este procedimiento.

En primer lugar, determine el volumen de suspensión celular necesario para su experimento y la cantidad de FBS que se añadirá al medio de diferenciación A-G-S-N-S-C para lograr una concentración final del 2% de FBS. Un ejemplo de estos cálculos se muestra en el texto del protocolo a continuación en un gabinete de bioseguridad. Mezcle el FBS y el medio de diferenciación.

A continuación, mezcle cuidadosamente las células con un volumen calculado de medio de diferenciación con FBS y transfiera las células del medio a un depósito estéril de punta combinada. Usando una pipeta multicanal y puntas de orificio grandes, dispense 200 microlitros de suspensión celular diluida desde el depósito a cada pocillo en la placa de 96 pocillos recubierta de lisina poli L e incube la placa durante una hora y media a dos horas a 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono para permitir que las células se adhieran. El medio.

El cambio puede ser una parte desafiante de esta técnica porque puede lesionar las células con puntas de pipeta de tamaño regular. Por lo tanto, utilizamos puntas de pipeta de orificio grande para no dañar las células durante el medio. Cambio: Cuando las celdas se hayan unido, retire con cuidado el 50%, que es 100 microlitros en este caso del medio, de cada pocillo, utilizando puntas de pipeta de orificio grande.

Reemplace con cuidado el volumen eliminado con medio de diferenciación tibio. De nuevo, utilizando puntas de pipeta de orificio grande. Incubar la placa a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono dos días después de la inoculación.

Realice un cambio de medio del 50% utilizando puntas de pipeta de diferenciación, orificio mediano y grande. El medio de mantenimiento neuronal para el mantenimiento de las neuronas debe prepararse semanalmente siguiendo las instrucciones del fabricante. Dos días después de la última diferenciación.

Cambio medio. Realizar una sustitución del medio al 50% mediante mantenimiento neuronal. Medio Retire con cuidado 100 microlitros del medio de diferenciación de cada pocillo utilizando puntas de pipeta de orificio grande y reemplácelo con 100 microlitros de medio de mantenimiento neuronal.

Continúe realizando reemplazos de medio al 50% utilizando medio de mantenimiento neuronal cada dos o tres días. Los procesos neuronales deben aparecer a los pocos días de cambiar al medio de mantenimiento neuronal. La célula debe ser utilizada dentro de las tres semanas posteriores a su transferencia para el mantenimiento neuronal.

Ardilla terrestre ártica mediana. Las células madre neurales adultas continuarán duplicándose cada 24 horas durante tres a cinco días durante al menos dos pasos cuando se coloquen en 500.000 a 600.000 células por matraz de 75 centímetros cuadrados. Esta fotomicrografía de 100 x muestra una GS adulta de células madre neuromadre del hipocampo después de tres días de crecimiento en A-G-S-N-S-C.

Se eliminan los medios basales en matraces recubiertos de poliol ornitina como FBS y RH FGF básico. Las células madre neuro A GS se diferenciarán en aproximadamente la mitad de neuronas y la mitad de astrocitos. Las neuronas serán T tuj una positivas dentro de 14 a 21 días, como lo ilustra esta micrografía fluorescente.

Aquí, las células se fijaron con un 4% de paraforma, aldehído y las neuronas identificadas por verde. Usando el anticuerpo primario TJ uno y el anticuerpo secundario LOR 5 68, todos los núcleos se tiñeron de azul mediante la adición de ganchos. La proporción de neuronas con respecto al total de células oscilará entre el 40 y el 60%, dependiendo de la edad del cultivo.

Este gráfico muestra el número de neuronas y las proporciones de neuronas que han diferenciado una neuro célula GS a los 16, 19 y 21 días después de la inoculación. Para la diferenciación, las neuronas se pueden utilizar para la experimentación desde 12 días después de la colocación hasta al menos 21 días después de la instalación. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar las neuronas de ardilla terrestre ártica para su uso en experimentos de isquemia.