Un inmunoensayo en papel para la detección de inmunoglobulina G

Comience con los discos de papel de filtro funcionalizados con aminas y sumérjalos en glutaraldehído, un reactivo de reticulación.

El glutaraldehído reacciona con los grupos amina a través de una reacción amina-aldehído.

Coloque los discos en un tubo. Agregue agua, agite y aspire para eliminar el glutaraldehído residual.

Después del secado, introducir los anticuerpos de captura específicos del fragmento de inmunoglobulina-G-Fc. Los grupos amina de estos anticuerpos interactúan con los grupos aldehídos en los discos de papel, lo que facilita su inmovilización covalente.

Lavar para eliminar los anticuerpos no unidos e introducir un tampón de bloqueo para evitar la unión no específica.

A continuación, agregue una muestra de prueba que contenga moléculas de inmunoglobulina G en el disco de papel. Las moléculas de inmunoglobulina G interactúan con los anticuerpos de captura.

Superposición con anticuerpos de detección específicos de fragmentos de IgG-Fc conjugados con peroxidasa picante que interactúan con la inmunoglobulina G preunada.

Lave para eliminar los anticuerpos no unidos y agregue una mezcla de sustrato cromogénico y peróxido de hidrógeno.

En presencia de peróxido de hidrógeno, la peroxidasa de rábano picante cataliza la oxidación del sustrato cromogénico, generando un color azul en el disco, indicando la presencia de inmunoglobulina G.

Agregue cinco mililitros de solución de glutaraldehído al 0,05% a una botella de vidrio de 20 mililitros. Sumerja 15 discos de papel de filtro de flujo medio funcionalizados con aminas en esta solución y manténgalos durante una hora agitando a temperatura ambiente. Al mismo tiempo, repita este paso para preparar otros 15 discos de papel de filtro de flujo rápido funcionalizados con aldehído.

Para eliminar el glutaraldehído sin reaccionar de los discos de papel, primero, coloque los discos de papel de filtro de flujo medio y los discos de papel de filtro de flujo rápido en tubos de centrífuga separados de 15 mililitros. Luego, agregue cinco mililitros de agua desionizada a cada tubo y agite los tubos durante 10 segundos. Retire el agua aspirando con una pipeta. Repita dos veces para eliminar cualquier glutaraldehído sin reaccionar.

Luego, seque los discos de papel en un horno a 37 grados centígrados. Una vez seco, agregue cinco microlitros de 0,025 miligramos por mililitro de anticuerpos de fragmento IgG-Fc de ratón a los discos de papel de filtro de flujo medio y ocho microlitros a los discos de papel de filtro de flujo rápido.

Después de incubar durante 20 minutos, agregue 10 microlitros de PBS de 50 milimolares pH 7.4 a cada disco de papel sin eliminar los anticuerpos. Incubar durante 40 minutos para la reacción amina-aldehído. Lave los discos de papel con 0,2 mililitros de tampón de lavado sobre una toalla de papel. Repita el lavado tres veces.

Después de secar los discos de papel en un horno a 37 grados centígrados, bloquee los discos de papel con 15 microlitros de tampón de bloqueo durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego, lave cada disco de papel con 0,2 mililitros de tampón de lavado encima de una toalla de papel. Repita el lavado tres veces.

A continuación, ejecute los estándares de IgG. Cargue 10 microlitros de varias concentraciones de IgG en discos individuales por triplicado. Incubar durante una hora a temperatura ambiente. Lave los discos de papel con 0,2 mililitros de tampón de lavado sobre una toalla de papel. Repita el lavado tres veces.

Después de los lavados, cargue 10 microlitros de anticuerpos de fragmentos IgG-Fc de ratón conjugados con HRP e incube durante una hora a temperatura ambiente. Lave los discos de papel con 0,2 mililitros de tampón de lavado sobre una toalla de papel. Repita el lavado tres veces.

Finalmente, cargue una mezcla de 10 microlitros de TMB y peróxido de hidrógeno en cada disco. Tome imágenes de todos los discos de papel con una cámara digital o un teléfono inteligente después de cinco minutos de incubación y analícelas como se explica en el protocolo de texto.