De alta resolución de fibra óptica para Microendoscopy In situ Celular imágenes

Tradicionalmente, los estudios biológicos y clínicos que requieren análisis microscópico con resolución a nivel celular se han realizado mediante la ejecución de múltiples experimentos en paralelo, retirando muestras individuales del estudio en puntos de tiempo secuenciales para su evaluación mediante microscopía óptica, mientras que la microscopía confocal, de múltiples fotones y de armónicos segundos son todas técnicas útiles para la obtención de imágenes in situ. La infraestructura requerida es compleja y costosa, e implica sistemas láser de barrido y fuentes de luz complejas. Aquí demostramos cómo construir un sistema de microendoscopio de fibra óptica de alta resolución en un solo día, utilizando componentes comerciales por menos de 5.000 dólares estadounidenses.

La plataforma ofrece flexibilidad en cuanto a resolución de imagen, campo de visión y longitud de onda de operación. Primero, se ensambla un marco simple de microscopio de fluorescencia epiescopia para acomodar una fuente de luz, filtros ópticos, lentes, un haz de fibra óptica y una cámara CCD. A continuación, se instalan las lentes de formación de imágenes, que forman una imagen ampliada del haz de fibra óptica sobre la cámara CCD.

A continuación, se instala una fuente LED con óptica de iluminación para proporcionar luz de excitación fluorescente a la muestra. Finalmente, con el microendoscopio ensamblado, la obtención de imágenes en tiempo real revela detalles a nivel celular de muestras marcadas con fluorescencia, incluyendo cultivos in vitro, modelos animales in vivo y sujetos humanos. La principal ventaja de esta técnica en comparación con métodos existentes como la microscopía confocal o la microscopía de múltiples fotones es que es suficientemente sencilla y económica, de modo que los investigadores que trabajan en una amplia variedad de campos pueden implementarla rápidamente y personalizarla para satisfacer sus necesidades específicas.

El microendoscopio de alta resolución descrito aquí debe considerarse como una configuración base con varias variaciones posibles en el ensamblaje y la aplicación. Al seleccionar componentes para una aplicación específica, considere las relaciones inherentes involucradas en la microscopía de fluorescencia entre la concentración del fluoróforo, la fotobleaching por iluminación, la intensidad, la sensibilidad de la cámara, la ganancia y el tiempo de exposición. Esta plataforma está diseñada para usarse con proflavina como agente de contraste fluorescente, pero puede configurarse para funcionar con otros colorantes fluorescentes.

Pro flavina es un tinción nuclear brillante con longitudes de onda de absorción máxima y emisión máxima de 445 nanómetros y 515 nanómetros, respectivamente. El uso de otros agentes de contraste requerirá que el usuario seleccione adecuadamente los filtros de excitación, emisión y dicróicos para armar el sistema de microendoscopio; comience conectando dos varillas de jaula de seis pulgadas a dos varillas de jaula de 1,5 pulgadas para formar un par de varillas de 7,5 pulgadas de largo. Enrosque las varillas en una cara de la unidad de espejo plegable, luego instale un espejo de un pulgada de diámetro.

A continuación, atornille cuatro varillas de 0,5 pulgadas en la cara opuesta de la unidad del espejo plegado. Deslice el cubo de jaula sobre las varillas de jaula de 7,5 pulgadas mediante los dos orificios pasantes inferiores. Atornille las varillas de dos pulgadas en la cara lateral del cubo de jaula.

Utilizando un adaptador de montura C a SM, conecte la cámara a una placa de jaula. Fije la placa de jaula a las varillas de jaula de 0,5 pulgadas, alineada con la cara de la unidad del espejo plegado. Seleccione una lente tubular de un diámetro de una pulgada para formar una imagen del haz de fibra óptica sobre la cámara.

La longitud focal de la lente debe seleccionarse de tal manera que la causa del haz de fibra óptica sea muestreada por al menos dos píxeles. Al proyectarse sobre la cámara, inserte la lente en un tubo de lente de tres pulgadas de largo y sujete la lente con un anillo de retención. Una llave de ranura es útil para atornillar anillos de retención en tubos de lente largos.

Suelte el filtro de emisión dentro del tubo de lente de tres pulgadas, colocándolo encima del primer anillo de retención, y agregue otro anillo para asegurar el filtro en su lugar. Asegúrese de que la orientación del filtro cumpla con la convención indicada por el fabricante del filtro. Enrosque el tubo de lente en el lateral del cubo de jaula más cercano a la cámara CCD.

Esta posición también se muestra aquí. Tenga en cuenta que en el diagrama, esta lente y este filtro se muestran sin el tubo de lente de tres pulgadas. Para mayor claridad, conecte la cámara a una computadora y vea la imagen en la pantalla.

Oriente el conjunto de la jaula hacia un objeto distante y deslice el cubo de jaula a lo largo de los rieles hasta que aparezca una imagen enfocada del objeto. Utilice un destornillador para apretar los cuatro tornillos ubicados en los lados del cubo de jaula. Estos tornillos sujetan los rieles cuando se aprietan, manteniendo el cubo en posición.

Esto garantizará que las lentes del tubo formen una imagen enfocada del haz de fibras sobre la cámara cuando se combinen con la lente objetivo corregida para infinito. A continuación, inserte el espejo dicróico en el soporte y colóquelo a 45 grados en el cubo de jaula. Enrosque la lente objetivo mediante un adaptador de rosca RMS a SM1 y un tubo de lente ajustable en la cara del cubo de jaula opuesta al soporte de la lente del tubo.

A continuación, atornille un conector SMA en una placa de jaula y monte esta sobre las varillas aproximadamente a la distancia de trabajo de la lente objetivo. Agregue la placa base y la tapa final a los lados abiertos del cubo de jaula. Luego, monte un LED en una placa de jaula y deslícelo hasta el extremo de las varillas de dos pulgadas.

Agregue una lente a un tubo de lente de 0,5 pulgadas de manera que, cuando este tubo se atornille al costado del cubo de jaula, forme una imagen del LED que llene la abertura posterior de la lente del objetivo. Además, agregue el filtro de excitación al tubo de lente. En esta etapa, se puede utilizar un controlador de LED para regular la intensidad de la luz de iluminación mediante epoxi.

Conecte un conector SMA para una fibra de 1030 micrones al haz de fibra óptica de 720 micrones de campo de visión. Para obtener más detalles sobre la terminación de fibras ópticas, consulte T Thor Labs, número de pieza FN nueve seis. Una guía sobre la terminación y pulido de fibras ópticas.

Enrosque el haz de conectores SMA en el receptáculo SMA montado sobre las barras de jaula. Dirija el extremo distal del haz hacia una fuente de luz de banda ancha; la iluminación fluorescente será suficiente. Luego, observe la imagen de la cara proximal del haz en la cámara CCD. Finalmente, ajuste la posición del lente objetivo enroscándolo hacia dentro o hacia fuera del cubo de jaula.

Hasta que la imagen del haz de fibras aparezca enfocada, la causa individual debe ser claramente visible. La resolución espacial del microendoscopio puede aumentarse colocando una micro-lente o un conjunto de lentes en la punta distal del haz de fibras. Estas ópticas se configuran de tal manera que, en lugar de colocar la punta del haz directamente sobre el tejido, la punta se proyecta sobre la superficie del tejido con una reducción dem.

De este modo, se aumenta la frecuencia de muestreo espacial impuesta por el guiado de la luz debido al haz de fibra. El grado de reducción de tamaño corresponde al aumento en la resolución espacial y, al mismo tiempo, a una disminución proporcional del campo de visión. Seleccione una lente GRIN con la reducción deseada y la distancia de trabajo adecuada para su aplicación.

Asegúrese de que el diámetro de la lente coincida con el del haz de fibras con el que planea trabajar. Monte el haz de fibras y la lente grin en etapas manuales de posicionamiento de tres ejes separadas bajo un microscopio de baja potencia o un estereoscopio para lograr una alineación precisa.

A continuación, coloque una gota de adhesivo óptico sobre la lente o sobre la cara del haz. Utilizando los posicionadores manuales, acerque los dos componentes hasta que hagan contacto. Exponga la interfaz a luz UV durante la dosis recomendada por el fabricante para curar el adhesivo.

Para proteger la lente grin y la interfaz unida, utilice un tramo corto de tubo capilar de aluminio para envolver la unión. Deslice el tubo sobre la unión y fíjelo en su lugar con una gota de epoxi en cada extremo del tubo; use un tubo termoretráctil para terminar el ensamblaje. Antes de la imagen microendoscópica, aplique el agente de contraste a las células o al tejido que se va a imaginar para visualizar las células y el cultivo.

Primero, retire el medio de crecimiento mediante pipeteo. Luego, añada la solución de pro flavina pipeteando suavemente en el pocillo. Tras una incubación breve de hasta un minuto, retire y deseche la solución de pro flavina mediante pipeteo.

Lave las células agregando y eliminando solución fresca de PBS al pocillo. Monte el extremo distal del haz de fibras en un soporte fijo con etapas de posicionamiento manual en los ejes X, Y, Z para garantizar estabilidad. Durante la obtención de imágenes tras la aplicación del colorante a las células o al tejido, coloque el haz de fibra óptica en contacto ligero con la muestra. Observe la imagen del haz de fibra óptica en la pantalla del computador, ya sea utilizando el software proporcionado por el fabricante de la cámara o cualquier software personalizado que desee desarrollar.

Ajuste el tiempo de exposición y los ajustes de ganancia de la cámara para obtener una imagen con un brillo aceptable. Cuando se ensambla correctamente, el microendoscopio funcionará como un microscopio de fluorescencia episcópica retransmitido a través de un haz coherente de fibras ópticas. Para obtener resultados óptimos de imagen, se debe prestar atención a garantizar que se cumplan tres condiciones clave.

Primero, la cara proximal del haz de fibras debe proyectarse sobre la cámara CCD sin desenfoque para lograr la resolución máxima del sistema. Aquí se muestra una porción de un haz de fibras imagenada con mal enfoque, enfoque ligeramente deficiente y buen enfoque. El enfoque óptimo se encuentra ajustando la posición real del objetivo con respecto a la cara del haz.

En segundo lugar, la cara proximal del haz de fibras debe iluminarse de manera uniforme en todo su diámetro. Como se describió anteriormente, esto se logra configurando la óptica de iluminación para una iluminación colimada. La imagen mostrada aquí se adquirió cuando una muestra fluorescente uniforme se ilumina en esta configuración preferida.

El resultado correspondiente bajo iluminación crítica se muestra aquí. La estructura del LED se proyecta sobre la cara del haz de fibras, lo que provoca la aparición de este patrón no deseado superpuesto a la estructura real de la muestra. En tercer lugar, es importante asegurarse de que ambas caras, la proximal y la distal del haz de fibras, estén limpias y libres de rayones y astillas.

En este ejemplo, se observa material de desecho adherido a la cara del haz y daño en forma de una pequeña mella a las cinco en punto en el perímetro de la fibra. El material de desecho puede eliminarse de las caras del haz limpiando de la misma manera que los conectores ópticos convencionales, con papel de lente e isopropanol o con herramientas estándar de limpieza para fibra óptica. Se marcaron 1483 células con proflavina y se colocó ligeramente el haz de fibra desnudo sobre la muestra.

Se muestra aquí la imagen in vitro cuando una lente grin de 2,5 x fue unida al extremo del haz, lográndose una mejora en la resolución espacial y una reducción en el campo de visión. Se realizó imagen in vivo en la que un haz de fibras con un diámetro exterior de 0,5 milímetros fue introducido a través de una aguja de calibre 21 y avanzado hacia el tejido de la almohadilla grasa mamaria de un ratón; como se observa en esta película, los adipocitos son claramente visibles con movimiento debido al ciclo cardíaco. En este ejemplo, se realizó el estudio de la mucosa oral en un voluntario humano sano utilizando un haz de fibras más grande con un diámetro exterior de 1,5 milímetros.

En todos los ejemplos, se utilizó el pro flavina como agente de contraste fluorescente para la marcación nuclear. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseñar y armar un microendoscopio de fibra óptica para la obtención de imágenes de fluorescencia en C2 de células y tejidos.