Evaluación de la distribución espacial de la radiación ionizante γH2AX siguientes

Hola, soy Raja Ti, realizando mi doctorado en el Instituto Baker IDI de Enfermedades Cardíacas y Diabetes. Les mostraré los pasos involucrados en la ilustración 3D de la modificación de Eastern que marca el daño en el ADN y la condensación cromática en una nueva célula cardíaca. El ADN está enrollado alrededor de zonas nucleares.

Cada nucleosoma está compuesto por cuatro tipos diferentes de histonas: H2A, H2B, H3 y H4. La formación de roturas en el ADN se marca mediante la fosforilación de H2AX. Esta fosforilación de H2AX ocurre principalmente en regiones activas marcadas por la metilación de H3K4. Ahora observaremos la ilustración tridimensional de las modificaciones en la célula inmunoetiquetada con la capa de fosforilación de H2AX y la H3K4 metilada.

Comencemos. Iniciamos colocando el curso E de la suspensión celular en tubos cónicos de 15 ml. Los tubos S se lavan dos veces con PB centrífugos a 150 G y resuspensión.

Suspender en medio fresco para observar el efecto inmediato de la radiación sobre los eventos celulares. Mantener las células bajo observación durante cinco a diez minutos antes y durante la radiación. Exponer las células a radiación gamma o rayos X. Después de la radiación, dispensar tres mililitros de la suspensión celular en cada GU de seis.

Placa de pocillos para el pico de gamma H2AX: incubar las células entre 30 minutos y una hora a 37 grados centígrados. Utilizamos la misión Cytosine para colocar las células no adherentes sobre portaobjetos de vidrio. Al ensamblar la pinza Cytosine, asegúrese de que todo el cordón del filtro coincida con el embudo.

Dispense un volumen de 50 microlitros, frote esta suspensión celular en cada posición final de citosina, coloque las pinzas de citosina en la misión de citosina y centrifugue a 500 RPM durante cinco minutos. Retire las pinzas de citosina y separe los portaobjetos de la tarjeta de filtro. No permita que las células sequen al aire durante demasiado tiempo, ya que podría afectar el fondo en la tinción con fluoresceína.

Utilizando un pincel con punta líquida, se dibujan círculos alrededor de cada extendido; luego, se fijan las células con paraformaldehído al 4 % a temperatura ambiente durante cinco minutos. En comparación con etanol u otros métodos, se observó una mejor fijación con paraformaldehído al 4 %. A continuación, se permeabilizan las células en las laminillas con Tritón X-100 en tampón fosfato salino (PBS) a temperatura ambiente durante cinco minutos.

En comparación con el twin 80, observamos una señal mejor en las células tratadas con Triton X-100. Observe las células con PP S3 tres veces durante cinco minutos cada vez. Bloquee las células con BSA durante 10 minutos a temperatura ambiente y repita este procedimiento tres veces, en comparación con otros agentes y tiempos de bloqueo.

La BSA fue la más eficiente para minimizar la unión no específica de los anticuerpos primarios; hemos utilizado dos anticuerpos primarios diluidos uno en 500 con BSA al 1%, aproximadamente 50 microlitros de anticuerpo primario por cada portaobjetos. La incubación del anticuerpo primario a temperatura ambiente durante 60 minutos reduce la tinción de fondo en comparación con la incubación nocturna a cuatro grados centígrados. Lave las células tres veces con PBS durante cinco minutos cada vez.

Alexa floor 4 88, buena actividad anti ratón y Alexa floor 5 46 actividad anti conejo. Se utilizaron anticuerpos secundarios para detectar diferentes marcadores simultáneamente. Utilice anticuerpos producidos en diferentes especies.

Añada aproximadamente 50 microlitros de anticuerpo secundario diluido a cada portaobjetos. Incube las células a temperatura ambiente durante 90 minutos. Se recomienda incubar las células en una cámara húmeda, ya que evitará que las células y el anticuerpo se sequen. Lave los portaobjetos con PBS tres veces, cada una durante cinco minutos.

Se agregaron 50 microlitros de una dilución 1:500 de topo tres en PBS a cada portaobjetos. Lave los portaobjetos con PBS tres veces, cada una durante cinco minutos. Elimine la humedad excesiva de los portaobjetos y agregue la solución Antifa.

Se recomienda no secar completamente las células antes de añadir la solución Antifa. Coloque una laminilla sobre el portaobjetos. Debe tenerse cuidado para evitar la formación de burbujas de aire.

Deje las laminillas durante la noche en una cámara húmeda oscura. Selle la laminilla con esmalte de uñas para evitar el secado de las células. Las imágenes adquiridas en un microscopio confocal revelan.

Se perdió una mejor resolución espacial y se utilizaron láseres de helio para la adquisición de imágenes. Se prefirieron dos objetivos de inmersión en aceite de 63 para emisiones en lugar de objetivos de mayor o menor aumento. Un factor de zoom de tres o cuatro producirá una imagen con mejor resolución.

Para la contabilidad de FO a partir de muchas células, es preferible utilizar una velocidad de escaneo de ocho y un tamaño de imagen de 1024 por 1024 píxeles. Al obtener imágenes de múltiples canales, se recomienda una adquisición por escaneo secuencial de líneas en comparación con el escaneo de cuadros. Para evitar el blanqueo de la muestra, se ajustan la ganancia del detector y el desplazamiento del amplificador con el fin de reducir el ruido y la saturación de la señal.

Dado que el tamaño de Kama HX X cuatro puede ser inferior a 0,5 micrómetros, se recomienda adquirir imágenes con un tamaño de paso de al menos 0,5 micrómetros. Se requieren imágenes con pasos a lo largo del eje del chorro en un patrón de serie de chorros utilizando el patrón de marcar primero y marcar pérdida. Para ilustrar la relación espacial entre diferentes proteínas, se recomienda usar una velocidad de escaneo de seis con un tamaño de imagen de 2048 y 2 48 píxeles utilizando metamor primero.

El segundo puede contarse a partir de imágenes adquiridas en diversos microscopios confocales. Abra las etiquetas de imagen gamma hgx directamente desde el menú de archivo o utilizando números de factura. Etiquetas. Vaya al menú Procesar y seleccione Aritmética de pilas.

Seleccione la proyección máxima y elija los planos que se incluirán. Haga clic en aceptar. Ahora seleccione top hat y elija la imagen Gamma H2X como imagen fuente para aplicar.

El filtro de sombrero de copa y la imagen resultante serán una imagen binaria con menos ruido y una variación reducida en la intensidad de los focos. Vaya a regiones y seleccione la herramienta de dibujo de regiones, luego dibuje regiones alrededor de los núcleos. Vaya al menú procesar y seleccione la imagen umbral.

Elige el umbral de inclusión y establece los valores de umbral inferior y superior. Por lo general, son los valores de umbral los que afectan el número cuatro. El valor de umbral óptimo es aquel que minimiza la inclusión del fondo y maximiza la inclusión de la incursión.

Esto puede lograrse mejor contando el número de salidas utilizando diferentes valores de umbral. Luego compare el número de salidas con el conteo a simple vista. Seleccione la imagen DPI y vaya al menú de regiones y elija la opción de transferir regiones.

Ahora tenemos imágenes correspondientes de hifas y núcleos listas para el recuento. La mayoría de las regiones nucleares se transfieren al sombrero superior. Vaya al menú Medir y seleccione análisis de área integrado o IMA, seleccione Medir todas las regiones y haga clic en Medir para obtener el número FTE.

Ahora los números de FTE de cada región pueden exportarse a una hoja de cálculo utilizando la opción de datos de registro. Abra las imágenes del proyector de chorro creadas previamente para cada canal. Vaya a visualización y seleccione alineación de color.

Seleccione las imágenes de origen respectivas para cada canal a fin de crear una imagen para los tres canales. Se realiza un análisis de escaneo lineal para ilustrar la posición espacial de diferentes marcadores en el núcleo. Vaya al comando de las barras de herramientas de medición y seleccione el análisis de escaneo lineal trazando una línea a través de la célula.

Esto creará un gráfico que muestra la intensidad fluorescente de cada canal a lo largo de la línea y representa la distancia entre diferentes marcadores con respecto entre sí. Para crear una imagen 3D a partir de una pila, vaya al menú de pila y seleccione reconstrucción 3D. Seleccione el tipo de reconstrucción 3D máximo.

Seleccione el plan de rotación, elija la distancia de calibración del chorro. Por lo general, el usuario especifica y hace clic en aceptar para crear una reconstrucción 3D. Y así concluye nuestro protocolo de inmunofluorescencia, tinción y análisis de imágenes.

En resumen, el microscopio confocal de inmunofluorescencia es una técnica para la visualización tridimensional de diferentes marcadores C y gamma H dos X foy en el núcleo celular. Gracias por ver este video.