Name: Un modelo de ratón En el útero Trasplante (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Aprende el trasplante in útero en ratones para estudiar terapia génica y células madre. Este método permite evaluar el injerto celular y la expresión génica en un modelo fetal.

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Queremos agradecer a nuestras fuentes de financiamiento: El Instituto de Medicina Regenerativa de California Clínica Fellow de Formación Grant (AN), National Science Foundation (MW), Irene Premio Perstein (TCM), Colegio Americano de Cirujanos (MTC), la American Pediatric Surgical Association ( MTC), y la March of Dimes (TCM).

1. Preparación de pipetas de inyección <ol><li> Calibrar el extractor de la pipeta de modo que la separación de la pipeta de vidrio se produce en 15 segundos (vea las instrucciones del fabricante con respecto a la calibración). La pipeta se tiene una forma cónica que se separa. </li><li> Corte el extremo de la pipeta de modo que la distancia desde el inicio de la puesta a punto hasta el final de la pipeta se 1.04cm de 1.05cm. La longitud de la pipeta es inversamente proporcional a la talla del orificio de la pipeta. Tenga en cuenta que la toma de una pipeta ya también se traduce en una punta más débil que es más susceptible a la rotura durante la inyección. </li><li> El siguiente paso en la toma de la pipeta es para crear un bisel liso de afilar la punta en una rueda de diamante afilado. En el momento de cortar la pipeta al tamaño adecuado, la pipeta a menudo se rompe con un bisel natural en su extremo que se debe utilizar cuando se coloca la pipeta en el volante. Durante este proceso, es importante para que se apoye la pipeta en la rueda de afilar y la reevaluación periódica para asegurarse de que la pipeta ha dejado de tocar la rueda (como el bisel se vuelve más suave, se pierde el contacto con la rueda de afilar). </li><li> Una vez que el bisel es suave, la punta de la pipeta debe estar afilada (Figura 1). Elevar la pipeta de tal manera que ya no es tocar la rueda de afilar, gire hacia la derecha por 10 a 50 grados, y coloque la pipeta sobre la rueda giratoria para el afilado de 10 segundos. Retirar la pipeta de la rueda de afilar y ahora a examinar el borde. Este paso lo general tiene que ser repetido con varios pequeños ajustes para crear un borde afilado. Si la pipeta se coloca en el borde por mucho tiempo, es más probable el desarrollo de una superficie irregular (Figura 1). Después de completar un lado, se puede proceder a afilar el extremo opuesto, repitiendo los pasos anteriores. </li><li> Use un marcador permanente para dibujar una línea circunferencial cada 4 mm de partida en el cono de la pipeta empieza. Estas demarcaciones corresponden a 5UL de volumen. </li></ol> 2. Trasplante en el útero <ol><li> Después de preparar el material inyectable (por ejemplo, células, virus, etc) se puede configurar para la inyección. Utilizamos un microinyector conectado a aire comprimido con la siguiente configuración: (ajustes de presión: de entrada 60-80 psi, llenar 40 psi, inyectar 8-12 psi, el balance de 0 psi, mantenga 0 psi, tiempo de inyección de 100 milisegundos). </li><li> Para esterilizar la pipeta de inyección, se limpia dos veces con EtOH al 70% seguido por dos veces con PBS estéril 1X. Como la punta de la pipeta es muy frágil, no recomendamos el autoclave las pipetas de inyección. </li><li> Las inyecciones se puede hacer uso de 2,5 veces, 3,5 veces las lupas de aumento o un microscopio de disección. Prepare el área de procedimiento con una manta térmica, la iluminación y los instrumentos quirúrgicos necesarios. </li><li> Anestesiar el ratón embarazadas (que utilizan el isoflurano y el oxígeno suministrado a través de una unidad de anestesia de flujo continuo). Coloque el ratón sobre una almohadilla en la posición supina y colocar cada parte con cinta adhesiva para sujetar el ratón en su lugar. </li><li> Clip de la piel. Entonces, el uso de guantes quirúrgicos estériles, preparación del abdomen con un 10% de povidona yodada seguido por el alcohol, y se inyecta un analgésico como la buprenorfina. </li><li> Haga una incisión de 1 cm en la parte baja del abdomen (la parte más inferior de la incisión debe ser de aproximadamente 1 cm superior a la del introito). Incisión en la piel y la fascia. Tenga cuidado de no dañar los órganos abdominales (intestino y la vejiga), que son inmediatamente debajo de la fina capa de la fascia. </li><li> Usar hisopos de algodón, estirar suavemente la fascia y entregar el útero grávido a través de la incisión. Cuente el número total de los fetos, en primer lugar la identificación de los ovarios a derecha e izquierda para asegurarse de que visualizar todo el útero. Lugar en el útero de nuevo en la cavidad abdominal antes de proceder a fin de que los fetos permanecer caliente mientras se prepara para las inyecciones. </li><li> Extraiga el volumen adecuado de material para el número de fetos va a inyectar. Mientras se llena la aguja con la muestra, es importante mantener la punta de la pipeta para evitar la aspiración sumergida la muestra en el tubo microinyector. Dado que las células están generalmente en un pequeño volumen, por lo general los coloca en una microcentrífuga pequeños (por ejemplo: 0,5 ml) de tubo o directamente en un trozo de Parafilm para poder llenar la aguja sin romper la punta de la pipeta. </li><li> Aplique suavemente cada feto e identificar la parte del feto va a inyectar (por ejemplo, hígado, la cavidad peritoneal, la pierna, etc.) Con el pulgar y el índice, se debe estabilizar el feto dentro de la cavidad amniótica para que no gire mientras está realizando la inyección. Es importante mantener el feto con la suficiente firmeza para estabilizarlo pero con cuidado suficiente para evitar que se dañe. </li><li> Introduzca con cuidado la pipeta a través del útero, amnios y la piel del feto, y en el órgano diana. Si la pipeta es fuerte, se debe pasar fácilmente a través de estos tejidos. Si la punta de la pipeta es aburrida, que wi ll abombamiento aviso del útero y las membranas amnióticas. Inyectar el volumen deseado en cada feto. Es imprescindible que los movimientos se firme durante el tiempo de la inserción, la inyección y retiro de la pipeta. </li><li> Una vez que el volumen deseado mediante una inyección, retirar la pipeta con cuidado. Si se realiza correctamente, el material no debe salirse de la cavidad amniótica o el útero. Si un agujero grande que se crea en el amnios, que se puede reconocer por la pérdida de líquido amniótico, la supervivencia está en peligro. Finalmente, para los estudios que involucran a la cosecha después del parto, todos los fetos deben recibir inyecciones de técnica perfecta, ya que no hay manera de discernir los fetos inyectadas y no inyectadas después del nacimiento. </li><li> Si va a realizar inyecciones en el hígado fetal, en ocasiones puede ver sangre en la punta de la pipeta después de su retirada, lo que confirma que está en la posición correcta y no debe afectar a la supervivencia. Si se realiza intra-peritoneal inyecciones, el objetivo ligeramente por debajo del hígado fetal. Para las inyecciones intramusculares, es posible que la posición del feto para identificar la cadera y el fémur y se inyecta el músculo del glúteo. Finalmente, para la inyección intraventricular, es fácil ver los puntos de sutura coronal para dirigir la pipeta con el objetivo apropiado. Por estas inyecciones, un poco más grande pipetas calibre son necesarios para penetrar el cráneo sin romper la pipeta. </li><li> A continuación, coloque cuidadosamente el útero en la cavidad abdominal. Asegúrese de que no se tuerce sobre sí misma o alrededor de su aporte vascular. Entregar 1 ml de PBS estéril 1X en la cavidad peritoneal de la madre para reemplazar el líquido que se perdió durante el procedimiento. Cerrar la incisión en 2 capas con una sutura trenzada absorbible 5-0 (ex: Vicryl). En primer lugar cerrar la fascia, sin lesionar el intestino subyacente o de la vejiga, y luego cerrar la piel. </li><li> En este momento, después del procedimiento se pueden administrar medicamentos para la analgesia. Volver cada hembra inyecta a su jaula individual y colocar la jaula en una manta térmica. Monitorear el ratón hasta que esté en posición vertical. Poner camas en la jaula y coloque el ratón en una zona tranquila de la instalación del ratón en el que no debe ser alterado (es decir, sin limpiar la jaula) hasta varios días después del parto. Reducir al mínimo cualquier tensión adicional para el animal que disminuirá las posibilidades de un parto prematuro. </li><li> Una vez que haya completado la inyección, limpie su pipeta estéril dos veces con PBS 1X y una vez con EtOH al 70%. </li><li> Hembras inyectadas deben ser observados diariamente para asegurar que se están recuperando de un procedimiento sin dificultad. La incisión debe ser monitoreado por la hinchazón, inflamación de los signos, la separación de la herida, y otros de la infección. Post-operatorio se puede administrar analgésicos si es necesario. </li></ol> 3. Los resultados representativos: La supervivencia de los fetos inyectadas a la prestación de largo plazo es el principal factor limitante para lograr el éxito con esta técnica. Dependiendo de la inyección de materiales y la cepa de ratón se utilizan, las tasas de supervivencia puede variar. En general, las inyecciones de células hematopoyéticas en ratones de tipo salvaje en el E14 debe dar lugar a por lo menos 50% de los cachorros nacidos vivos. Las mayores tasas de supervivencia son posibles dependiendo de los aspectos técnicos de la inyección, así como las características de los ratones que se inyecta. Minimizar el trauma de las membranas y líquido amniótico del útero es el aspecto técnico más importante de este protocolo. Sharp, pipetas de pequeño calibre se traducirá en un mínimo trauma del útero durante la inyección. Nosotros no recomendamos el uso de agujas de inyección estándar como el calibre de los pre-fabricados agujas es demasiado grande y se traduciría en un gran agujero en el útero. Hechos a mano pipetas de inyección de vidrio son sólo las agujas de pequeño calibre que pueden ser utilizados en las inyecciones de útero. Técnica quirúrgica cuidadosa y meticulosa, incluyendo el manejo suave del útero y un breve anestésico también es crucial para obtener resultados óptimos. Características específicas de los ratones receptores tales como los antecedentes genéticos, la edad gestacional y tamaño de la camada también puede afectar a la supervivencia. Ciertas cepas de ratones son más susceptibles a trabajo de parto prematuro y pérdida del embarazo en función de sus antecedentes genéticos. 15 animales transgénicos con defectos musculares o neurodegenerativas pueden tener un deterioro de la capacidad para entregar los fetos por vía vaginal después de someterse a una laparotomía media. 8 Estas mujeres embarazadas pueden requerir la entrega de cesárea. También hemos encontrado que la edad gestacional en el momento de la inyección puede afectar la viabilidad. Los fetos que tienen menos de 12 días embrionarias tienen menores tasas de supervivencia de fetos mayores. Finalmente, hemos encontrado que la basura de gran tamaño (&gt; 10 fetos) tienden a tener mayores tasas de muerte fetal después de la inyección. Atención a los aspectos técnicos de esta técnica y las características específicas de los ratones que se inyecta se puede maximizar la supervivencia de los fetos inyectadas. ve_content "&gt; Cuando estos métodos se llevan a cabo correctamente, se puede esperar que todos los fetos son expuestos a la sustancia que se inyecta. Similar a la configuración después del parto, sin embargo, la entrega exitosa de las células o virus en el útero no siempre se traduce en el injerto donante de células o genes expresión, respectivamente. El injerto de células madre, por ejemplo, depende de varios factores como la dosis y la fuente de las células trasplantadas. Del mismo modo, el éxito de la transducción viral es, en parte, determinada por el tipo de vector viral utilizado. Hay que entender los numerosos factores que la supervivencia de las crías del impacto, el injerto celular y transducción viral para lograr el éxito con este protocolo. <img src="/files/ftp_upload/2303/2303fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagrama que representa el correcto afilado de las pipetas de inyección (Paso 1.4)

<ol><li>Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+by+in+utero+transplantation+of+paternal+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment of X-linked severe combined immunodeficiency by in utero transplantation of paternal bone marrow.</a> N Engl J Med. 335, 1806-1810 (1996).</li>
<li>Wengler, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-utero+transplantation+of+parental+CD34+haematopoietic+progenitor+cells+in+a+patient+with+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+%28SCIDXI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">In-utero transplantation of parental CD34 haematopoietic progenitor cells in a patient with X-linked severe combined immunodeficiency (SCIDXI).</a> Lancet. 348, 1484-1487 (1996).</li>
<li>Flake, A. W., Zanjani, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((in+utero+hematopoietic+stem+cell+transplantation%3A+ontogenic+opportunities+and+biologic+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">in utero hematopoietic stem cell transplantation: ontogenic opportunities and biologic barriers.</a> Blood. 94, 2179-2191 (1999).</li>
<li>Merianos, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+alloantibodies+induce+a+postnatal+immune+response+that+limits+engraftment+following+in+utero+hematopoietic+cell+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice.</a> J Clin Invest. 119, 2590-2600 (2009).</li>
<li>Peranteau, W. H., Endo, M., Adibe, O. O., Flake, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+an+immune+barrier+after+in+utero+hematopoietic-cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Evidence for an immune barrier after in utero hematopoietic-cell transplantation.</a> Blood. 109, 1331-1333 (2007).</li>
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<li>MacKenzie, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+satellite+cells+after+prenatal+intramuscular+administration+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Transduction of satellite cells after prenatal intramuscular administration of lentiviral vectors.</a> J Gene Med. 7, 50-58 (2005).</li>
<li>Sabatino, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+expression+of+hF.IX+After+tolerance+induction+by+in+utero+or+neonatal+administration+of+AAV-1-F.IX+in+hemophilia+B+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Persistent expression of hF.IX After tolerance induction by in utero or neonatal administration of AAV-1-F.IX in hemophilia B mice.</a> Mol Ther. 15, 1677-1685 (2007).</li>
<li>Mellor, A. L., Munn, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+at+the+maternal-fetal+interface%3A+lessons+for+T+cell+tolerance+and+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunology at the maternal-fetal interface: lessons for T cell tolerance and suppression.</a> Annu Rev Immunol. 18, 367-391 (2000).</li>
<li>Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actively+acquired+tolerance+of+foreign+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Actively acquired tolerance of foreign cells.</a> Nature. 172, 603-606 (1953).</li>
<li>Endo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+to+ocular+stem+cells+by+early+gestational+intraamniotic+injection+of+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene transfer to ocular stem cells by early gestational intraamniotic injection of lentiviral vector.</a> Mol Ther. 15, 579-587 (2007).</li>
<li>Waddington, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+transgene+expression+by+administration+of+a+lentivirus-based+vector+to+the+fetal+circulation+of+immuno-competent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Long-term transgene expression by administration of a lentivirus-based vector to the fetal circulation of immuno-competent mice.</a> Gene Ther. 10, 1234-1240 (2003).</li>
<li>Schachtner, S., Buck, C., Bergelson, J., Baldwin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+regulated+expression+patterns+following+in+utero+adenovirus-mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Temporally regulated expression patterns following in utero adenovirus-mediated gene transfer.</a> Gene Ther. 6, 1249-1257 (1999).</li>
</ol>

Más de 50 años, Billingham, Brent y Medawar utilizados en el útero de trasplante en ratones para inducir tolerancia inmunológica a proteínas extrañas. 16 Desde entonces, diversas variantes de esta técnica se han utilizado para tratar las cuestiones de la inmunología y la biología de células madre. El protocolo detallado aquí es uno de los métodos más accesibles para los IUT. El hígado fetal ofrece un blanco fácil de visualizar y proporciona acceso a la circulación sistémi...

<table><tbody><tr><td>Pipetas</td><td>Kimble Chase</td><td>71900-100</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de pipetas</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Modelo P-30</td><td></td></tr><tr><td>Microinyector</td><td>Narishige International</td><td>IM-300</td><td></td></tr><tr><td>Afilador de pipetas</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Modelo BV-10</td><td></td></tr></tbody></table>

un modelo de ratón en el útero trasplante

A Mouse Model of in Utero Transplantation

El trasplante de células madre en el útero y el virus tiene un enorme potencial para el tratamiento de alteraciones congénitas en el feto humano. Por ejemplo, en el útero de trasplante (IUT) de las células madre hematopoyéticas se ha utilizado con éxito para tratar pacientes con inmunodeficiencia combinada severa 1,2. En otras condiciones, sin embargo, IUT se ha intentado sin éxito. 3 Teniendo en cuenta estos resultados mixtos, la disponibilidad de un sistema eficiente no humanos modelo para estudiar las secuelas biológicas del trasplante de células madre y terapia génica es fundamental para avanzar en este campo. Nosotros y otros han utilizado el modelo de ratón de la UIT para estudiar los factores que afectan de éxito del injerto en el útero trasplantado células madre hematopoyéticas, tanto en ratones de tipo salvaje 4-7 y personas con enfermedades genéticas. 8,9 El ambiente fetal también ofrece ventajas para el éxito de la terapia génica in utero. Por ejemplo, la entrega de adenovirus 10, adeno-asociado viral 10, 11 antirretrovirales, y los vectores lentiviral 12,13 en el feto ha dado lugar a la transducción de múltiples órganos distantes del sitio de la inyección con la expresión genética a largo plazo. En el útero por lo tanto, la terapia génica puede ser considerada como una posible estrategia de tratamiento para los trastornos de un único gen, como la distrofia muscular o fibrosis quística. Otra ventaja potencial de IUT es la capacidad de inducir tolerancia inmunológica a un antígeno específico. Como se ha visto en ratones con hemofilia, la introducción del factor IX a principios de los resultados del desarrollo de la tolerancia a esta proteína 14. Además de su uso en la investigación de terapias potenciales humanos, el modelo de ratón de IUT puede ser una poderosa herramienta para estudiar las cuestiones básicas de la biología celular y del desarrollo del tallo. Por ejemplo, se puede ofrecer varias moléculas pequeñas para inducir o inhibir la expresión de genes específicos en etapas definidas gestacional y manipular las vías de desarrollo. El impacto de estas alteraciones puede ser evaluado en los puntos de tiempo diferentes después del trasplante inicial. Además, se puede trasplantar células pluripotentes específicas o linaje progenitor en el medio ambiente fetal para estudiar la diferenciación de células madre en un entorno de acogida no irradiados y sin inmutarse. El modelo de ratón de IUT ya ha proporcionado información numerosas en el campo de la inmunología, biología celular y del desarrollo y el tallo. En este protocolo basado en video, se describe un enfoque paso a paso para realizar el IUT de fetos de ratones y delinear los pasos críticos y peligros potenciales de esta técnica.

El modelo de ratón de<em&gt; En el útero</em&gt; El trasplante es una herramienta versátil que puede usarse para estudiar las posibles aplicaciones clínicas de trasplante de células madre y terapia génica en el feto. En este protocolo, se presenta un enfoque general a la realización de esta técnica

Un modelo de ratón En el útero Trasplante

El trasplante de células madre y virus in utero posee un potencial extraordinario para el tratamiento de trastornos congénitos en el feto humano. Por ejemplo, en ...

El objetivo general de este procedimiento es trasplantar células o virus a fetos de ratón. Primero, realice una incisión en la cara ventral del ratón. A continuación, exteriorice el útero y los fetos, y luego realice las inyecciones intrauterinas.Finalmente, devuelva suavemente el útero a la cavidad peritoneal y cierre la fascia abdominal y la piel. En última instancia, se pueden obtener resultados que demuestran el injerto celular o la expresión génica mediante citometría de flujo PCR o inmunohistoquímica en trasplantes de células madre y terapia génica en el útero. Nuestras estrategias innovadoras para tratar trastornos congénitos antes del nacimiento nos permiten aprovechar el sistema inmunitario fetal inmaduro para inducir tolerancia a células alogénicas o a proteínas formadas.El modelo murino de trasplante in utero nos permite estudiar los factores biológicos únicos del feto, que conducen al éxito del injerto y a la inducción de tolerancia inmunológica. Esta técnica será demostrada ahora por Amer Nial, cirujano y becario posdoctoral en mi laboratorio. La preparación de las pipetas de inyección comienza con la tracción de pipetas de vidrio mediante un tirador de pipetas que ha sido calibrado para lograr la separación de la pipeta.En menos de 15 segundos, coloque la pipeta en el extractor de pipetas y sujétela en su lugar utilizando las abrazaderas superior e inferior. A continuación, presione el botón de tracción. El filamento se calentará y la pipeta se separará.La pipeta tendrá una zona cónica donde se realiza el corte en el extremo de la pipeta, de modo que la distancia desde el inicio de la zona cónica hasta el extremo de la pipeta sea de 1,04 a 1,05 centímetros. Debido a que la longitud de la pipeta es inversamente proporcional al calibre del orificio de la pipeta. Fabricar una pipeta más larga dará como resultado una punta más débil, que es más susceptible de romperse durante la inyección y podría afectar la supervivencia del feto de ratón inyectado.Para crear un bisel suave, la punta de la pipeta debe afilarse en una rueda de afilado de diamante. Encienda la rueda y luego baje suavemente la pipeta sobre la rueda de afilado giratoria. Cuando se corta inicialmente la pipeta, a menudo se rompe formando un bisel natural.En la punta, reevalúe periódicamente la pipeta mediante el microscopio adjunto para asegurarse de que la pipeta aún esté tocando la rueda. Puesto que, a medida que el bisel se vuelve liso, perderá contacto con la rueda de afilado. Una vez que el bisel esté liso, debe afilarse la punta de la pipeta.Eleve la pipeta de manera que ya no toque la rueda de afilado. Gírela en sentido horario entre 10 y 50 grados y coloque nuevamente la pipeta sobre la rueda de afilado giratoria durante aproximadamente 10 segundos. Tenga cuidado de no colocar la pipeta sobre su borde durante demasiado tiempo, ya que podría desarrollar una superficie irregular.Retire la pipeta de la rueda de afilado y examine el borde. Por lo general, este paso debe repetirse varias veces con pequeños ajustes para lograr un borde afilado. Después de terminar un lado, afílese el borde opuesto de la misma manera que se acaba de demostrar.Este diagrama muestra el afilado adecuado de las pipetas de inyección, una vista inferior del bisel de una aguja correctamente afilada y una vista lateral de una pipeta con un borde irregular, como se muestra aquí. Finalmente, utilice un marcador permanente para trazar una línea circunferencial cada cuatro milímetros a partir del punto donde comienza la zona cónica de la pipeta; estas marcas corresponden a cinco microlitros de volumen.Después de preparar la inyección, las pipetas y el material inyectable, puede prepararse para realizar las inyecciones. Primero, limpie dos veces la pipeta de inyección con un XPBS, sumerja la pipeta en PBS y presione el botón de llenado hasta que se aspire suficiente líquido para llenar la pipeta. Luego, revise cada vez el PBS.A continuación, prepare el área del procedimiento con una manta térmica, iluminación y los instrumentos quirúrgicos necesarios. Las inyecciones se realizarán utilizando lentes de aumento quirúrgico de 2,5 x. En esta demostración, aunque también se puede usar un microscopio estereoscópico, coloque el ratón anestesiado sobre una placa calefactora en posición supina y sujete cada extremidad con cinta adhesiva para inmovilizar al animal.Después de cortar el vello, prepare el abdomen con yodo de povidona al 10%, seguido de alcohol, y confirme mediante un pellizco en el dedo del pie que el animal está completamente anestesiado. Luego, realice una incisión de un centímetro en el abdomen inferior. El aspecto más inferior de la incisión debe estar aproximadamente un centímetro por encima del pubis; incise la piel y la fascia.Tenga cuidado de no lesionar los intestinos y la vejiga, que se encuentran inmediatamente debajo de la delgada capa de fascia. Usando hisopos de algodón, estire suavemente la fascia y extraiga el útero grávido a través de la incisión. Identifique los ovarios derecho e izquierdo para asegurarse de visualizar todo el útero, y luego cuente el número total de fetos.Coloque el útero de nuevo en la cavidad abdominal antes de continuar, para que los fetos permanezcan cálidos mientras se prepara para las inyecciones. Dado que los materiales inyectables suelen estar en un volumen pequeño, normalmente los colocamos en un tubo pequeño de microcentrífuga para poder llenar la aguja sin romper la punta de la pipeta. Como las inyecciones son el aspecto más difícil de este procedimiento, una buena técnica que resulte en un trauma mínimo al útero es fundamental para el éxito de esta técnica.Los fetos deben sujetarse firmemente, pero con suficiente suavidad para evitar daños. También es imperativo que sus movimientos sean firmes durante la inserción y retirada de la pipeta para la inyección. Aspire el volumen adecuado de material según el número de fetos que planea inyectar.Es importante mantener las puntas de pipeta de mers para evitar aspirar su muestra dentro del tubo del microinyector. Sujete suavemente un feto e identifique la parte del feto en la que planea inyectar. En esta demostración, inyectaremos cada feto en una parte diferente del cuerpo, siendo la primera el hígado fetal.Con el pulgar y el índice, estabilice el feto dentro de la cavidad amniótica para que no gire mientras realiza la inyección. Para inyectar en el hígado, inserte cuidadosamente la pipeta a través del útero, el amnios y la piel fetal, y dentro del hígado fetal. Una pipeta afilada debe atravesar fácilmente estos tejidos.Introduzca el volumen deseado en el feto y retire la pipeta suavemente. Es fundamental que sus movimientos sean firmes durante la inserción, inyección y retirada de la pipeta en las inyecciones intraperitoneales. La pipeta también se inserta a través del útero, el amnios y la piel fetal, pero apuntando ligeramente por debajo del hígado fetal.Injecte el volumen deseado para inyecciones intramusculares. Posicione al feto para identificar la cadera y el fémur e inyecte en el músculo glúteo. Para inyecciones intraventriculares, es fácil observar las suturas coronales para dirigir la pipeta hacia el blanco adecuado para estas inyecciones.Se requieren pipetas de calibre ligeramente mayor para penetrar el cráneo sin romper la pipeta. Para estudios que implican la recolección posnatal, todos los fetos deben recibir inyecciones técnicamente perfectas, ya que no hay forma de distinguir fetos inyectados y no inyectados después del nacimiento. Si las inyecciones se realizan correctamente, el material no debería salirse de la cavidad amniótica ni del útero.Después de inyectar cuidadosamente a los fetos, coloque el útero nuevamente en la cavidad abdominal, asegurándose de que no esté torcido sobre sí mismo ni alrededor de su suministro vascular. Administre un mililitro de XPBS 1× en la cavidad peritoneal de la madre para reponer cualquier líquido perdido durante el procedimiento. Cierre la incisión en dos capas con una sutura absorbible trenzada de calibre 5-0.Primero, cierre la fascia sin lesionar el intestino ni la vejiga subyacentes, y luego cierre la piel. Finalmente, devuelva la hembra inyectada a su propia jaula individual. Coloque la jaula sobre una manta térmica y coloque material de enriquecimiento en la jaula.Coloque al ratón en un área tranquila del animalario donde no deba ser molestado hasta varios días después del parto. Minimizar cualquier estrés adicional para el animal disminuirá las posibilidades de parto pretérmino. Aquí se muestran resultados representativos del injerto de células donadoras tras el trasplante celular in utero. Se transplantaron células madre hematopoyéticas positivas para GFP en fetos del día embrionario 14.Posteriormente, se realizó una toma de sangre periférica en un cachorro quimérico para detectar la expresión de GFP en las células donantes mediante citometría de flujo, lo que confirmó la presencia de células donantes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar pipetas de inyección y realizar inyecciones in utero. Una vez dominadas estas técnicas fundamentales.Este método puede modificarse para inyectar fetos en diversas edades gestacionales con el fin de estudiar la biología básica del desarrollo y de las células madre.

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