Los métodos para la manipulación experimental después de la transección del nervio óptico en el SNC de los mamíferos

Las células ganglionares de la retina o RG cs son neuronas del sistema nervioso central que transmiten información visual de la retina al cerebro a través del nervio óptico. En el video complementario, se demostró un método para sodomizar o cortar los axones de toda la población de RGC como modelo de muerte de células neuronales apoptóticas en el sistema nervioso central adulto. En este caso, este método se combina con procedimientos que se dirigen directamente a factores neurotróficos, ARN interferentes cortos, plásmidos o vectores virales que codifican proteínas anti ATO para las células ganglionares de la retina lesionadas o la retina para dirigirse a la retina globalmente.

Un aparato de inyección intraocular se ensambla y se utiliza para inyectar sustancias en la cámara vítrea del ojo para dirigirse específicamente a las células ganglionares de la retina. Se coloca Gelfoam o se utilizan jeringas Hamilton para inyectar sustancias en el nervio óptico. Los resultados de las imágenes del muñón indican que la supervivencia de las células ganglionares de la retina puede aumentar mediante la administración de factores antiapoptóticos.

Utilizando estas técnicas, este método se puede utilizar para identificar las proteínas que están involucradas en la apoptosis de las neuronas adultas en el sistema nervioso central. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia o el diagnóstico de la enfermedad del sistema nervioso central, ya que la transección del nervio óptico es un modelo reproducible para la apoptosis neuronal en el SNC adulto. Para preparar el sistema de jeringa para las inyecciones intraoculares, comience por retirar cualquier aguja o tuerca RN.

Presente en una jeringa Hamilton 1701 de 10 microlitros rn gast tight. Inserte el PFA feral en el pico de copa feral del accesorio de compresión. A continuación, inserte el accesorio completo en el extremo de la jeringa y atornille sin apretar la tuerca RN sobre la parte superior.

Inserte un extremo de un tubo de pico de 16 pulgadas en el accesorio de compresión a través de la abertura en la tuerca RN. Asegúrese de que el tubo de pico esté completamente asentado. Apriete la tuerca RN para comprimir el feral, lo que sellará el tubo de pico.

Repita este proceso en ambos extremos del acoplador de vidrio RN doble. Conecte el extremo libre del tubo de pico a un extremo del acoplador de vidrio RN doble apretando el soporte de la tuerca RN. La micropipeta de vidrio formará la aguja y el cilindro para el sistema de inyección.

Inserte la pipeta de vidrio en el extremo libre del acoplador de vidrio RN doble. Apriete la tuerca RN para fijar la pipeta en su lugar. Bajo un microscopio de disección, cree una punta con el diámetro adecuado sosteniendo una micropipeta tirada en ángulo y frotando la punta a lo largo del glaseado de vidrio de un portaobjetos de vidrio para crear una rotura.

Lo ideal es que la punta final esté ligeramente biselada. A continuación, utilizando un kit de cebado de Hamilton Syringe Company lleno de jeringa, enlazador de tubos de pico, acoplador de vidrio RN doble y la micropipeta de vidrio con aceite mineral para su uso. Con el sistema de inyección hidráulica, reemplace la aguja por una aguja Hamilton 9 0 0 3 0.

A continuación, coloque un tabique de goma sobre la aguja Hamilton 9 0 0 3 0 para proporcionar un sello mientras inyecta el aceite mineral. Inserte la aguja Hamilton 9 0 0 3 0 de la jeringa de cebado en la parte posterior del cilindro de la jeringa Hamilton de 10 microlitros del sistema de inyección. Presione el tabique firmemente contra el extremo de la jeringa para crear un sello.

Presione lentamente el émbolo, el aceite mineral pasará a través de los elementos de vidrio del sistema de inyección. Llenado de la pipeta de vidrio. Empuje todo el aceite a través del sistema de inyección para eliminar las burbujas de aire a lo largo del tracto.

Si la jeringa de llenado se está quedando sin aceite mineral, retire lentamente la aguja mientras dispensa aceite constantemente. Para evitar la formación de burbujas de aire, vuelva a llenar la jeringa de cebado y vuelva a inyectar. Cuando todo el sistema esté lleno de aceite mineral, inserte el émbolo original del 10 microlitros.

La jeringa Hamilton presiona completamente el émbolo para eliminar el aceite mineral adicional del sistema. Limpie la micropipeta de vidrio y el extremo de la jeringa. Con etanol al 70%, retire el émbolo hasta la marca de dos microlitros en el barril.

El extremo de la micropipeta de vidrio se llenará de aire, proporcionando una zona de amortiguación entre el aceite mineral y el fluido que se va a inyectar. Llene el cilindro de la pipeta colocando el extremo de la micropipeta en la solución deseada y retirando el émbolo de la jeringa Hamilton. No se inyectarán más de cuatro a cinco microlitros de solución en el ojo de una rata adulta para realizar la inyección intraocular.

Comience cambiando el flujo de gas al accesorio de máscara de gas para el marco estereotáxico. A continuación, coloque una rata anestesiada con flúor en el aparato estereotáxico. Reduzca la concentración de flúor al 2% y controle la anestesia.

Cubra al animal con una manta quirúrgica. Para mantener la temperatura corporal durante toda la cirugía, abra los párpados y coloque una gota de solución anestésica acan. En la superficie de la córnea se requieren dos personas, una para insertar la pipeta de vidrio en la cámara vítrea y mantener la posición de la pipeta.

Y otro para presionar el émbolo de la jeringa, que proporciona la solución deseada. Bajo un microscopio quirúrgico, agarre la micropipeta de vidrio y el acoplador de vidrio RN dual, separe los párpados formando una forma de V opuesta al sitio de inyección Con los dedos, el ojo se elevará fuera de la órbita. Inserte suavemente la punta de la micropipeta de vidrio a través de un área desprovista de vasos sanguíneos y a través de la esclerótica en un ángulo hacia abajo.

Cuando la pipeta penetre en la esclerótica, se sentirá un pequeño chasquido. La persona que sostiene la jeringa ahora debe inyectar cuatro microlitros de solución presionando el émbolo hasta la marca de dos microlitros en la jeringa. La inyección debe durar aproximadamente uno o dos segundos.

La solución inyectada con éxito se lavará a través de la cámara vítrea, mantendrá la micropipeta firme durante aproximadamente cinco segundos y luego se retirará en la misma dirección en la que se insertó la aguja, la conjuntiva volverá a aletear sobre la pequeña abertura, lo que ayudará a sellar la punción escleral. Una vez finalizada la cirugía, apague el isof de flúor y permita que el animal respire oxígeno durante varios minutos. Cubra la superficie de la córnea con ungüento oftálmico para los ojos Para evitar el secado de la córnea durante la recuperación, retire al animal del dispositivo estereotáxico y devuélvalo a la jaula de recuperación.

Manipular las células ganglionares de la retina mediante el transporte retrógrado después de la exotomía. Primero realice una transección del nervio óptico de acuerdo con las instrucciones del protocolo de transección del nervio óptico por video complementario, 2, 2, 4, 1 medicamentos trazadores. Los plásmidos, siRNAs o vectores virales se pueden aplicar al muñón del nervio óptico.

Hay dos métodos principales para llevar a cabo este procedimiento: espuma de gel o inyección directa en el nervio óptico. Si se utiliza el método de espuma de gel, asegúrese de que las células ganglionares de la retina hayan sido premarcadas inyectando trazadores retrógrados en el colículo superior una semana antes de la taxonomía. Inmediatamente después de cortar el nervio óptico, se coloca un pequeño trozo de espuma de gel empapada en la solución experimental sobre el muñón del nervio óptico seccionado, el contenido orbital se devuelve a la ubicación anterior.

Cuando el ojo regrese a una posición neutral, use pinzas para empujar el trozo de espuma de gel hacia abajo en la órbita, asegurándose de que permanezca sobre el extremo del nervio óptico. La técnica de inyección es más eficaz para la administración de sustancias que deben acceder al citoplasma del axón para ser transportadas retro en gran medida por el flujo opplásmico, se utiliza una jeringa Hamilton de 10 microlitros para inyectar la solución deseada en el nervio óptico seccionado. Es deseable una aguja con un bisel corto.

Cargue la jeringa con 10 microlitros de la solución a inyectar. Por lo general, los plásmidos de irna o vectores virales para inyectar agarran el borde del nervio óptico con pinzas de Dumont de punta fina. Inserte el extremo de la aguja en el nervio óptico, paralelo al nervio.

Hasta que el bisel ya no sea visible, la aguja insertada estará recubierta por todos los lados por el nervio. Una vez insertada la aguja, apriete suavemente los lados del nervio con las pinzas de punta fina e inyecte una cuarta parte de la solución mientras gira la jeringa. Un cuarto de vuelta en el sentido de las agujas del reloj o en el sentido contrario a las agujas del reloj.

Continúe repitiendo estos pasos hasta que se haya completado una rotación completa de la aguja y se haya inyectado todo el contenido de la jeringa. Retire la punta de la jeringa del nervio. Deje cualquier líquido inyectado que tenga reflujo del nervio dentro de la órbita, ya que esto formará un grupo adicional para la absorción por los extremos de los axones.

Vuelva a colocar el contenido orbital en su posición original, cierre la herida y permita que el animal se recupere. Los animales deben ser alojados de forma independiente después de la cirugía. Los analgésicos postquirúrgicos deben administrarse de acuerdo con las pautas de su cuidado animal.

Las autoridades y los animales deben ser monitoreados cuidadosamente después de la cirugía. Como se demuestra en este vídeo, el RGC puede dirigirse directamente mediante la administración de péptidos, fármacos, vectores, plásmidos o siRNAs al muñón del nervio óptico seccionado. En este ejemplo representativo, se realizó un marcaje retrógrado de oro fluorado y se inyectaron inmediatamente tres péptidos marcados con SI en el nervio óptico.

A continuación, se realizaron imágenes en vivo de la retina para evitar que los péptidos se filtraran fuera del tejido durante la fijación, como se puede ver aquí, los tres péptidos marcados con SI inyectados en el nervio óptico fueron retrotransportados en gran medida de vuelta al somato RGC en la retina. En este ejemplo, se inyectaron tres siRNAs marcados con SI en el muñón del nervio óptico. Inmediatamente después de que se volviera a realizar la taxotomía y la obtención de imágenes en vivo de la retina, los tres siRNAs marcados con SI inyectados en el nervio óptico estaban retrógrados, transportados por RG CS según lo indicado por su colocalización.

Con el etiquetado retrógrado de oro flúor Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en segundos si se hace correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante tener cuidado de evitar dañar la lente. No olvide que trabajar con partículas virales puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben seguir las pautas institucionales para trabajar con riesgos biológicos mientras se realiza este procedimiento.