Evaluación de la distribución espacial de la radiación ionizante γH2AX siguientes

Hola, soy Raja Ti y estoy haciendo mi doctorado en el Baker IDI Heart and Diabetes Institute. Te llevaré a través de los pasos que están involucrados en la ilustración en 3D de la modificación oriental que marcó el daño del ADN y la condensación cromática en una nueva célula cardíaca. El ADN se envuelve alrededor de las zonas nucleares.

Cada nucleosoma se compone de cuatro tipos diferentes de histonas, H dos A, H dos b, H tres y H cuatro radios. La formación del ADN se rompe y esta está marcada por PHO de H dos X. Este pho de H dos X se produce principalmente en la creatina que se caracteriza por la metilación de H tres K cuatro. Ahora vamos a ver la ilustración en 3D de las modificaciones en la etiqueta de inmunomunología celular con la capa pho H dos X y la H metilada tres K cuatro.

Empecemos. Comenzamos colocando el curso E de la suspensión de la celda en 15 mil. Los tubos Falcon S se lavan dos veces con aromatización de PB a uno 50 G y Resus.

Suspender en medios nuevos para ver el efecto inmediato de la radiación en los eventos celulares. Mantenga las células en los ojos durante cinco a 10 minutos antes y durante la radiación. Exponga las células a la radiación gamma o a los rayos X Después de la radiación, dispense tres mililitros de la suspensión celular en cada GU de seis.

Placa de pocillo para el pico gamma H, dos X incuban las células entre 30 minutos y una hora a 37 grados centígrados. Utilizamos la misión Cytosine para colocar las células no adherentes en portaobjetos de vidrio. Al ensamblar el clip de citosina, asegúrese de que todo el cable del filtro coincida con el embudo.

Dispense un 50 microlitros, frote esta suspensión celular en cada citosina final, coloque los clips de citosina en la misión Cytosine y gírelo a 500 RPM durante cinco minutos. Retire las pinzas de citosina y separe los portaobjetos de la tarjeta de filtro. No deje que las células se sequen al aire durante demasiado tiempo, ya que puede influir en el fondo de la tinción con fluoresceína.

Usando un alfiler de bloqueo de líquido dibuja círculos alrededor de cada frotis, fijamos las células con una cabeza de paraforma del 4% a temperatura ambiente durante cinco minutos. En comparación con el etanol o el ol, se observó una mejor fijación con un 4% de cabeza de paraforme. Deslizamientos de viento con celdas de perme PPS con Triton X 100 a temperatura ambiente durante cinco minutos.

En comparación con el gemelo 80, observamos una mejor señal en las células con Triton X 100. Observe las celdas con PP S3 veces cada una durante cinco minutos. Bloquee las células en una persona BSA durante 10 minutos a temperatura ambiente y repita esto tres veces en comparación con otros agentes y tiempos de bloqueo.

Al minimizar la unión inespecífica de los anticuerpos primarios, hemos utilizado dos anticuerpos primarios diluidos, uno en 500, con un 1% de BSA a aproximadamente 50 microlitros de anticuerpo primario en cada portaobjetos. La incubación del anticuerpo primario a temperatura ambiente durante 60 minutos reduce la tinción de fondo en comparación con la incubación nocturna a cuatro grados centígrados. Lave las celdas tres veces con PBS durante cinco minutos.

Alexa piso 4 88, buen anti ratón y Alexa piso 5 46 palabras anti conejo. Se utilizaron anticuerpos secundarios para mantener diferentes marcadores simultáneamente. Utilizar anticuerpos criados en diferentes especies.

Agregue aproximadamente 50 microlitros de anticuerpo secundario diluido a cada portaobjetos. Incubar las células a temperatura ambiente durante 90 minutos. Se recomienda incubar las células en la cámara húmeda, ya que evitará que las células y los anticuerpos se sequen

A cada portaobjetos se le añadieron 50 microlitros de una dilución de uno en 500 de topo tres en PBS. Lave los portaobjetos con PBS tres veces cada uno durante cinco minutos. Retire el exceso de humedad de los portaobjetos y agregue la solución de Antifa.

Se recomienda no secar completamente las células antes de agregar la solución de Antifa. Coloque un cubreobjetos en el portaobjetos. Se debe tomar K para evitar la formación de burbujas de aire.

Deje los portaobjetos toda la noche en una cámara oscura y húmeda. Selle el portaobjetos con esmalte de uñas para evitar que las células se sequen. Las imágenes adquiridas revelan un microscopio confocal.

Se ha eliminado una mejor resolución espacial y se ha utilizado láser de helio para la adquisición de imágenes. Un objeto de 63 emisiones de aceite prefiere dos lentes a las lentes de mayor o menor aumento. Un factor de zoom de tres o cuatro producirá una imagen de mejor resolución.

Para la contabilidad de FO de muchas celdas, es preferible utilizar una velocidad de escaneo de ocho, un tamaño de imagen de 1024 en celdas de 1024 píxeles. Cuando se toman imágenes para varios canales, se recomienda una adquisición de escaneo lineal secuencial en comparación con el escaneo de fotogramas. Para evitar el blanqueo de la muestra, la ganancia del detector y la compensación del amplificador se ajustan para reducir la saturación de los ratones y la señal.

Dado que el tamaño del Kama HX X 4 puede ser inferior a 0,5 micrómetros, se recomienda adquirir imágenes con al menos 0,5 micrómetros. El tamaño de paso a lo largo del eje de chorro es necesario en un patrón de serie de chorro utilizando el patrón de marcar primero y marcar perdido. Para ilustrar la relación espacial entre diferentes proteínas, se recomienda utilizar una velocidad de escaneo de seis con un tamaño de imagen de 2048 y 2 48 píxeles utilizando primero el metamor.

En segundo lugar se puede contar a partir de imágenes adquiridas en varios microscopios confocal. Abra etiquetas de imagen gamma hgx directamente desde el menú de archivos o mediante el uso de números de factura. Etiquetas. Vaya al menú de proceso y elija Apilar aritmático.

Elija la proyección máxima y seleccione los planos que se incluirán. Y haga clic en Aceptar. Ahora elija sombrero de copa y seleccione Gamma H dos imágenes X como imagen de origen aplicar.

El filtro de sombrero de copa y la imagen resultante serán una imagen binaria con menos ruido y una variación reducida en la intensidad de los focos. Vaya a regiones y seleccione la herramienta de dibujo de regiones y dibuje regiones alrededor de los núcleos. Vaya a la imagen de proceso, menú y umbral de venta.

Elija el umbral de inclusión y establezca los valores de umbral inferior y superior. Por lo general, son los valores de umbral los que afectan al número cuatro. El valor de umbral óptimo es el que minimiza la inclusión de fondo y maximiza la inclusión de incursión.

Esto se puede lograr mejor contando el número de incursiones utilizando diferentes valores de umbral. Y luego compara el número de incursión con el conteo a simple vista. Seleccione la imagen DPI y vaya al menú de regiones y seleccione la opción de transferir regiones.

Ahora tenemos la incursión correspondiente y las imágenes nucleares listas para contar. La mayoría de las regiones nucleares se transfieren a la chistera. Vaya a medir, menú y seleccione análisis integrado o IMA, seleccione Medir todas las regiones y haga clic en medir para obtener el número FTE.

Ahora, los números FTE de cada región se pueden exportar a una hoja de cálculo mediante la opción Registrar datos. Abra las imágenes del proyector de chorro creadas anteriormente para cada canal. Vaya a la pantalla y seleccione la alineación de color.

Seleccione las imágenes de origen respectivas para cada canal para crear una imagen de imagen para los tres canales. El análisis de escaneo lineal se realiza para ilustrar la posición espacial de diferentes marcadores en el núcleo. Vaya al comando de medición de barras de herramientas y seleccione la línea seca del análisis de escaneo de línea a través de la celda.

Esto creará un gráfico que muestra la intensidad fluorescente de cada canal a lo largo de la línea y representa la distancia de los diferentes marcadores entre sí. Para crear una imagen 3D a partir de una pila, vaya al menú A una pila y elija Reconstrucción 3D. Seleccione el tipo de reconstrucción 3D máximo.

Elija el plan de rotación, elija la distancia de calibración del chorro. Por lo general, el usuario especifica hacer clic en Aceptar para crear una reconstrucción en 3D. Y con esto concluye nuestro protocolo de inmunoflúor y tinción y análisis de imágenes.

En resumen, el microscopio confocal de inmunofluorescencia es una técnica de dos técnicas para la visualización tridimensional de diferentes marcadores C y gamma H de dos X foy en el núcleo celular. Gracias por mirar.