Name: De alta resolución de fibra óptica para Microendoscopy In situ Celular imágenes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T22:01:00.000+00:00
Duration: 13 min 49 s
Description: Aprende a construir un microendoscopio de fibra óptica de alta resolución para imágenes celulares in situ en tiempo real. Este sistema de bajo costo permite observar procesos celulares en su microambiente nativo.

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Esta investigación fue financiada en parte por los Institutos Nacionales de Salud, subvención R01 EB007594, el Departamento de Programa de Defensa de Breast Cancer Research, la propuesta BCO74699P7, y la Fundación Susan G. Komen conceder 26152/98188972.

1. Microendoscope Asamblea El microendoscope de alta resolución se describe aquí (figura 1) debe ser considerado como una configuración de base con algunas variaciones posibles en el montaje y aplicación. Se describe en detalle la encarnación de la plataforma que está diseñada para ser utilizada con proflavina como un agente de contraste fluorescente. Proflavina nuclear es una brillante mancha con pico de absorción y emisión de longitudes de onda de 445 nm y 515 nm, respectivamente. El uso de otros agentes de contraste se requiere que el usuario seleccione la excitación, emisión y filtros dicroicos adecuadamente. Varios elementos de la microendoscope de alta resolución son de carácter genérico y se puede obtener de múltiples proveedores. Por ejemplo, los componentes óptico-mecánica de posicionamiento están disponibles en Thorlabs, Newport, Linos, entre otros. Compactas cámaras CCD están disponibles de compañías como Point Grey Research, Prosilica y Retiga; sensibilidad de la cámara deben ser elegidos de acuerdo a la luminosidad del fluoróforo que se utilizarán, así como el tipo de marco. De alta potencia de los diodos emisores de luz (LED) se puede obtener de Luxeon, cree, y Nichia, entre otros. De fibra óptica de paquetes están disponibles a partir de Sumitomo, Fujikura, y Schott. En la selección de componentes para una aplicación específica, el usuario debe considerar las relaciones inherentes a la microscopía de fluorescencia entre la concentración del fluoróforo, photobleaching, intensidad de la iluminación, la sensibilidad de la cámara, la ganancia y el tiempo de exposición. <ol><li> Conecte el 6 "barras de la jaula a los 1,5" barras de la jaula, para formar un par de 7.5 "varas de largo. Tornillo de estas barras en una sola cara de la unidad de espejo doble. Tornillo de 0,5" barras en la cara opuesta. Deslice el cubo de la jaula en las barras de la jaula, a través de la parte inferior dos orificios pasantes. Tornillo de 2 "barras en la cara lateral del cubo de la jaula (fig. 1B). </li><li> Conecte la cámara a una placa de la jaula con un C-mount a un adaptador de SM1. Fije la placa de la jaula en el 0,5 barras de la jaula ", alineado con la cara de la unidad de espejo doble. </li><li> Inserte el "tubo" de la lente en un 3 "tubo de la lente de largo y asegurar el objetivo con un anillo de retención. La longitud focal de la lente debe ser seleccionado de tal manera que los núcleos del haz de fibra óptica se muestra por lo menos dos píxeles cuando se proyecta en la cámara. Coloque el filtro de emisiones en el tubo en la parte superior del primer anillo de contención, y añadir otro anillo para bloquear el filtro en su lugar. Tenga en cuenta las convenciones orientación filtro indicado por el fabricante del filtro. Atornille el tubo de la lente en el lado de la jaula de cubo más cercano a la cámara CCD. Tenga en cuenta que en la figura 1c, este objetivo y el filtro se muestran sin el tubo de la lente 3 "para mayor claridad. </li><li> Conecte la cámara a un ordenador y ver la imagen en la pantalla. Dirigir el montaje de la jaula en un objeto distante y deslice el cubo de la jaula a lo largo de los rieles hasta que aparece una imagen en foco. Bloquear el cubo de la jaula en este lugar. (Este es un método sencillo de asegurar que el lente del tubo se forma una imagen nítida cuando se combina con el infinito lente con corrección de objetivos). </li><li> Inserte el espejo dicroico en el soporte y el lugar 45 º en el cubo de la jaula. </li><li> Tornillo de la lente del objetivo, a través de un adaptador de rosca RMS a SM1 y un tubo de lente ajustable, en la cara del cubo de la jaula frente a la titular de la lente del tubo. Un z-traductor puede ser utilizado en lugar del tubo de lente ajustable para facilitar el enfoque. Tornillo de un conector SMA en una placa de montaje de la jaula y esta en las barras, aproximadamente a la distancia de trabajo de la lente del objetivo. </li><li> Montar un LED en una placa de la jaula y deslizarse hacia el extremo de los dos "varas. Añadir una lente a un 0,5" tubo de la lente de tal manera que cuando este tubo se atornilla en el lado del cubo jaula, se forma una imagen del LED que llena la abertura posterior de la lente del objetivo. Esta configuración (Kohler iluminación) se asegurará de que la cara proximal del haz de fibra óptica es uniformemente iluminada. Añadir el filtro de excitación en el tubo de la lente de 0.5 "y seguro en su lugar con un anillo de retención (figura 1c). </li><li> Conecte un conector SMA a un paquete de fibra óptica. Atornille el conjunto SMA conectorizado en el receptáculo de SMA montados en las barras de la jaula. Dirigir el extremo distal del haz hacia una fuente de luz de banda ancha (iluminación fluorescente es suficiente) y observe la imagen de la cara proximal paquete de la cámara CCD. Ajustar la posición de la lente del objetivo por atornillado dentro o fuera del cubo de la jaula hasta que la imagen aparece un haz de fibras en el enfoque. Los núcleos individuales deben ser claramente visibles (Figura 2). </li></ol> 2. GRIN conjunto de la lente La resolución espacial de la microendoscope se puede aumentar por colocar un objetivo de micro-o conjunto de la lente en la punta distal del haz de fibras. Estas ópticas están configurados de tal manera que en lugar de colocar la punta del paquete directamente en el tejido, la punta se forma la imagen sobre la superficie del tejido con demagnification, lo que aumenta la frecuencia de muestreo espacial impuesta por la orientación de luzING núcleos del haz de fibras. El grado de demagnification corresponde al aumento de la resolución espacial, y al mismo tiempo, a una disminución proporcional en el campo de visión. Componentes del gradiente de índice (GRIN) son compatibles con lentes de fibra óptica y están disponibles en GrinTech, GSN, Schott, entre otros, y puede ser directamente unido a la punta distal de un haz de fibras. <ol><li> Seleccione una lente GRIN con la ampliación deseada y la distancia de trabajo para su aplicación. Asegúrese de que el diámetro de la lente superior a la del haz de fibras va a trabajar. Recomendamos que el haz de fibras y el cristalino GRIN ser montado en distintos estadios de 3 ejes de posicionamiento manual bajo el microscopio estereoscópico de baja potencia o de una correcta alineación antes de la unión. </li><li> Coloque una gota de pegamento óptico (por ejemplo, UV Norland adhesivo de curado), tanto en la lente o en la cara paquete. Reunir a los dos componentes en contacto mediante el uso de los posicionadores manual. Exponer la interfaz a la luz ultravioleta de la dosis recomendada por el fabricante. </li><li> Para proteger la lente GRIN y al interfaz conjunto, una longitud de tubo de aluminio capilar (Small Parts Inc.) puede ser usado para encerrar la articulación. Deslice la tubería sobre la articulación y la seguridad en el lugar con epoxy. Tubería del encogimiento del calor se puede utilizar para terminar el montaje. </li></ol> 3. Microendoscope imágenes <ol><li> Aplicar el agente de contraste a las células o tejido que se va a examinar. Con proflavina (0,01% w / v en PBS), en las imágenes in vitro de las células en cultivo puede realizarse mediante la incubación breve (&lt;1 minuto) y enjuague. Imágenes de los especímenes de tejido ex vivo o in vivo en los tejidos es posible tras la aplicación tópica de la tintura. La captación de proflavina bajo estas condiciones se ha encontrado para ser casi instantánea, con las imágenes posible en unos pocos segundos y una duración de varios minutos. </li><li> Coloque el cable de fibra óptica en ligero contacto con la muestra que se va a examinar. Cuando las células de imagen en la cultura o la ex muestras de tejido vivo, se recomienda montar el extremo distal del haz de fibras en un dispositivo de seguridad con las etapas de la colocación manual de los ejes XYZ para la estabilidad durante la exploración. </li></ol> 4. Los resultados representativos: Una vez montado correctamente, el microendoscope funcionará como un microscopio de epifluorescencia, transmitida a través de una política coherente de fibra óptica de conjunto. Para obtener unos resultados de imagen óptima, se debe prestar atención para asegurar que las tres condiciones clave que se cumplan: <ol><li> La cara proximal del haz de fibras debe ser reflejado en la cámara CCD sin desenfoque, con el fin de lograr la resolución completa del sistema. Figura 2a, b, c muestran una parte de un haz de fibras imágenes con un enfoque pobres, desenfoque ligero, y un buen enfoque, respectivamente. El nivel óptimo de enfoque se encuentra ajustando la posición axial de la lente del objetivo relativo a la cara paquete. </li><li> La cara proximal del haz de fibras debe ser uniformemente iluminada sobre su diámetro total (campo de visión). Como se describe en el texto del Protocolo (1,7), esto se logra mediante la configuración de la óptica de iluminación para la iluminación de Kohler. La Figura 2d muestra una imagen adquirida en una muestra uniforme fluorescente se ilumina en esta configuración preferida, con la Figura 2e demuestra el resultado correspondiente bajo iluminación crítica. En este último caso, la estructura de los LED se crea una imagen en la cara del haz de fibras, lo que resulta en la aparición de este patrón no deseados superpone a la estructura de la muestra real. </li><li> Tanto las caras proximal y distal del haz de fibras debe estar limpia y libre de arañazos y patatas fritas. Figura 2f muestra la presencia de restos unida a la cara paquete, con un daño en la forma de un pequeño chip a las 5 en el perímetro de la fibra. Los escombros pueden ser retirados del paquete se enfrenta a la limpieza de la misma manera como convencionales conectores de fibra óptica, con el papel de la lente y el isopropanol, o fibra óptica estándar de herramientas de limpieza. Si cualquiera de los extremos del haz de fibras está rayado o astillados, o si el paquete se rompe a lo largo de su longitud, la cara puede ser pulido plana en el manual estándar, o las técnicas mecánicas de pulido. Recomendamos 12-15 micras lamiendo el papel de un esmalte grueso inicial, con un toque final en el papel 0.5-1.0 micras. </li></ol> Figura 3a muestra imágenes de 1483 células in vitro, a raíz de etiquetado con la colocación proflavina y la luz del haz de fibras al descubierto en la muestra. Figura 3b muestra la mejora en la resolución espacial y la reducción del campo de visión proporcionada por una lente GRIN 2.5x unido a la punta del paquete. Película 1 muestra imágenes in vivo de la almohadilla de grasa mamaria en un modelo murino. Aquí, un haz de fibras con un diámetro exterior de 0,5 mm (330 micras campo de visión) fue aprobada a través de una aguja de calibre 21 y se dirigen hacia el tejido. Las células grasas son claramente visibles, con el movimiento por el ciclo cardíaco evidente en esta adquisición de 15fotogramas por segundo. La figura 3c muestra imágenes de la mucosa oral en voluntarios humanos sanos, esta vez usando un haz de fibras más grande con 1,5 mm de diámetro exterior (1,4 mm campo de visión). En todos los ejemplos mostrados, proflavina fue utilizado como un agente de contraste fluorescente etiquetado nuclear. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Montaje de la microendoscope de alta resolución (HRME). (A) Diagrama esquemático del sistema de HRME. (B) de la Asamblea de la estructura de soporte óptico-principal. (C) La adición de elementos de óptica, iluminación LED y una cámara CCD. (D) Fotografía del sistema HRME, envasado en un 10 "x 8" x 2,5 "caja. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Configuración del HRME. Ejemplos de imágenes con el paquete de fibra óptica en (a) La concentración pobre, (b) cerca de un buen enfoque, (c) enfoque ideal. En (d), un blanco uniforme fluorescente en el extremo distal del haz es reflejado en Kohler (uniforme) de iluminación. (E) Un blanco fluorescente uniforme imágenes bajo iluminación crítica, con la estructura aparente de la fuente en el objeto. (F) los tejidos y células sueltas se pueden pegar a la cara un haz de fibras, que también es propensa a daños menores en su periferia. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Imágenes con la HRME. (A) 1.483 células in vitro, con imágenes de un haz de fibras desnudas (IGN-08/30) después de marcar con proflavina 0,01% (w / v). (B) El mismo 1483 el cultivo de células como se muestra en (a), fotografiado con un haz de fibras con la lente de 2.5x GRIN adjunto. (C) de la imagen de la mucosa normal oral humana in vivo, tras la aplicación tópica de proflavina 0,01% (w / v). Movie 1. Imagen de la almohadilla de grasa mamaria de un ratón a través de la inserción de un 450 micras de diámetro exterior de un haz de fibras dentro de la luz de una aguja de calibre 21 pasado en el tejido. Proflavina 0,01% (w / v) fue entregado en el lugar de imágenes con la misma aguja antes de la inserción de la fibra de imagen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2306/5-11-1%202306_Pierce_movie1.avi">Haga clic aquí para ver el video</a>

<ol><li>Pierce, M. C., Javier, D. J., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+contrast+agents+and+imaging+systems+for+detection+and+diagnosis+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Optical contrast agents and imaging systems for detection and diagnosis of cancer.</a> Int. J. Cancer. 123, 1979-1990 (2008).</li>
<li>Muldoon, T. J., Pierce, M. C., Nida, D. L., Williams, M. D., Gillenwater, A., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular-resolution+molecular+imaging+within+living+tissue+by+fiber+microendoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Subcellular-resolution molecular imaging within living tissue by fiber microendoscopy.</a> Opt. Express. 15, 16413-16423 (2007).</li>
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<li>Zhong, W., Celli, J. P., Rizvi, I., Mai, Z., Spring, B. Q., Yun, S. H., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+high-resolution+fluorescence+microendoscopy+for+ovarian+cancer+detection+and+treatment+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">In vivo high-resolution fluorescence microendoscopy for ovarian cancer detection and treatment monitoring.</a> Br. J. Cancer. 101, 2015-2022 (2009).</li>
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<li>Dromard, T., Ravaine, V., Ravaine, S., Lévêque, J. -L., Sojic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+in+vivo+imaging+of+human+skin+corneocytes+by+means+of+an+optical+fiber+bundle%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Inst%22%5BJournal%5D)">Remote in vivo imaging of human skin corneocytes by means of an optical fiber bundle.</a> Rev. Sci. Inst. 78, 053709-05 (2007).</li>
<li>Udovich, J. A., Kirkpatrick, N. D., Kano, A., Tanbakuchi, A., Utzinger, U., Gmitro, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+background+and+transmission+characteristics+of+fiber+optic+imaging+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles.</a> Appl. Opt. 47, 4560-4568 (2008).</li>
<li>Barretto, R. P. J., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fluorescence+imaging+with+high-resolution+microlenses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses.</a> Nat. Methods. 6, 511-512 (2009).</li>
<li>Rouse, A. R., Kano, A., Udovich, J. A., Kroto, S. M., Gmitro, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+demonstration+of+a+miniature+catheter+for+a+confocal+microendoscope%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Design and demonstration of a miniature catheter for a confocal microendoscope.</a> Appl. Opt. 43, 5763-5771 (2004).</li>
<li>Kester, R. T., Christenson, T., Richards-Kortum, R., Tkaczyk, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+cost%2C+high+performance%2C+self-aligning+miniature+optical+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Low cost, high performance, self-aligning miniature optical systems.</a> Appl. Opt. 48, 3375-3384 (2009).</li>
</ol>

MP y DY no tienen nada que revelar. RRK tiene patentes relacionadas con las plataformas de imágenes microendoscópica.

La técnica de alta resolución microendoscopy descrito aquí proporciona a los investigadores en las áreas de investigación biomédica básica y clínica con un método flexible, robusta y rentable para la visualización de detalles celulares in situ. Se ha descrito un protocolo para el montaje del sistema de imágenes y ha demostrado su uso en cultivo celular in vitro y en animales, y los tejidos humanos in vivo. Mientras que los resultados de las imágenes que aquí se presenta utiliza proflavina como un agente de contraste fluorescente, otros grupos han demostrado las versiones del sistema, con longitudes de onda de la iluminación LED y filtros elegido para que coincida con la excitación / emisión de los espectros de los colorantes 5-7 otras. Resolución y campo de visión-son inicialmente determinado por el espacio de núcleo a núcleo y el diámetro de imagen del haz de fibras ópticas. Hemos utilizado los paquetes con aproximadamente 4 micras núcleo central separación, y los diámetros de imagen de 330 micras (una película), 720 m (Figura 2, Figura 3a, b), y 1400 m (Figura 3c). Los paquetes más pequeños pueden pasar a través de agujas de calibre más estrecho y son mucho más flexibles que las fibras más grandes. Nosotros y otros ocho, en algunos casos, observó la aparición de las emisiones de autofluorescencia de la fibra sí mismo paquete. Cuando se trata de excitar fluoróforos en longitudes de onda UV, o recoger las emisiones en el rango espectral de color rojo, se debe prestar atención al nivel de la autofluorescencia de haces de fibras que contribuye a la señal total medida. Mientras que la mayoría de los trabajos de alta resolución microendoscopy informó a la fecha ha utilizado un haz de fibras desnudas, ampliación adicional puede ser proporcionada por el uso de lentes GRIN unido a la punta distal. Lentes GRIN ofrecen una manera sencilla y económica para aumentar la resolución espacial, a pesar de su susceptibilidad a las aberraciones ópticas y NA limitada es bien reconocida. Si el rendimiento de la lente GRIN es inadecuada para una aplicación particular, GRIN híbrido / objetivos lente esférica 9 o en miniatura asambleas lente del objetivo 10-11 puede ser empleado. El microendoscope de alta resolución se describe aquí funciona básicamente como un gran campo epi-microscopio de fluorescencia, por lo tanto no seccionamiento óptico (como en la microscopía confocal o no lineal) es de esperar. En nuestra experiencia, con 455 nm de excitación y la luz proflavina actualidad como un agente de contraste, la luz se recopilan principalmente a una profundidad que corresponde a una pocas capas de células. Este protocolo debe permitir al lector para montar el microendoscope de alta resolución en el laboratorio, con un tamaño compacto de 10 &quot;x 8&quot;. Si lo desea, el sistema puede ser encerrado en una caja y los componentes eléctricos (LED y una cámara) alimentado por una batería (Figura 1d). Muchas cámaras compactas pueden ser alimentados por la IEEE-1394 (Firewire) y USB de la computadora host.

<table><tbody><tr><td>Cámara CCD</td><td>Point Grey Research</td><td>GRAS-14S5M</td><td></td></tr><tr><td>LED</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>M455L2</td><td>Seleccionado para uso con proflavina &amp;#8211; otros fluoróforos pueden requerir componentes diferentes</td></tr><tr><td>Filtro de excitación</td><td>Semrock</td><td>452/45</td><td>Seleccionado para uso con proflavina &amp;#8211; otros fluoróforos pueden requerir componentes diferentes</td></tr><tr><td>Filtro de emisión</td><td>Semrock</td><td>550/88</td><td>Seleccionado para uso con proflavina &amp;#8211; otros fluoróforos pueden requerir componentes diferentes</td></tr><tr><td>Espejo dicróico</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>485 DCLP</td><td>Seleccionado para uso con proflavina &amp;#8211; otros fluoróforos pueden requerir componentes diferentes</td></tr><tr><td>Lente objetivo</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>RMS 10X</td><td></td></tr><tr><td>Lente tubular</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>AC-254-150-A1</td><td>Seleccionar la longitud focal para lograr la ampliación requerida a la CCD</td></tr><tr><td>Lente condensadora</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>ACL2520</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de cubo de jaula</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2</td><td></td></tr><tr><td>Varillas y placas de jaula</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3)</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de espejo plegado</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>KCB1, PF10-03-G01</td><td></td></tr><tr><td>Tubos para lentes</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>SM1L05, SM1L30, SM1V05 (o SM1Z)</td><td></td></tr><tr><td>Adaptadores / acopladores</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2)</td><td></td></tr><tr><td>Conectores SMA</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>SM1SMA, 11040A</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de LED</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>LEDD1B TPS001</td><td></td></tr><tr><td>Paquete de fibra óptica</td><td>Sumitomo Bakelite Co., Ltd.</td><td>IGN-08/30</td><td>Están disponibles paquetes más grandes o más pequeños (Sumitomo / Fujikura)</td></tr></tbody></table>

de alta resolución de fibra óptica para microendoscopy in situ celular imágenes

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Muchos estudios biológicos y clínicos requieren el estudio longitudinal y el análisis de la morfología y función de la resolución a nivel celular. Tradicionalmente, los múltiples experimentos se ejecutan en paralelo, con muestras individuales retirados del estudio en los puntos de tiempo secuencial para la evaluación por microscopía de luz. Varias técnicas de intravital se han desarrollado, con confocal, multifotónica, y la microscopía segundo armónico todos los que demuestren su capacidad de ser utilizado para obtener imágenes in situ 1. Con estos sistemas, sin embargo, la infraestructura necesaria es complejo y costoso, que implican un barrido láser y los sistemas complejos las fuentes de luz. Aquí se presenta un protocolo para el diseño y montaje de una microendoscope de alta resolución que puede ser construida en un día usando fuera de la plataforma de componentes de bajo EE.UU. $ 5.000. La plataforma ofrece flexibilidad en cuanto a resolución de la imagen, el campo de visión y de operación de longitud de onda, y se describe cómo estos parámetros se pueden modificar fácilmente para satisfacer las necesidades específicas del usuario final. Nosotros y otros han explorado el uso de la microendoscope de alta resolución (HRME) en el cultivo celular in vitro 2-5, en extirpado 6 y 2,5 viven los tejidos animales, y en los tejidos humanos in vivo 2,7. Los usuarios han reportado el uso de varios agentes de contraste fluorescentes, incluyendo proflavina 2-4, benzoporfirina derivado monoácido anillo A 5 (BPD-MA), y 6,7 fluoresceína, todos los cuales han recibido completo, o la aprobación de investigación de la FDA para su uso en seres humanos. De alta resolución microendoscopy, en la forma descrita aquí, puede apelar a una amplia gama de investigadores que trabajan en las ciencias básicas y clínicas. La técnica ofrece un método eficaz y económico que complementa la microscopía de sobremesa tradicionales, permitiendo al usuario realizar de alta resolución, imágenes longitudinal in situ.

En muchas situaciones clínicas y biológicas es conveniente estudiar los procesos celulares a medida que evolucionan en su microambiente nativa. A continuación se describe el montaje y el uso de un bajo costo de fibra óptica de microscopio que puede ofrecer imágenes en tiempo real en el cultivo celular, los estudios en animales y estudios clínicos del paciente.

De alta resolución de fibra óptica para Microendoscopy In situ Celular imágenes

Muchos estudios biológicos y clínicos requieren el estudio y análisis longitudinal de la morfología y la función con resolución a nivel celular.

Tradicionalmente, los estudios biológicos y clínicos que requieren análisis microscópico con resolución a nivel celular se han realizado mediante la ejecución de múltiples experimentos en paralelo, retirando muestras individuales del estudio en puntos de tiempo secuenciales para su evaluación mediante microscopía óptica, mientras que la microscopía confocal, de múltiples fotones y de armónicos segundos son todas técnicas útiles para la obtención de imágenes in situ. La infraestructura requerida es compleja y costosa, e implica sistemas láser de barrido y fuentes de luz complejas. Aquí demostramos cómo construir un sistema de microendoscopio de fibra óptica de alta resolución en un solo día, utilizando componentes comerciales por menos de 5.000 dólares estadounidenses.La plataforma ofrece flexibilidad en cuanto a resolución de imagen, campo de visión y longitud de onda de operación. Primero, se ensambla un marco simple de microscopio de fluorescencia en epifluorescencia para acomodar una fuente de luz, filtros ópticos, lentes, un haz de fibra óptica y una cámara CCD. A continuación, se instalan las lentes de formación de imágenes, que generan una imagen ampliada del haz de fibra óptica sobre la cámara CCD.A continuación, se instala una fuente LED con óptica de iluminación para proporcionar luz de excitación fluorescente a la muestra. Finalmente, con el microendoscopio ensamblado, la imagen en tiempo real revela detalles a nivel celular de muestras marcadas con fluorescencia, incluyendo cultivos in vitro, modelos animales in vivo y sujetos humanos. La principal ventaja de esta técnica en comparación con métodos existentes como la microscopía confocal o la microscopía de múltiples fotones es que es suficientemente sencilla y económica, de modo que los investigadores que trabajan en una amplia variedad de campos pueden implementarla rápidamente y personalizarla para satisfacer sus necesidades específicas.El microendoscopio de alta resolución descrito aquí debe considerarse como una configuración base con varias variaciones posibles en el montaje y la aplicación. Al seleccionar componentes para una aplicación específica, considere las relaciones inherentes involucradas en la microscopía de fluorescencia entre la concentración del fluoróforo, la iluminación para el fotoblancamiento, la intensidad, la sensibilidad de la cámara, la ganancia y el tiempo de exposición. Esta plataforma está diseñada para usarse con proflavina como agente de contraste fluorescente, pero puede configurarse para funcionar con otros colorantes fluorescentes.El pro flavina es un tinción nuclear brillante con longitudes de onda de absorción máxima y emisión máxima de 445 nanómetros y 515 nanómetros, respectivamente. El uso de otros agentes de contraste requerirá que el usuario seleccione adecuadamente los filtros de excitación, emisión y dicróicos para armar el sistema de microendoscopio; comience conectando dos varillas de jaula de seis pulgadas a dos varillas de jaula de 1,5 pulgadas para formar un par de varillas de 7,5 pulgadas de largo. Enrosque las varillas en una cara de la unidad de espejo plegable, luego instale un espejo de una pulgada de diámetro.A continuación, atornille cuatro varillas de 0.5 pulgadas en la cara opuesta de la unidad del espejo plegado. Deslice el cubo de jaula sobre las varillas de jaula de 7.5 pulgadas a través de los dos orificios pasantes inferiores. Atornille las varillas de dos pulgadas en la cara lateral del cubo de jaula.Utilizando un adaptador de montura C a SM1, conecte la cámara a una placa de jaula. Fije la placa de jaula a las varillas de jaula de 0,5 pulgadas, alineada con la cara de la unidad del espejo plegado. Seleccione una lente tubular de un diámetro de una pulgada para formar una imagen del haz de fibra óptica sobre la cámara.La longitud focal de la lente debe seleccionarse de tal manera que la causa del haz de fibra óptica sea muestreada por al menos dos píxeles. Al proyectarse sobre la cámara, inserte la lente en un tubo de lente de tres pulgadas de largo y asegure la lente con un anillo de retención. Una llave de horquilla es útil para atornillar anillos de retención en tubos de lente largos.Suelte el filtro de emisión dentro del tubo de lente de tres pulgadas, colocándolo sobre la primera arandela, y agregue otra arandela para asegurar el filtro en su lugar. Asegúrese de que la orientación del filtro cumpla con la convención indicada por el fabricante del filtro. Enrosque el tubo de lente en el lado del cubo de jaula más cercano a la cámara CCD.Esta posición también se muestra aquí. Tenga en cuenta que en el diagrama, esta lente y este filtro se muestran sin el tubo de lente de tres pulgadas. Por claridad, conecte la cámara a una computadora y visualice la imagen en la pantalla.Oriente el conjunto de la jaula hacia un objeto distante y deslice el cubo de jaula a lo largo de los rieles hasta que aparezca una imagen enfocada del objeto. Utilice un destornillador para apretar los cuatro tornillos ubicados en los lados del cubo de jaula. Estos tornillos sujetan los rieles cuando se aprietan, manteniendo el cubo en posición.Esto garantizará que las lentes del tubo formen una imagen enfocada del haz de fibras sobre la cámara cuando se combinen con la lente objetivo corregida para infinito. A continuación, inserte el espejo dicróico en el soporte y colóquelo a 45 grados dentro del cubo de sujeción. Atornille la lente objetivo mediante un adaptador de rosca RMS a SM y un tubo de lente ajustable en la cara del cubo de sujeción opuesta al soporte de la lente del tubo.Después de eso, atornille un conector SMA en una placa de jaula y monte esta sobre las varillas aproximadamente a la distancia de trabajo de la lente del objetivo. Agregue la placa base y la tapa final a los lados abiertos del cubo de jaula. Luego, monte un LED en una placa de jaula y deslícelo hasta el extremo de las varillas de dos pulgadas.Agregue una lente a un tubo de lente de 0,5 pulgadas de manera que, cuando este tubo se atornille al costado del cubo de jaula, forme una imagen del LED que llene la abertura trasera del objetivo. Además, agregue el filtro de excitación al tubo de lente. En esta etapa, se puede utilizar un controlador de LED para regular la intensidad de la luz de iluminación mediante epoxi.Conecte un conector SMA para una fibra de 1030 micrones al haz de fibra óptica de 720 micrones de campo de visión. Para obtener más detalles sobre la terminación de fibras ópticas, consulte T Thor Labs, número de pieza FN nueve seis. Una guía sobre la terminación y pulido de fibras ópticas.Enrosque el haz de conectores SMA en el receptáculo SMA montado en las barras del bastidor. Dirija el extremo distal del haz hacia una fuente de luz de banda ancha; la iluminación fluorescente será suficiente. Luego, observe la imagen de la cara proximal del haz en la cámara CCD. Finalmente, ajuste la posición del objetivo girándolo hacia dentro o hacia fuera del cubo del bastidor.Hasta que la imagen del haz de fibras aparezca enfocada, la causa individual debe ser claramente visible. La resolución espacial del microendoscopio puede aumentarse mediante la adición de una micro-lente o conjunto de lentes en la punta distal del haz de fibras. Estas ópticas se configuran de tal manera que, en lugar de colocar la punta del haz directamente sobre el tejido, la punta se proyecta sobre la superficie del tejido con una reducción dem.De este modo, se aumenta la frecuencia de muestreo espacial impuesta por la guía de luz causada por el haz de fibra. El grado de reducción de tamaño corresponde al aumento en la resolución espacial y, al mismo tiempo, a una disminución proporcional del campo de visión. Seleccione una lente GRIN con la reducción deseada y la distancia de trabajo adecuada para su aplicación.Asegúrese de que el diámetro de la lente coincida con el del haz de fibras con el que planea trabajar. Monte el haz de fibras y la lente grin en etapas manuales de posicionamiento de tres ejes separadas bajo un microscopio de baja potencia o un estereoscopio para lograr una alineación precisa.A continuación, coloque una gota de adhesivo óptico sobre la lente o sobre la cara del haz. Utilizando los posicionadores manuales, acerque los dos componentes hasta que hagan contacto. Exponga la interfaz a luz UV durante la dosis recomendada por el fabricante para curar el adhesivo.Para proteger la lente grin y la interfaz unida, utilice un tramo corto de tubo capilar de aluminio para cubrir la unión. Deslice el tubo sobre la unión y fíjelo en su lugar con una gota de epoxi en cada extremo del tubo; use un tubo termoretráctil para terminar el ensamblaje. Antes de la imagen microendoscópica, aplique el agente de contraste a las células o al tejido que se va a imaginar para visualizar las células y el cultivo.Primero, retire el medio de crecimiento mediante pipeteo. Luego, añada la solución de proflavina pipeteando suavemente en el pocillo. Tras una incubación breve de hasta un minuto, retire la solución de proflavina mediante pipeteo y deséchela.Lave las células añadiendo y eliminando solución fresca de PBS al pocillo. Monte el extremo distal del haz de fibras en un soporte fijo con etapas de posicionamiento manual en los ejes X, Y, Z para garantizar estabilidad. Durante la obtención de imágenes tras la aplicación del colorante a las células o al tejido, coloque el haz de fibra óptica en contacto ligero con la muestra. Observe la imagen del haz de fibra óptica en la pantalla del ordenador, ya sea utilizando el software proporcionado por el fabricante de la cámara o cualquier software personalizado que desee desarrollar.Ajuste el tiempo de exposición y la ganancia de la cámara para obtener una imagen con un brillo aceptable. Cuando se monta correctamente, el microendoscopio funcionará como un microscopio de fluorescencia epiescopia retransmitido a través de un haz coherente de fibras ópticas. Para obtener resultados óptimos de imagen, se debe prestar atención a garantizar que se cumplan tres condiciones clave.Primero, la cara proximal del haz de fibras debe proyectarse sobre la cámara CCD sin desenfoque para lograr la resolución máxima del sistema. Aquí se muestra una porción de un haz de fibras imagenada con mal enfoque, enfoque ligeramente deficiente y buen enfoque. El enfoque óptimo se encuentra ajustando la posición real del objetivo con respecto a la cara del haz.En segundo lugar, la cara proximal del haz de fibras debe iluminarse de manera uniforme en todo su diámetro. Como se describió anteriormente, esto se logra configurando la óptica de iluminación para una iluminación colimada. La imagen mostrada aquí se adquirió cuando una muestra fluorescente uniforme se ilumina en esta configuración preferida.El resultado correspondiente bajo iluminación crítica se muestra aquí. La estructura del LED se proyecta sobre la cara del haz de fibras, lo que provoca la aparición de este patrón no deseado superpuesto a la estructura real de la muestra. En tercer lugar, es importante asegurarse de que tanto las caras proximal como distal del haz de fibras estén limpias y libres de rayaduras y astillas.En este ejemplo, se observa residuo de imagen adherido a la cara del haz y daño en forma de una pequeña mella a las cinco en punto en el perímetro de la fibra. El residuo puede eliminarse de las caras del haz mediante limpieza de la misma manera que los conectores ópticos convencionales, utilizando papel de lente e isopropanol o herramientas estándar de limpieza para fibra óptica. Se marcaron 1483 células con proflavina y se colocó ligeramente el haz de fibra desnudo sobre la muestra.Se muestra aquí la imagen in vitro cuando una lente grin de 2,5 x fue unida al extremo del haz, lográndose una mejora en la resolución espacial y una reducción en el campo de visión. Se realizó imagen in vivo en la que un haz de fibras con un diámetro externo de 0,5 milímetros fue introducido a través de una aguja de calibre 21 y avanzado hacia el tejido de la almohadilla grasa mamaria de un ratón; como se observa en esta película, los adipocitos son claramente visibles con movimiento debido al ciclo cardíaco. En este ejemplo, se realizó el estudio de la mucosa oral en un voluntario humano sano utilizando un haz de fibras más grande con un diámetro externo de 1,5 milímetros.En todos los ejemplos, se utilizó el pro flavina como agente de contraste fluorescente para la marcación nuclear. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseñar y armar un microendoscopio de fibra óptica para imágenes de fluorescencia en C dos de células y tejidos.

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