De alta resolución de fibra óptica para Microendoscopy In situ Celular imágenes

Tradicionalmente, los estudios biológicos y clínicos que requieren análisis microscópicos a nivel celular se han realizado mediante la ejecución de múltiples experimentos en paralelo con muestras individuales extraídas del estudio en tiempo secuencial. La infraestructura requerida es compleja y costosa, ya que involucra sistemas láser de escaneo y fuentes de luz complejas. Aquí demostramos cómo construir un sistema de microendoscopio de fibra óptica de alta resolución en un solo día, utilizando componentes listos para usar por menos de 5.000 dólares estadounidenses.

La plataforma ofrece flexibilidad en términos de resolución de imagen, campo de visión y longitud de onda de funcionamiento. Primero, se ensambla un marco de microscopio de epifluorescencia simple para acomodar una fuente de luz, filtros ópticos, lentes, un haz de fibra óptica y una cámara CCD. A continuación, se instalan las lentes de imagen, que forman una imagen ampliada del haz de fibra óptica en la cámara CCD.

A continuación, se instala una fuente LED con óptica de iluminación para proporcionar luz de excitación fluorescente a la muestra. Por último, con el microendoscopio ensamblado, las imágenes en tiempo real revelan detalles a nivel celular de muestras marcadas con fluorescencia, incluidos cultivos in vitro, modelos animales in vivo y sujetos humanos. La principal ventaja de esta técnica en comparación con los métodos existentes, como la microscopía confocal o multifotónica, es que es lo suficientemente sencilla y económica como para que los investigadores que trabajan en una amplia gama de campos puedan implementarla rápidamente y personalizarla para satisfacer sus necesidades específicas.

El microendoscopio de alta resolución descrito aquí debe considerarse como una configuración básica con varias variaciones posibles en el montaje y la aplicación. Al seleccionar componentes para una aplicación específica, tenga en cuenta las relaciones inherentes involucradas en la microscopía de fluorescencia entre la concentración de fluorol, la iluminación del fotoblanqueo, la intensidad, la sensibilidad de la cámara, la ganancia y el tiempo de exposición. Esta plataforma está diseñada para ser utilizada con pro flavina como agente de contraste fluorescente, pero se puede configurar para trabajar con otros tintes fluorescentes.

La pro flavina es una tinción de núcleo brillante con longitudes de onda máximas de absorción y emisión de 445 nanómetros y 515 nanómetros respectivamente. El uso de otros agentes de contraste requerirá que el usuario seleccione la emisión de excitación, y los filtros dicroicos apropiados para ensamblar el sistema de microendoscopio comienzan conectando dos varillas de jaula de seis pulgadas a dos varillas de jaula de 1.5 pulgadas para formar un par de varillas de 7.5 pulgadas de largo. Atornille las varillas en una cara de la unidad de espejo plegable, luego instale un espejo de una pulgada de diámetro.

A continuación, atornille cuatro varillas de 0,5 pulgadas en la cara opuesta de la unidad de espejo plegable. Deslice el cubo de la jaula sobre las varillas de la jaula de 7.5 pulgadas a través de los dos orificios pasantes inferiores. Atornille las varillas de dos pulgadas en la cara lateral del cubo de la jaula.

Con un adaptador de montura C a SM one, fije la cámara a una placa de jaula. Asegure la placa de la jaula en las varillas de la jaula de 0.5 pulgadas al ras de la cara de la unidad de espejo plegable. Seleccione una lente de tubo de una pulgada de diámetro para formar una imagen del haz de fibra óptica en la cámara.

La distancia focal de la lente debe seleccionarse de manera que la causa del haz de fibra óptica se muestree por al menos dos píxeles. Cuando se visualicen en la cámara, inserte la lente en un tubo de lente de tres pulgadas de largo y asegure la lente con un anillo de retención. Una llave inglesa es útil para atornillar anillos de retención en tubos largos de lentes.

Coloque el filtro de emisión en el tubo de lente de tres pulgadas en la parte superior del primer anillo de retención y agregue otro anillo para asegurar el filtro en su lugar. Asegúrese de que la orientación del filtro satisfaga la convención indicada por el fabricante del filtro. Atornille el tubo del objetivo en el lado del cubo de la jaula más cercano a la cámara CCD.

Esta posición también se muestra aquí. Tenga en cuenta que en el diagrama, esta lente y filtro se muestran sin un tubo de lente de tres pulgadas. Para mayor claridad, conecte la cámara a una computadora y vea la imagen en la pantalla.

Dirija el conjunto de la jaula a un objeto distante y deslice el cubo de la jaula a lo largo de los rieles hasta que aparezca una imagen del objeto enfocada. Use un destornillador para apretar los cuatro tornillos ubicados a los lados del cubo de la jaula. Estos tornillos sujetan los rieles cuando se aprietan manteniendo el cubo en su posición.

Esto asegurará que la lente de tubo forme una imagen enfocada del haz de fibra en la cámara cuando se combine con la lente de objetivo corregida al infinito. A continuación, inserte el espejo diic en el soporte y colóquelo a 45 grados en el cubo de la jaula. Atornille la lente del objetivo a través de un adaptador de rosca RMS a SM y un tubo de lente ajustable en la cara del cubo de la jaula opuesta al soporte de la lente del tubo.

Después de eso, atornille un conector SMA en una placa de jaula y móntelo en las varillas aproximadamente a la distancia de trabajo de la lente del objetivo. Agregue la placa base y la tapa del extremo a los lados abiertos del cubo de la jaula. Luego monte un LED en una placa de jaula y deslícelo en el extremo de las varillas de dos pulgadas.

Agregue una lente a un tubo de lente de 0.5 pulgadas de modo que cuando este tubo se atornille en el costado del cubo de la jaula, formará una imagen del LED que llena la apertura posterior de la lente del objetivo. Además, agregue el filtro de excitación al tubo de la lente. En esta etapa, se puede usar un controlador LED para controlar la intensidad de la luz iluminada con epoxi.

Conecte un conector SMA para una fibra de 1030 micras al haz de fibra óptica con un campo de visión de 720 micras. Para obtener más información sobre la conectorización de fibra óptica, consulte T Thor labs, número de pieza FN nine six. Una guía para la conectorización y el pulido de fibras ópticas.

Atornille el paquete de ojos del conector SMA en el receptáculo SMA montado en la jaula Las varillas dirigen el extremo distal del paquete hacia una fuente de luz de banda ancha, la iluminación fluorescente será suficiente. A continuación, observe la imagen de la cara proximal del haz en la cámara CCD. Finalmente, ajuste la posición de la lente del objetivo enroscándola o desenroscándola fuera del cubo de la jaula.

Hasta que la imagen del haz de fibras aparezca enfocada, la causa individual debe ser claramente visible. La resolución espacial del microendoscopio se puede aumentar conectando una microlente o un conjunto de lentes a la punta distal del haz de fibras. Estas ópticas están configuradas de tal manera que, en lugar de colocar la punta del haz directamente sobre el tejido, la punta se visualiza en la superficie del tejido con un aumento dem.

Aumentando así la frecuencia de muestreo espacial impuesta por la causa de guía de luz del haz de fibras. El grado de aumento corresponde al aumento de la resolución espacial y, al mismo tiempo, a una disminución proporcional del campo de visión. Seleccione una lente Smile con el aumento y la distancia de trabajo deseados para su aplicación.

Asegúrese de que el diámetro de la lente coincida con el del haz de fibras. Con el que planeas trabajar. Monte el haz de fibras y la lente sonriente en etapas de posicionamiento manual separadas de tres ejes debajo de un microscopio o estereoscopio de baja potencia para una alineación precisa.

A continuación, coloque una gota de adhesivo óptico en la lente o en la cara del paquete. Con los posicionadores manuales, ponga en contacto los dos componentes. Exponga la interfaz a la luz ultravioleta durante la dosis recomendada por el fabricante para curar el adhesivo.

Para proteger la lente de sonrisa y la interfaz adherida, use un tramo corto de tubo capilar de aluminio para encerrar la unión. Deslice el tubo sobre la junta y asegúrelo en su lugar con la gota de epoxi en cada extremo del tubo, use un tubo termorretráctil para terminar el ensamblaje. Antes de la obtención de imágenes microendoscópicas, aplique el agente de contraste a las células o al tejido que se va a obtener para obtener imágenes de células y cultivo.

En primer lugar, retire los medios de crecimiento de peppe. A continuación, añada la solución de pro flavina pipeteando suavemente en el pocillo. Después de una breve incubación de hasta un minuto, retire la solución de pro flavina de peppe y deséchela.

Enjuague las celdas agregando y retirando la solución de PBS fresca al pocillo, monte el extremo distal del haz de fibras en un accesorio seguro con etapas de posicionamiento manual en los ejes x, Y, Z para mayor estabilidad. Durante la obtención de imágenes después de la aplicación del tinte a las células o tejidos, coloque el haz de fibra óptica en contacto ligero con la muestra. Vea la imagen del haz de fibra óptica en la pantalla de la computadora, ya sea utilizando el software suministrado por el fabricante de la cámara o cualquier software personalizado que desee desarrollar.

Ajuste el tiempo de exposición y los ajustes de ganancia de la cámara para obtener una imagen con un brillo aceptable. Cuando se ensambla correctamente, el microendoscopio funcionará como un microscopio de epifluorescencia transmitido a través de un haz de fibra óptica coherente. Para obtener resultados de imagen óptimos, se debe prestar atención a garantizar que se cumplan tres condiciones clave.

En primer lugar, se debe obtener una imagen de la cara proximal del haz de fibras en la cámara CCD sin desenfoque para lograr la resolución completa del sistema. Aquí. Una parte de un haz de fibras se visualiza con un enfoque deficiente, ligeramente enfocado y buen enfoque. El enfoque óptimo se encuentra ajustando la posición real de la lente del objetivo en relación con la cara del paquete.

En segundo lugar, la cara proximal del haz de fibras debe iluminarse uniformemente en todo su diámetro. Como se describió anteriormente, esto se logra configurando la óptica de iluminación para la iluminación de cola. La imagen que se muestra aquí se obtuvo cuando se ilumina una muestra fluorescente uniforme en esta configuración preferida.

Aquí se muestra el resultado correspondiente bajo iluminación crítica. La estructura del LED se visualiza en la cara del haz de fibras, lo que da como resultado la aparición de este patrón no deseado superpuesto a la estructura de muestra real. En tercer lugar, es importante asegurarse de que tanto las caras proximales como las distales del haz de fibras estén limpias y libres de arañazos y astillas.

En este ejemplo, los residuos de la imagen se adhieren a la cara del haz y se ven daños en forma de un pequeño chip a las cinco en punto en el perímetro de la fibra. Los residuos se pueden eliminar de las caras del haz limpiando de la misma manera que los conectores de fibra óptica convencionales con lentes, papel e isopropanol o herramientas de limpieza de fibra óptica estándar. Se marcaron 1483 células con pro flavina y el haz de fibras desnudas se colocó ligeramente sobre la muestra.

Aquí se muestran imágenes in vitro cuando se adhirió una lente GRIN de 2,5 x a la punta del haz, se logró una mejora en la resolución espacial y una reducción en el campo de visión. Se realizaron imágenes in vivo en las que un haz de fibras con un diámetro exterior de 0,5 milímetros se pasó a través de una aguja de calibre 21 y avanzó hasta el tejido de la almohadilla de grasa mamaria de un ratón, como se ve en esta película, los adipocitos son claramente visibles con el movimiento debido al ciclo cardíaco. En este ejemplo, se realizaron imágenes de la mucosa oral en un voluntario humano sano utilizando un haz de fibras más grande con un diámetro exterior de 1,5 milímetros.

En todos los ejemplos, se utilizó pro flavina como agente de contraste fluorescente de marcaje nuclear. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseñar y ensamblar un microendoscopio de fibra óptica para imágenes de fluorescencia en C dos de células y tejidos.