Los métodos para la manipulación experimental después de la transección del nervio óptico en el SNC de los mamíferos

Las células ganglionares de la retina o RG cs son neuronas del sistema nervioso central que transmiten información visual desde la retina hasta el cerebro a través del nervio óptico. En el video complementario, se demostró un método para seccionar ex sodomizing o cortar los axones de toda la población de RG cs como modelo de muerte celular neural apoptótica en el sistema nervioso central adulto. Aquí, este método se combina con procedimientos que dirigen directamente factores neurotróficos, ARN de interferencia cortos, plásmidos o vectores virales que codifican proteínas anti ATO hacia células ganglionares de la retina lesionadas o hacia la retina para dirigirse a la retina de manera global.

Se ensambla un aparato de inyección intraocular y se utiliza para inyectar sustancias en la cámara vítrea del ojo con el fin de dirigirse específicamente a las células ganglionares de la retina. Se puede colocar Gelfoam o utilizar jeringas Hamilton para inyectar sustancias en el nervio óptico. Los resultados del análisis de imágenes del muñón indican que la supervivencia de las células ganglionares de la retina puede aumentarse mediante la administración de factores antiapoptóticos.

Utilizando estas técnicas, este método puede emplearse para identificar proteínas que participan en la apoptosis de neuronas adultas en el sistema nervioso central. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico o tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central, ya que la sección del nervio óptico es un modelo reproducible de apoptosis neuronal en el SNC adulto. En general, quienes son nuevos en esta técnica tienen dificultades porque dañan el cristalino al insertar la pipeta de vidrio en la cámara vítrea del ojo. Para preparar el sistema de jeringa para inyecciones intraoculares, comience por retirar cualquier aguja o tuerca RN.

Presente en una jeringa Hamilton de 10 microlitros con cierre hermético para gases, modelo 1701. Inserte el feral de PFA en el feral del vaso del pico del accesorio de compresión. Luego, inserte todo el accesorio en el extremo de la jeringa y enrosque ligeramente la tuerca RN por la parte superior.

Introduzca un extremo de un tubo capilar de 1/16 de pulgada en el racor de compresión a través de la abertura en la tuerca RN. Asegúrese de que el tubo capilar esté completamente asentado. Apriete la tuerca RN para comprimir el ferullo, lo que sellará el tubo capilar.

Repita este proceso en ambos extremos del acoplador de vidrio RN dual. Sujete el extremo libre del tubo de punta a uno de los extremos del acoplador de vidrio RN dual apretando la tuerca RN superior. La micropipeta de vidrio formará la aguja y el cilindro para el sistema de inyección.

Inserte la pipeta de vidrio en el extremo libre del acoplador de vidrio RN dual. Apriete la tuerca RN para fijar la pipeta en su lugar. Bajo un microscopio estereoscópico, cree una punta con el diámetro apropiado sosteniendo una micropipeta estirada en un ángulo y frotando la punta a lo largo del vidrio esmerilado de una placa de vidrio para crear una fractura.

Lo ideal es que la punta final tenga un bisel ligeramente inclinado. A continuación, utilizando un kit de cebado de Hamilton Syringe Company, llene con aceite mineral la jeringa, el enlazador de tubo capilar, el acoplador de vidrio RN dual y la micropipeta de vidrio para su uso. Con el sistema de inyección hidráulica, sustituya la aguja por una aguja Hamilton 9 0 0 3 0.

A continuación, coloque un septo de goma sobre la aguja Hamilton 9 0 0 3 0 para proporcionar un sello mientras se inyecta el aceite mineral. Introduzca la aguja Hamilton 9 0 0 3 0 de la jeringa de cebado en la parte posterior del cilindro de la jeringa Hamilton de 10 microlitros del sistema de inyección. Presione firmemente el septo contra el extremo de la jeringa para crear un sello.

Presione lentamente el émbolo; el aceite mineral pasará a través de los elementos de vidrio del sistema de inyección, llenando la pipeta de vidrio. Pase todo el aceite a través del sistema de inyección para eliminar cualquier burbuja de aire a lo largo del trayecto.

Si la jeringa de llenado se está quedando sin aceite mineral, retire lentamente la aguja mientras dispensa aceite constantemente. Para prevenir la formación de burbujas de aire, rellene la jeringa de cebado e inyecte nuevamente. Cuando todo el sistema esté lleno de aceite mineral, inserte el émbolo original de 10 microlitros.

Con la jeringa de Hamilton, presione completamente el émbolo para eliminar el exceso de aceite mineral del sistema. Limpie la micropipeta de vidrio y el extremo de la jeringa. Con etanol al 70 %, retire el émbolo hasta la marca de dos microlitros en el cilindro.

El extremo de la micropipeta de vidrio se llenará de aire, creando una zona de amortiguación entre el aceite mineral y el líquido que se va a inyectar. Llene el cuerpo de la pipeta colocando el extremo de la micropipeta en la solución deseada y retirando el émbolo de la jeringa Hamilton. No más de cuatro a cinco microlitros de solución se inyectarán en el ojo de una rata adulta para realizar la inyección intraocular.

Comience cambiando el flujo de gas al accesorio de máscara de gas para el marco estereotáxico. Luego coloque una rata anestesiada con isoflurano en el aparato estereotáxico. Reduzca la concentración de isoflurano al 2% y supervise la anestesia.

Cubra al animal con una manta quirúrgica. Para mantener la temperatura corporal durante toda la cirugía, abra los párpados y coloque una gota de solución anestésica acan. En la superficie de la córnea, la inyección requiere dos personas: una para insertar la pipeta de vidrio en la cámara vítrea y otra para mantener la posición de la pipeta.

y otro para presionar el émbolo de la jeringa, que administra la solución deseada. Bajo un microscopio quirúrgico, sujete la micropipeta de vidrio y el acoplador de vidrio RN dual, separen los párpados formando una forma de V opuesta al sitio de inyección. Con los dedos, el ojo se elevará fuera de la órbita. Inserte suavemente la punta de la micropipeta de vidrio a través de una zona libre de vasos sanguíneos y a través de la esclerótica en un ángulo descendente.

Cuando la pipeta penetre la esclerótica, se sentirá un pequeño chasquido. La persona que sostiene la jeringa debe inyectar ahora cuatro microlitros de solución presionando el émbolo hasta la marca de dos microlitros en la jeringa. La inyección debe tardar aproximadamente de uno a dos segundos.

La solución inyectada con éxito fluirá a través de la cámara vítrea, mantenga la micropipeta firme durante aproximadamente cinco segundos y luego retírela en la misma dirección en que se insertó la aguja; la conjuntiva volverá a su posición sobre la pequeña abertura, ayudando a sellar la punción escleral. Una vez finalizada la cirugía, apague el isoflurano y permita que el animal respire oxígeno durante varios minutos. Cubra la superficie de la córnea con una pomada oftálmica para prevenir el secado corneal durante la recuperación, luego retire al animal del dispositivo estereotáxico y devuélvalo a la jaula de recuperación.

Para manipular las células ganglionares de la retina mediante transporte retrógrado tras una exotomía. Primero realice una transección del nervio óptico según las instrucciones del protocolo de transección del nervio óptico en el video complementario, 2, 2 4, 1 trazadores fármacos. Se pueden aplicar plásmidos, siARN o vectores virales al muñón del nervio óptico.

Existen dos métodos principales para realizar este procedimiento: mediante espuma de gel o inyección directa en el nervio óptico. Si se utiliza el método de espuma de gel, asegúrese de que las células ganglionares de la retina hayan sido previamente marcadas mediante la inyección de trazadores retrógrados en el colículo superior una semana antes de la disección. Inmediatamente después de seccionar el nervio óptico, coloque un pequeño trozo de espuma de gel impregnado con la solución experimental sobre el muñón del nervio óptico seccionado; a continuación, devuelva el contenido orbitario a su posición original.

Cuando el ojo regrese a una posición neutra, utilice pinzas para introducir el trozo de espuma de gel en la órbita, asegurándose de que permanezca sobre el extremo del nervio óptico. La técnica de inyección es más eficaz para la administración de sustancias que deben acceder al citoplasma del axón para ser transportadas eficazmente en sentido retrógrado mediante el flujo axoplasmático. Se utiliza una jeringa Hamilton hermética de 10 microlitros para inyectar la solución deseada en el nervio óptico seccionado. Es recomendable una aguja con bisel corto.

Cargue la jeringa con 10 microlitros de la solución que se va a inyectar. Normalmente plásmidos de irna o vectores virales para inyectar, sujete el borde del nervio óptico con pinzas finas de Dumont. Introduzca el extremo de la aguja en el nervio óptico, paralelo al nervio.

Hasta que el bisel ya no sea visible, la aguja insertada quedará rodeada por completo por el nervio. Una vez insertada la aguja, apriete suavemente los lados del nervio con la pinza de punta fina e inyecte un cuarto de la solución mientras gira la jeringa. Un cuarto de vuelta en sentido horario o antihorario.

Continúe repitiendo estos pasos hasta completar una rotación completa de la aguja y haber inyectado todo el contenido de la jeringa. Retire la punta de la jeringa del nervio. Deje cualquier líquido inyectado que haya refluido desde el nervio dentro de la órbita, ya que esto formará un depósito adicional para la absorción por los extremos de los axones.

Devuelva el contenido orbital a su posición original, cierre la herida y permita que el animal se recupere. Los animales deben alojarse de forma independiente después de la cirugía. Se deben administrar analgésicos postquirúrgicos según las directrices de su comité de cuidado animal.

Las autoridades y los animales deben vigilarse cuidadosamente después de la cirugía. Como se demuestra en este video, las CRR pueden ser dirigidas directamente mediante la administración de péptidos, fármacos, vectores, plásmidos o ARNip al muñón del nervio óptico seccionado. En este ejemplo representativo, se realizó una marcación retrograda con oro fluorescente y se inyectaron inmediatamente tres péptidos marcados en el nervio óptico.

Posteriormente se realizó imágenes en vivo de la retina para evitar que los péptidos se lixiviaran del tejido durante la fijación, como puede observarse aquí: tres péptidos marcados con SI3 se inyectaron en el nervio óptico y fueron transportados de forma retrógrada hacia los somas de las CRR en la retina. En este ejemplo, se inyectaron ARNip marcados con SI3 en el muñón del nervio óptico. Inmediatamente después de la sección del nervio óptico, se realizó nuevamente imágenes en vivo de la retina, y se observó que los ARNip marcados con SI3 inyectados en el nervio óptico fueron transportados de forma retrógrada por las CRR, tal como lo indica su colocalización.

Con la marcación retrograda con Fluorgold, una vez dominada, esta técnica puede realizarse en segundos si se ejecuta correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante tener cuidado para evitar dañar el cristalino. No olvide que trabajar con partículas virales puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben seguir las directrices institucionales para trabajar con materiales biológicamente peligrosos durante la realización de este procedimiento.