Name: Aislamiento y cultivo de células endoteliales pulmonares de ratones recién nacidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-14T17:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Aprenda a aislar células endoteliales pulmonares de ratones recién nacidos mediante digestión enzimática y purificación con microesferas magnéticas conjugadas con anticuerpos anti-PECAM-1 e ICAM-2.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Esta investigación fue financiada en parte por la Asociación Americana del Corazón conceder 0950118G.to MC-W.

1. La preparación de partículas magnéticas anti-PECAM-1 anticuerpo conjugado (Dynabeads) <ol><li> Prepare un 0,1% de BSA en PBS mediante la mezcla de 50 mg de BSA en 50 ml de PBS con un agitar hasta BSA se disuelve. Esterilizar por filtración a través de filtro de 0,22 micras jeringa. Almacenar a 4 ° C. </li><li> En la capilla de cooperación técnica, transferencia de 200 l de bien resuspendido de oveja anti-ratón IgG Dynabeads en un tubo Eppendorf de 1,5 ml y lavar los granos: el tubo de montaje en la MPC y deje reposar durante 1 minuto para permitir que los granos de sedimento. Aspirar el sobrenadante, retire el tubo de MPC y volver a suspender las bolas en 1 ml de agua estéril 0,1% de BSA / PBS. Pipeta de arriba y abajo para volver a suspender las bolas. </li><li> Repetir el lavado tres veces más, para un total de cuatro lavados. </li><li> Sacar el tubo del MPC y volver a suspender las bolas en 500 l de 0,1% de BSA / PBS. </li><li> Añadir 10 l de rata anti-ratón de PECAM-1 (CD-31) del anticuerpo en el tubo. </li><li> Caída la noche a 4 ° C en la cámara frigorífica o 2 horas a temperatura ambiente. </li><li> Lavar los granos con agua estéril 0,1% de BSA / PBS como se describe en el paso 1.2 en cuatro ocasiones. </li><li> Sacar el tubo del MPC y volver a suspender las bolas en 200 l 0,1% de BSA / PBS. Tienda anti-PECAM-1 anticuerpo conjugado con Dynabeads a 4 ° C durante un máximo de un mes. </li></ol> 2. Aislamiento de ratón las células endoteliales pulmonares de ratones recién nacidos Antes de proceder con el protocolo de purificación de los tejidos, IACUC aprobación del Comité del procedimiento es necesario. <ol><li> Prepare las siguientes: <ul><li> 15 ml de 1 mg / ml C / D solución en DMEM. Filtro con filtro de 0,22 micras jeringa y calentar a 37 º C. </li><li> Tubo de 50 ml cónicos con 15 ml de DMEM, almacenar en el hielo </li><li> Aislamiento de los medios de comunicación (mensajería instantánea), que contiene 20% de SFB y la penicilina 1x / estreptomicina en DMEM </li><li> 2% de gelatina. Mezcla de 2 g de piel de bovino de gelatina con 100 ml de agua dd, minuto 15 autoclave y almacenar a 4 ° C. Calentar a 37 ° C para licuar antes de pintar frascos TC. </li></ul></li><li> Anestesiar a tres crías de 6-8 días de edad con una inyección ip de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg). Comprobar la efectividad de la anestesia y la disección de los animales uno por uno, de la siguiente manera: Pin cachorros a bordo, empape la piel con etanol 70% y eliminar la piel de la zona del pecho con unas tijeras de disección estéril. Impuestos Especiales de la caja torácica para exponer los pulmones. </li><li> Lóbulos individuales asépticamente especial de pulmón, teniendo cuidado de no analizar los bronquios y los tejidos conectivos visible alrededor de los pulmones. Combine todos los pulmones en helado de DMEM. La eutanasia a los cachorros. </li><li> De trabajo en la campana TC, remueva los lóbulos pulmonares de DMEM, el lugar en un plato de 100 mm TC y aspirar el exceso de DMEM. </li><li> Utilizando tijeras estériles, carne picada finamente el tejido mediante la reducción de ~ 100 veces. Traslado a 15 ml caliente C / D solución para la digestión enzimática. Incubar 45 minutos a 37 ° C en un rotor. </li><li> En la capilla TC, aspirar la suspensión de tejidos digeridos en una jeringa de 20 ml con 14 g grupos cánula unida y triturar en una suspensión de células individuales, por lo menos 12 veces. </li><li> Pase la suspensión de tejido a través de un filtro de 70 micras de células y lavar el filtro con 15 ml de mensajería instantánea para detener la digestión. </li><li> Pellet suspensión de células por centrifugación a 400x g durante 5 minutos. </li><li> Aspirar el sobrenadante y el precipitado se resuspende en 3 ml de 0,1% de BSA / PBS. </li><li> Transferencia de suspensión de células a 5 ml tubo de poliestireno de fondo redondo y añadir 22,5 l anti-PECAM-1 anticuerpo conjugado-Dynabeads. Caída en la temperatura ambiente durante 12 minutos. </li><li> Cubra un frasco T75 con 2 ml de 2% de gelatina y el exceso de aspirado de gelatina. Permita que la gelatina seca en su interior la capilla TC durante unos 30 minutos antes de las células de revestimiento. </li><li> Después de la incubación de cuentas es completa (paso 2,10), dividir la suspensión de células por igual en tres tubos Eppendorf y se montan en el MPC. </li><li> Cuando las cuentas se han sedimentado con el MPC (~ 1 minuto), recoger el líquido sobrenadante, retire el tubo de la MPC, lavar los granos con aproximadamente 1 ml 0,1% de BSA / PBS, y volver a montar en el MPC. </li><li> Repetir el lavado cuatro veces (un total de 5 lavados) </li><li> Cuentas resuspender en 1 ml de VascuLife con ENG-Mv vida Factores de Kit y 1 de penicilina / estreptomicina (VL) por tubo, se mezcla bien. </li><li> Placa en una pre-recubiertos T75 frasco y alcanzar un volumen total en cada frasco de 10 ml a la LV. </li><li> Cambiar los medios de comunicación al día siguiente, deje un día lleno de crecimiento, y luego cambiar la mitad de los medios de comunicación todos los días. Cuando las células son&gt; 70-80% confluentes o más (por lo general después de 3-4 días de la cultura), que pueden ser ordenados con anti-ICAM-2 Dynabeads. </li></ol> 3. La preparación de anti-ICAM-2-anticuerpo conjugado Dynabeads <ol><li> Dynabeads anti-ICAM-2-anticuerpo conjugado se utiliza para purificar las células que han sido seleccionados con anti-PECAM-1 Dynabeads anticuerpos conjugados y cultivaron hasta confluencia. Este procedimiento se realiza como se describe para Dynabeads anti-PECAM-1 anticuerpo conjugado (1, arriba), excepto que el anti-ratón ICAM-2 (CD-102) del anticuerpo se utiliza en lugar de anti-PECAM-1 anticuerpo. </li><li> Dynabeads anti-ICAM-2-anticuerpo conjugado se puede almacenar a 4 ° C hastaa 1 mes. </li></ol> 4. Clasificación de las células de ratón de pulmón endoteliales con anticuerpos anti-ICAM-2 Dynabeads <ol><li> Escudo T75 frasco de cultivo de tejidos con gelatina al 2%. </li><li> Aspirar los medios de comunicación de la confluencia con el T75 frasco con células y lavar con 8 ml de PBS. </li><li> Aspirar PBS, añadir 2 ml al 0,05% de tripsina / EDTA y dejar que las células de quitar (unos 5 minutos). Toque en frascos ligeramente para ayudar a separar. </li><li> Cuando las células se han desprendido, añadir 2 ml IM para inhibir las células de la tripsina y la raspadura de separar las células adherentes restantes. Transferencia de suspensión de células a un tubo de 15 ml y centrifugar durante 5 minutos a 400 veces g. </li><li> Aspirar los medios de comunicación y resuspender el sedimento celular en 2 ml de 0,1% de BSA / PBS. </li><li> Transferir a un 5 ml de poliestireno de fondo redondo de tubo y se añaden 10 l anti-ICAM-2 Dynabeads. Caída por 12 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Dividir la suspensión de células en dos tubos de 1,5 ml Eppendorf y se montan en MPC. </li><li> Aspirar el sobrenadante después de cuentas se han adherido durante un minuto. Retire los tubos del MPC y resuspender en cada tubo 1 ml 0,1% de BSA / PBS. Vuelva a colocar el MPC. </li><li> Repetir el lavado cuatro veces (un total de 5 lavados). </li><li> Resuspender cada tubo con 1 ml VL y realizar un recuento de células. </li><li> Células de la placa a 250-350K células por frasco T25 y / o 750K-1 millón de células por frasco T75. </li><li> Alcanzar un volumen de 5 ml VL en frascos T25, y 10 ml en frascos T75. </li><li> Cambiar los medios de comunicación todos los días. Las células pueden ser utilizados para los experimentos en que la cultura llega a cerca del 80% de confluencia, por lo general en 2-3 días. </li></ol> 5. Resultados representante Normalmente, después de 6-7 días a partir de la preparación inicial de las células, que son capaces de obtener unos 1,2 a 1,5 x 10 6 células endoteliales pulmonares de tres crías de 6-8 días de edad. Células típicos de la pantalla "adoquines" morfología con microscopía de luz y VE-cadherina (CD144) manchas en las uniones célula-célula, que es característico de las células endoteliales (Figura 1). La mayoría de los MLECs expresa VE-cadherina y VEGFR2 como lo demuestra el análisis de FACS (Figura 2). Por lo general, los utilizamos para los experimentos dentro de dos semanas después de la inicial de aislamiento LMCE. <img src="/files/ftp_upload/2316/2316fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. El análisis microscópico de monocapa confluente LMCE. (A) Imagen de microscopía de luz muestra la morfología de las células cultivadas empedradas típicas de las células endoteliales. Uniforme de estructuras redondas ubicadas en la zona perinuclear de las células son muchas las partículas magnéticas utilizadas para el aislamiento LMCE. (B) endotelial específico VE-cadherina se localiza en las uniones célula-célula, como se muestra mediante microscopía confocal. Bar es representante de 20μm. <img src="/files/ftp_upload/2316/2316fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2 FACS análisis de MLECs cultivadas con anticuerpos específicos para los marcadores específicos del endotelio:. VE-cadherina (CD144) o VEGFR2, como acusado, seguido por ficoeritrina-anticuerpo secundario conjugado, confirma la identidad del endotelio de MLECs aislados. La línea roja indica isotipo específico de control, la línea verde indica anti-VE-cadherina o anti-VEGFR2 - específicos IgG.

<ol><li>Maruyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+endothelial+cell+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Z+Zellforsch+Mikrosk.+Anat%22%5BJournal%5D)">The human endothelial cell in tissue culture.</a> Z Zellforsch Mikrosk. Anat. 60, 69-79 (1963).</li>
<li>Lim, Y. C., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+murine+heart+and+lung+endothelial+cells+for+in+vitro+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of murine heart and lung endothelial cells for in vitro model systems.</a> Methods Mol Biol. 341, 141-154 (2006).</li>
<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium%3A+I.+Structure%2C+function%2C+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms.</a> Circ Res. 100, 158-173 (2007).</li>
<li>Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Delisser, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+lung+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine lung endothelial cells.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L1096-L1103 (2009).</li>
<li>Miebach, S., Grau, S., Hummel, V., Rieckmann, P., Tonn, J. C., Goldbrunner, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+microvascular+endothelial+cells+from+gliomas+of+different+WHO+grades%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of microvascular endothelial cells from gliomas of different WHO grades.</a> J. Neurooncol. 76, 39-48 (2006).</li>
<li>Demeule, M., Labelle, M., Régina, A., Berthelet, F., Béliveau, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+brain%2C+lung%2C+and+kidney%3A+expression+of+the+multidrug+resistance+P-glycoprotein+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from brain, lung, and kidney: expression of the multidrug resistance P-glycoprotein isoforms.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 281, 827-834 (2001).</li>
<li>Kajimoto, K., Hossen, N., Hida, K., Ohga, N., Akita, H., Hyodo, M., Hida, Y., Harashima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+microvascular+endothelial+cells+from+murine+inguinal+and+epididymal+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of microvascular endothelial cells from murine inguinal and epididymal adipose tissues.</a> J. Immunol. Methods. 357, 43-50 (2010).</li>
<li>Breviario, F., Caveda, L., Corada, M., Martin-Padura, I., Navarro, P., Golay, J., Introna, M., Gulino, D., Lampugnani, M. G., Dejana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+human+vascular+endothelial+cadherin+%287B4%2Fcadherin-5%29%2C+an+endothelium-specific+cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional properties of human vascular endothelial cadherin (7B4/cadherin-5), an endothelium-specific cadherin.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 15, 1229-1239 (1995).</li>
<li>Zachary, I., Gliki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+transduction+mechanisms+mediating+biological+actions+of+the+vascular+endothelial+growth+factor+family%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Signaling transduction mechanisms mediating biological actions of the vascular endothelial growth factor family.</a> Cardiovasc Res. 49, 568-581 (2001).</li>
<li>Diglio, C. A., Grammas, P., Giacomelli, F., Wiener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+heart-derived+endothelial+and+smooth+muscle+cell+cultures%3A+isolation%2C+cloning+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Rat heart-derived endothelial and smooth muscle cell cultures: isolation, cloning and characterization.</a> Tissue Cell. 20, 477-492 (1988).</li>
<li>Petzelbauer, P., Bender, J. R., Wilson, J., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+dermal+microvascular+endothelial+cell+antigen+expression+and+cytokine+responsiveness+in+situ+and+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture.</a> J Immunol. 151, 5062-5072 (1993).</li>
<li>Chrzanowska-Wodnicka, M., Kraus, A. E., Gale, D., White, G. C. 2nd, Vansluys, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+angiogenesis%2C+endothelial+migration%2C+proliferation%2C+and+MAPK+signaling+in+Rap1b-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Defective angiogenesis, endothelial migration, proliferation, and MAPK signaling in Rap1b-deficient mice.</a> Blood. 111, 2647-2656 (2008).</li>
</ol>

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones establecidas por el Colegio Médico de Wisconsin IACUC Comité en virtud del protocolo AUA # 00001206.

Microvascular EC han demostrado ser un modelo útil en muchas áreas de la biología vascular y se cree que son fisiológicamente más relevantes para el estudio (por ejemplo, la angiogénesis) que ampliamente estudiado HUVECs 3. Anteriormente, se ha informado de que microvascular EC se puede obtener de los riñones, el corazón, el tejido adiposo piel, retina, el cerebro, los gliomas, y también de pulmón 2, 4-7, 10, 11. Sin embargo, un método consistente y fiable para el aislamiento de complicaciones microvasculares EC sigue siendo necesaria. El procedimiento que aquí se presenta es una modificación de un protocolo previamente publicado 2, se diferencia de la mayoría de los procedimientos publicados, ya que utiliza los cachorros de animales adultos. Esto es crucial para el éxito de aislamiento como las células de los animales jóvenes tienen un potencial mayor proliferación y cultivos derivados de los tejidos tienden a producir un mayor número de células. Una semana de edad los animales parecen ser óptimo, pero ratones más jóvenes (de un día 4), también se puede utilizar. Además, el número mayor o menor de las crías puede ser utilizado en caso necesario, como hemos tenido éxito en aislar MLECs de un cachorro. Sin embargo, mientras que la escala hacia arriba o hacia abajo el proceso de aislamiento, la densidad celular recubrimiento debe permanecer sin cambios, ya que esto también es fundamental para la proliferación celular. El proceso de purificación de 2 pasos de MLECs usando perlas magnéticas conjugadas primero en anti-PECAM-1 y de anti-ICAM-2 anticuerpos es mucho más eficiente en la obtención de cultivos puros CE de los procedimientos de purificación se ha descrito anteriormente en un solo paso. Este protocolo elimina la necesidad de utilizar técnicas manuales muy laborioso, y centrifugación en gradiente de FACS menos eficientes de ordenación de las células de descartar la contaminación como los fibroblastos, las células sanguíneas y células musculares lisas. La población resultante LMCE se puede utilizar para el análisis in vitro de las respuestas de la angiogénesis, la permeabilidad vascular y la transmigración de leucocitos, cicatrización de heridas, así como el análisis bioquímico de las vías de señalización. Si es necesario, MLECs se puede platear en diferentes superficies, tales como fibronectina cubreobjetos recubiertos de gelatina o por inmunofluorescencia o matrices de electrodos para trans-endotelial de resistencia (TER) mediciones. Resultados obtenidos se pueden comparar directamente con los fenotipos observados en vivo, que es especialmente importante en el contexto de la creciente cantidad de octavos de final y las líneas de ratones transgénicos. La implementación exitosa de este método de análisis in vitro de los mecanismos celulares subyacentes defectos observados en vivo, ya se ha presentado 12.

<table><tbody><tr><td>Tijeras de resorte</td><td>Fine Science Tools</td><td>15032-13</td><td></td></tr><tr><td>pinzas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>catéter 14G</td><td>Fisher Scientific</td><td>1482516N</td><td></td></tr><tr><td>jeringa de 20 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-100G</td><td></td></tr><tr><td>perlas Dynabeads anti-IgG de rata</td><td>Invitrogen</td><td>110.35</td><td></td></tr><tr><td>concentrador de partículas magnéticas (MPC)</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo anti-PECAM-1 de ratón (CD-31)</td><td>BD Biosciences</td><td>553369</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo anti-ICAM-2 de ratón (CD-102)</td><td>BD Biosciences</td><td>553326</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa/Dispasa (C/D)</td><td>Roche Group</td><td>11097113001</td><td>se puede preparar una solución stock de 100 mg/ml y almacenar a -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de piel de bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#G9391-100G</td><td></td></tr><tr><td>Kit completo Vasculife EnGS-Mv (VL)</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL0004</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA al 0,05%</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>colador celular de nailon de 70 &amp;mu;m</td><td>Falcon BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>frasco de cultivo celular de 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Techno Plastic Products</td><td>90076</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento y cultivo de células endoteliales pulmonares de ratones recién nacidos

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Las células endoteliales proporcionar un modelo de investigación útil en muchas áreas de la biología vascular. Desde su primer aislamiento 1, las células endoteliales de vena umbilical (HUVEC) han demostrado que son convenientes, fáciles de obtener y la cultura, y por lo tanto son las células más estudiadas endoteliales. Sin embargo, la investigación se centró en los procesos como los demás la angiogénesis, la permeabilidad o muchos, las células endoteliales microvasculares (EC) es un modelo mucho más fisiológicamente relevantes para el estudio 2. Por otra parte, los CE aislado de ratones knock-out proporcionar una herramienta útil para el análisis de la ex vivo función de las proteínas. Varios métodos para aislar y microvascular cultura EC de origen diferentes han sido reportados hasta la fecha 3-7, pero el aislamiento constante y la cultura de la pura EC sigue siendo un gran problema técnico en muchos laboratorios. Aquí, ofrecemos un protocolo de paso a paso en un método fiable y relativamente fácil de aislar y cultivar células de los pulmones del ratón endotelial (MLECs). En este enfoque, el tejido pulmonar obtenido a partir de 6 - a 8 días de edad los cachorros primero se corta en pedazos, digeridos con colagenasa / dispasa (C / D) y la solución dispersa mecánicamente en una sola célula de la suspensión. MLECS se purificó a partir de la suspensión celular mediante la selección positiva con anti-PECAM-1 anticuerpo conjugado con Dynabeads utilizando un concentrador de partículas magnéticas (MPC). Tales células purificadas se cultivan en cultivo de tejidos recubiertos de gelatina (TC) los platos hasta que se hacen confluentes. En ese momento, las células se purifica utilizando Dynabeads junto a anti-ICAM-2 de anticuerpos. MLECs obtenidos con este protocolo muestran un fenotipo de adoquín, como se visualiza mediante microscopía óptica de contraste de fase, y su fenotipo endotelial ha sido confirmado mediante análisis de FACS con anticuerpos anti-VE-cadherina 8 y 9 VEGFR2 anti-anticuerpos y la tinción de inmunofluorescencia de VE-cadherina. En nuestras manos, este procedimiento de aislamiento de dos etapas consistente y fiable rendimiento de una población pura de MLECs, que puede ser más culta. Este método permitirá a los investigadores para aprovechar el creciente número de eliminatorias y ratones transgénicos que se correlacionan directamente en estudios in vivo con los resultados de los experimentos in vitro realizados en MLECs aisladas y por lo tanto ayudar a revelar los mecanismos moleculares de los fenotipos vasculares observados en vivo.

Aquí se describe un protocolo para el aislamiento y cultivo de las células endoteliales murinas pulmonar. Este método consiste en la disociación mecánica y enzimática del tejido pulmonar, así como un proceso de purificación de 2 pasos con anti-PECAM-1 y anti-ICAM-2 anticuerpos conjugados a perlas magnéticas, lo que produce una población pura de células endoteliales microvasculares su mayoría de origen.

Aislamiento y cultivo de células endoteliales pulmonares de ratones recién nacidos

Las células endoteliales constituyen un modelo de investigación útil en numerosas áreas de la biología vascular. Desde su primer aislamiento 1, las células endoteliales de la vena umbilical humana ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar y cultivar células endoteliales pulmonares de ratones recién nacidos. Esto se logra primero creando una suspensión celular homogénea a partir de pulmones recién extraídos. Finalmente, se pica el tejido y se somete a digestión enzimática, seguido de un enriquecimiento de células endoteliales mediante perlas magnéticas conjugadas con anticuerpo anti P chem uno.El cultivo CETA purifica la población de células endoteliales. Además, mediante el uso de perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos anti I chem dos y la amplificación de estas células en un frasco recubierto con gelatina. Las células endoteliales pulmonares primarias resultantes son principalmente de origen microvascular y expresan marcadores específicos de células endoteliales como TERRIN y VEGF R dos.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el silenciamiento génico por ARNi es que permite utilizar ratones transgénicos para obtener células endoteliales modificadas genéticamente. Además, las células endoteliales obtenidas mediante esta técnica son principalmente de origen microvascular y, como tales, pueden ser más relevantes para ciertas áreas de la investigación vascular. Las células endoteliales obtenidas con este método pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología vascular, como aquellas relacionadas con los mecanismos moleculares de la angiogénesis y la permeabilidad vascular.La demostración visual de esta técnica es fundamental, ya que los pasos de digestión de la cosecha de tejido y lavado de células unidas a perlas son difíciles de aprender. La realización inadecuada de esta técnica puede provocar contaminación por células no endoteliales y baja recuperación y crecimiento celular. Para este protocolo con perlas dyna, prepare 50 mililitros de BSA al 0,1 % en PBS y mezcle mediante vortex hasta que la BSA se disuelva, luego esterilice la solución haciéndola pasar a través de una jeringa de 0,22 micrones.Filtre bajo condiciones estériles en la campana de cultivo celular, re-suspenda los microesferas de Dynabeads anti-IgG de rata y transfiera 200 microlitros a un tubo Eppendorf de 1,5 mililitros. Para lavar las microesferas, coloque el tubo en el concentrador de partículas magnéticas (MPC) y espere un minuto para que las microesferas sedimenten; aspire entonces el sobrenadante. Retire el tubo del MPC y re-suspenda las microesferas en un mililitro de PBS estéril al 0,1 % con BSA.Repita este lavado tres veces más después del cuarto lavado. Retire el tubo del MPC y del Resus. Suspenda las perlas en 500 microlitros de B-S-A-P-B-S al 0,1 %.Añada 10 microlitros de anticuerpo de ratón anti ratón pcam uno al tubo y agite suavemente durante dos horas a temperatura ambiente, como se mostró anteriormente. Lave las perlas cuatro veces con PBS estéril al 0,1 % con BSA. Retire el tubo del MPC y re suspenda.Las perlas en 200 microlitros de BSA-PBS al 0,1 % se almacenan. Esta preparación de perlas Dyna conjugadas con anticuerpo anti P chem uno a cuatro grados Celsius. Para obtener células primarias, anestesiar tres crías de seis a ocho días de edad.Asegúrese de la eficacia de la anestesia pellizcando las colas con pinzas. Diseque los animales de forma secuencial. Primero, sujete la cría a una tabla y retire la piel de la zona torácica.Con tijeras de disección, extirpe la caja torácica para exponer los pulmones. Ahora, extirpe asépticamente los lóbulos pulmonares individuales, teniendo cuidado de no disecar los bronquios ni ningún tejido conectivo visible alrededor de los pulmones.Combine todos los pulmones en DMEM frío con hielo y finalmente sacrifique a las crías. Ahora pase a la cabina de cultivo de tejidos. Retire los lóbulos pulmonares del DMEM y colóquelos en una placa de cultivo de tejidos de 100 milímetros.Aspire el exceso de DMEM con tijeras estériles y pique el tejido. Finalmente, córtelo aproximadamente cien veces para la digestión enzimática. Transfiera la preparación del tejido a 15 mililitros de solución tibia de colagenasa en espacio discal e incube durante 45 minutos a 37 grados Celsius en un rotador con una jeringa de 20 mililitros conectada a una cánula de calibre 14. Pase los agregados del tejido digerido a una suspensión de células individuales.Ahora pase la suspensión celular a través de un filtro celular de 70 micrómetros y lave el filtro con 15 mililitros de Im para detener la reacción de digestión. Para recolectar las células pulmonares, centrifugue a 400 G durante cinco minutos y aspire el sobrenadante. Luego, resuspenda el sedimento celular en tres mililitros de PBS con 0,1 % de BSA y transfiera a un tubo de poliestireno redondo de cinco mililitros.Para aislar las células endoteliales, añada 22,5 microlitros de anticuerpo anti P chem uno conjugado con perlas Dyna y agite suavemente a temperatura ambiente durante 12 minutos. Mientras tanto, recubra un matraz T 75 con dos mililitros de gelatina al 2%. Aspire la solución de gelatina en exceso y déjelo secar al aire dentro de la cabina de cultivo tisular durante aproximadamente media hora. Una vez completada la incubación con las perlas, divida la suspensión celular por igual en tres tubos Fendor y colóquelos en el MPC.Utilizando el sistema MPC, lave las perlas Dyna cinco veces con aproximadamente un mililitro de PBS con 0,1 % de BSA. Después del último lavado, re suspenda las perlas en un mililitro de VAs life por tubo. Mezcle bien combinando todos los tubos. Siembre la preparación de células con perlas Dyna en el matraz T75 pre-codificado y complete el volumen total en el matraz hasta 10 mililitros con VAs life.Ahora coloque los matraces en un incubador con 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius. Cambie el medio al día siguiente, permita un día completo de crecimiento y luego cambie la mitad del medio cada dos días hasta que las células alcancen una confluencia mayor al 70-80%. Para purificar aún más el cultivo celular primario, prepare perlas Dyna conjugadas con anticuerpos como se mostró anteriormente, pero esta vez utilizando el anticuerpo CD102 y Muse I chem dos.Además, recubra un frasco de cultivo de tejidos T 75 con gelatina al 2 % como se mostró anteriormente. Ahora retire el frasco T 75 con las células del incubador. Aspire el medio y lave las células primarias con ocho mililitros de PBS, aspirando después.Añada PBS, dos mililitros de tripsina-EDTA al 0,05 % y deje aproximadamente cinco minutos para que las células se desprendan. Golpee suavemente el frasco para facilitar el desprendimiento celular. Añada dos mililitros de IM para inhibir la tripsina y raspe cualquier célula adherente restante.Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros. Recoga las células por centrifugación durante cinco minutos a 400 ×g, aspire el medio y resuspenda el botón celular en dos mililitros de PBS con 0,1 % de BSA. Transfiera a un tubo de poliestireno de cinco mililitros con fondo redondo y agregue 10 microlitros de anticuerpo anti-ICAM. Incube con perlas Dynabeads durante 12 minutos a temperatura ambiente. Divida la suspensión celular en dos tubos Eppendorf de 1,5 mililitro y coloque en el sistema MPC.Como antes, lave las perlas con un mililitro de PBS-A-B al 0,1 % un total de cinco veces. Ahora, resuspenda cada tubo en un mililitro de medio VAs life y realice un recuento celular. Finalmente, siembre las células a una densidad de 800 a 1000 mil células por matraz T75 en 10 mililitros de medio VAs life. Coloque los matraces en una incubadora de cultivo celular.Cambie el medio cada dos días hasta que los cultivos alcancen aproximadamente el 80 % de confluencia. Las células endoteliales pulmonares de ratón purificadas están listas para ser utilizadas en experimentos. Típicamente, una preparación celular a partir de tres crías de seis a ocho días de edad produce de 1,2 a 1,5 × 10⁶ células endoteliales pulmonares después de una semana en cultivo.Como era de esperar, estas células endoteliales primarias presentan una morfología en empedrado bajo microscopía de luz y también muestran tinción coherente de VE en las uniones entre célula y célula. Mediante este protocolo, la mayoría de las células endoteliales pulmonares de ratón expresan VE coherente y VEGF R dos, como se demuestra mediante análisis de fax. La línea roja indica el control específico de isotipo y la línea verde indica IgG específico anti-VE o anti-VEGF R dos.Al intentar este procedimiento, es importante recolectar únicamente el tejido objetivo, evitar la digestión excesiva de las células y lavar minuciosamente las células unidas a las perlas. Células endoteliales obtenidas. Mediante este procedimiento se pueden realizar ensayos funcionales en el campo de la biología vascular para analizar respuestas relevantes para la angiogénesis y la permeabilidad vascular.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar células endoteliales primarias de ratón utilizando el anticuerpo chem one y el anticuerpo chem two unidos a dyna beeps, y cómo obtener cultivos puros de células endoteliales.

isolation-culture-pulmonary-endothelial-cells-from-neonatal

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este método se describe cómo aislar e inmortalizar las células endoteliales microvasculares de cerebro de ratón. Se describe un protocolo paso a paso a partir de la homogeneización del tejido cerebral, las fases de digestión, la siembra y la inmortalización de las células. Por lo general, toma alrededor de cinco semanas para obtener una homogénea línea inmortalizada de células endoteliales microvasculares.

Generación de una línea murina Inmortalizado microvascular cerebral célula endotelial como<em&gt; In Vitro</em&gt; Barrera hematoencefálica modelo

Los cultivos primarios de cardiomiocitos de ratón son una de las herramientas fundamentales para la investigación de la organización miofibrilar y la función. El siguiente protocolo describe el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos primarios de corazones de ratón neonatales. Los cultivos de cardiomiocitos resultantes pueden usarse posteriormente para una variedad de ensayos biomecánicos, bioquímicos y de células biológica.

Aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales Ratón

Hemos desarrollado una técnica novedosa y reproducibles para aislar los cultivos primarios de células musculares lisas de las arterias pulmonares (PASMC) a partir de ratones tan jóvenes como de P7, permitiendo de ese modo un mejor estudio de las vías de señalización implicadas en la contracción de las células del músculo liso neonatal y relajación.

El aislamiento de la arteria pulmonar células musculares lisas de los ratones recién nacidos

Este video muestra una estrategia fácil y confiable para la preparación de cultivos puros de células endoteliales del cerebro anterior embrionario dentro de 10 a 12 días y será útil para la investigación se centró en muchos aspectos de la angiogénesis cerebral.

Aislamiento y cultivo de células endoteliales del cerebro anterior embrionarias

Las células endoteliales microvasculares cerebrales (BMEC) están interconectadas por proteínas de unión específicas que forman una barrera altamente regulada que separa la sangre y el sistema nervioso central (SNC), la llamada barrera hematoencefálica (BBB). El aislamiento de las células endoteliales microvasculares primarias del cerebro murino, como se discute en este protocolo, permite estudios detallados in vitro de la BHE.

Aislamiento de células primaria murino cerebro endoteliales microvasculares

Las células endoteliales vasculares desempeñan un papel importante en muchos trastornos cardiovasculares importantes. Este artículo describe un método simple para aislar y expandir las células endoteliales de la aorta del ratón sin usar ningún equipo especial. Nuestro protocolo proporciona un medio eficaz para identificar mecanismos en la fisiopatología de las células endoteliales.

Aislamiento y cultivo primario de células endoteliales aórticas de ratón

Este protocolo está preparado para compartir nuestro método de aislamiento de células endoteliales coronarias de ratón con fines de obtención de imágenes o para realizar experimentos de biología molecular.

Aislamiento de células endoteliales de ratón coronaria

En este artículo, las células endoteliales pulmonares primarias se aislaron y cultivaron de ratones neonatos.

Aislamiento de células endoteliales pulmonares primarias de ratón

Aunque es un desafío, el aislamiento de las células endoteliales pulmonares es esencial para los estudios sobre la inflamación pulmonar. El presente protocolo describe un procedimiento para el aislamiento de alto rendimiento y alta pureza de células endoteliales macrovasculares y microvasculares.

Aislamiento y purificación de células endoteliales microvasculares y macrovasculares a partir de muestras derivadas de pulmón

Este protocolo presenta un método basado en citometría de flujo para aislar células epiteliales alveolares tipo II (AECII) viables de pulmones murinos neonatales, juveniles o adultos (infectados o no infectados). Este enfoque permite que estudios moleculares y/o funcionales posteriores de AECII identifiquen sus funciones durante la inflamación e infección pulmonar.

Aislamiento de células epiteliales alveolares tipo II de pulmones murenos neonatales, juveniles y adultos adaptables a entornos experimentales infecciosos

Aprenda a aislar células endoteliales pulmonares de ratones recién nacidos mediante digestión enzimática y purificación con microesferas magnéticas conjugadas con anticuerpos anti-PECAM-1 e ICAM-2.

Aislamiento y cultivo de células endoteliales pulmonares de ratones recién nacidos

Explorar más videos