Name: Descelularización y recelularización de hígados enteros (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-04T17:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Aprende a descelularizar y recelularizar hígados enteros mediante perfusión con detergentes y hepatocitos primarios. Este método permite generar injertos hepáticos funcionales para aplicaciones en trasplantes.

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Los autores desean agradecer a Jack Milwid para el diseño de la cámara de perfusión en vitro. Este trabajo fue apoyado por becas de los NIH de EE.UU., y R01DK59766 R01DK084053 a mi, R00DK080942 de KU, EE.UU. NSF CBET-0853569 de KU y los Hospitales Shriners para niños de BEU (concesión no. 8.503). También reconocemos el apoyo y los Hospitales Shriners para niños.

1. Hígado descelularización <ol><li> La cosecha de un hígado de rata con canalización de la vena portal y el uso del catéter de calibre 18. Salir de la inferior y la vena cava superior abierta. Mantener el órgano hidratado en tampón fosfato salino (PBS) en una placa de Petri de 10 cm. </li><li> Establecer un sistema de perfusión, que consiste en depósito de 8 litros, bomba peristáltica y una trampa de burbujas. </li><li> Llene el sistema de perfusión con solución salina de fosfato y que siga funcionando durante 10 minutos. Rellene PBS en una placa de Petri de 10 cm y reducir la velocidad de flujo de tampón fosfato salino a 1 mL / min. </li><li> Transferir cuidadosamente el hígado cosecha a una solución salina de fosfato llena de 10 cm placa de Petri. </li><li> Continuar con la perfusión PBS durante la noche. </li><li> Iniciar la perfusión con un 0,01% (w / v) de dodecilsulfato sódico (SDS) en agua destilada durante 5 minutos. </li><li> Perfundir con PBS durante 1 hora. </li><li> Repita los pasos 1,6 y 1,7 veces más tres aumentando el tiempo de perfusión de SDS a 10, 15 y 20 en cada momento. </li><li> Continuar la perfusión con un 0,01% (w / v) SDS durante 24 horas. </li><li> Continuar la perfusión con el 0,1% (w / v) SDS durante 24 horas. </li><li> Perfundir con un 0,2% (w / v) SDS durante 3 horas. </li><li> Perfundir con un 0,5% (w / v) SDS durante 3 horas. </li><li> Perfusión con agua destilada durante 15 minutos. </li><li> Perfundir con un 1% (w / v) de Triton X-100 en agua destilada durante 30 minutos para eliminar cualquier ácidos nucleicos obligado. </li><li> Para lavar el hígado descelularizada matriz (DLM), perfundir con PBS durante 2 horas. </li><li> Opcional: Resecar todos los lóbulos, excepto el lóbulo medio. </li><li> Guarde el DLM en una placa Petri limpia y sellada empapado en PBS a 4 º C hasta su utilización (Figura 1). </li><li> Para esterilizar el DLM: 1) Lave el DLM con PBS estéril que contiene 0,1% (v / v) de ácido peracético y el 4% (v / v) de etanol y se incuba durante 3 horas a 4 º C. 2) Lavar con PBS estéril 2 veces. 3) Lavar con PBS estéril que contiene 2% de penicilina-estreptomicina, gentamicina 10ug / ml y 2,5 ug / ml de anfotericina B. Guarde el hígado descelularizada en la misma solución a 4 º C hasta su utilización en experimentos recelularización. </li></ol> 2. Recelularización de descelularizada hígado Matrix <ol><li> Establecer un sistema de perfusión, que consiste en una cámara de perfusión, la bomba peristáltica y una trampa de la burbuja en condiciones estériles. Llene el sistema de perfusión con 200 ml de medio de cultivo, por ejemplo, niveles altos de glucosa DMEM (Sigma), el 10% de suero fetal bovino (Hyclone,), 100 U ml -1 penicilina, y 100 mg mL -1 estreptomicina (Invitrogen). </li><li> Coloque la matriz del hígado descelularizada en la cámara de perfusión y conecte el DLM en el sistema de perfusión a través de la cánula de la vena porta, mientras que la bomba está funcionando a 5 mL / min para evitar la formación de burbujas de aire. </li><li> Permitir la perfusión del medio a través del DLM durante 30 minutos. </li><li> Aislar hepatocitos primarios de una rata adulta con al menos 90% de viabilidad. </li><li> Detener el flujo en el sistema de perfusión e inyecte lentamente 50 millones hepatocitos (en 1-3 ml de medio de cultivo) en el sistema de perfusión a través de la trampa de burbujas. </li><li> Iniciar el flujo de 10 mL / min y recircular el medio durante 10 minutos. </li><li> Repita los pasos 2,5 y 2,6 hasta un total de 200 millones de células se introducen en el DLM (Figura 2) 6. </li><li> Una vez que todas las células son perfundidos en el DLM, recoger la perfusión en cuatro tubos de centrifugación de 50 ml y centrifugar a 600 rpm durante 10 minutos. Descartar el sobrenadante y recoger las pastillas en un solo tubo. Determinar el número de células y la viabilidad a través de la exclusión azul tripán para determinar la eficiencia de la siembra. </li></ol> 3. Cultivo in vitro del injerto hepático Recellularized <ol><li> Establecer un sistema de perfusión, que consiste en una cámara de perfusión, bombas peristálticas, oxigenador y una trampa de la burbuja en condiciones estériles (Figura 3). Llene el sistema de perfusión con 50 ml de medio de cultivo, por ejemplo, E Williams (Sigma), el 5% de suero fetal bovino (Hyclone,), 0,5 U ml -1 de insulina (Eli Lilly), 20 ng ml -1 EGF (Invitrogen) , 14 ng ml -1 glucagón (Bedford Laboratories), 7,5 mg ml -1 de hidrocortisona (Pharmacia), 100 U ml -1 penicilina, y 100 mg mL -1 estreptomicina (Invitrogen). </li><li> Coloque el injerto hepático recellularized en la cámara de perfusión y conecte el DLM en el sistema de perfusión a través de la cánula de la vena porta, mientras que la bomba está funcionando a 5 mL / min para evitar la formación de burbujas de aire. </li><li> Asépticamente cerrar la cámara de perfusión y sella herméticamente para evitar cualquier fuga durante el cultivo. </li><li> Transferir el sistema de perfusión a una incubadora que es de 37 º C y tiene 10% de CO2 y aumentar el caudal de perfusión a 15 ml / min. </li><li> Conecte el oxigenador a un CO 95% O 2 y el 5% 2 tanques de mezcla de gas y establecer el caudal de gas de 0,5 litros / min. Esto debe alcanzar una presión parcial de oxígeno de aproximacióntely 400 mmHg. </li><li> El cultivo puede continuar hasta por 10 días con cambios diarios de medio de cultivo. El medio de cultivo pueden ser incluidos en la muestra todos los días para el monitoreo de las funciones del hígado del injerto como la urea albúmina, y la secreción de ácidos biliares totales. Al final del período de cultivo, el injerto hepático recellularized pueden tomarse muestras para análisis moleculares e histológicos. </li></ol> 4. Los resultados representativos: La descelularización completa de un hígado de la rata lleva alrededor de 72 horas utilizando el protocolo descrito. La matriz resultante conserva el 100% del colágeno fibrilar, el 50% de los glicosaminoglicanos y sólo el 5% del ADN del hígado nativo (Tabla 1) 6. La estructura vascular de la matriz se conserva como se evidencia por la corrosión de fundición y de exploración análisis de microscopía electrónica (Figura 4) 6. La presencia de la microarquitectura vascular en el DLM facilita su repoblación con células con una eficiencia del 96% y su posterior perfusión para el cultivo in vitro. El injerto hepático recellularized se puede cultivar hasta 10 días in vitro y muestra las funciones propias del hígado como se confirma a través de la urea albúmina, y la secreción de ácidos biliares totales (Figura 5) 6. <img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Descelularizada matriz de hígado al final del proceso de descelularización. (A) todo el hígado (b) el lóbulo medio después de la resección. <img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Representación esquemática de la recelularización del DLM. <img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Perfusión configuración del sistema para el cultivo in vitro del injerto hepático recellularized. <img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. La estructura microvascular es retenido en la matriz del hígado descelularizada. Imágenes de la corrosión elenco de a) un hígado normal b) un hígado descelularizada, portal (rojo) y venas (azul) vasculatura. La digitalización de imágenes de microscopía electrónica de la c DLM) un buque, d) una sección con las vías biliares, como los vasos pequeños (flechas), barras de escala (a, b) 5 mm (c, d) 20 micras. <img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Funciones específicas del hígado del injerto hepático recellularized durante la perfusión de la cultura in vitro. una secreción) albúmina (p = 0,5249), b) la producción de urea (p = 0,5271) y c) la secreción de ácidos biliares totales (p = 0,0114). El análisis estadístico de la diferencia entre el experimento y el control se llevó a cabo durante el período de la cultura 10 días por el test de Friedman a = 0.01. Las barras de error representan el SEM (n = 3). <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Fresco Livera </td><td> Descelularizada hígado una matriz </td><td rowspan="2"> los valores de p </td><td rowspan="2"> % De hígado fresco </td></tr><tr><td></td><td> n = 4 </td><td> n = 8 </td></tr><tr><td> Colágeno </td><td rowspan="2"> 0,07 ± 0,01 </td><td rowspan="2"> 0,08 ± 0,03 </td><td rowspan="2"> 0.56 </td><td rowspan="2"> 114% </td></tr><tr><td> (Mg por g de hígado) </td></tr><tr><td> Glicosaminoglicanos </td><td rowspan="2"> 73,1 ± 6,7 </td><td rowspan="2"> 34,2 ± 2,9 </td><td rowspan="2"> 0.004 </td><td rowspan="2"> 47% </td></tr><tr><td> (Mg por g de hígado) </td></tr><tr><td> ADN </td><td rowspan="2"> 14,9 ± 5,6 </td><td rowspan="2"> 0,44 ± 0,08 </td><td rowspan="2"> 3.3 10 -5 </td><td rowspan="2"> 2,9% </td></tr><tr><td> (Mg por g de hígado) </td></tr></tbody></table> Tabla 1. La composición bioquímica de la matriz de hígado descelularizada en comparación con el hígado nativo. a Los valores se representan como media ± sem

<ol><li>Kulig, K. M., Vacanti, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hepatic tissue engineering.</a> Transpl Immunol. 12, 303-310 (2004).</li>
<li>Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biomaterials+as+instructive+extracellular+microenvironments+for+morphogenesis+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering.</a> Nature biotechnology. 23, 47-55 (2005).</li>
<li>Dahl, S. L., Koh, J., Prabhakar, V., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+native+and+engineered+arterial+scaffolds+for+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Decellularized native and engineered arterial scaffolds for transplantation.</a> Cell Transplant. 12, 659-666 (2003).</li>
<li>Schechner, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+a+vascularized+human+skin+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Engraftment of a vascularized human skin equivalent.</a> FASEB J. 17, 2250-2256 (2003).</li>
<li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F., F, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+of+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).</li>
<li>Uygun, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat Med. , (2010).</li>
</ol>

El método descrito aquí descelularización perfusión produce un conjunto de andamios que el hígado tiene la misma estructura bruta y la microarquitectura vascular del hígado nativo. El andamio tiene una composición de la matriz extracelular similar a la del hígado nativo. El método recelularización logra la repoblación de los andamios con células de alta eficiencia y las células permanecen viables y funcionales durante el período de cultivo in vitro de la prueba. Con la adición de las células no parenqu...

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Nima Saeidi
instead of:
Nima Saedi.

Erratum: Decellularization and Recellularization of Whole Livers

<table><tbody><tr><td>Dodecil sulfato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4390</td><td></td></tr><tr><td>Tritón X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Motor digital Masterflex L/S</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07523-80</td><td></td></tr><tr><td>Cabezal estándar de bomba Masterflex L/S</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW- 07013-81</td><td></td></tr><tr><td>Trampa de burbujas</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>130149</td><td></td></tr></tbody></table>

descelularización y recelularización de hígados enteros

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

El hígado es un órgano complejo que requiere una perfusión constante para el suministro de nutrientes y oxígeno y la eliminación de los residuos con el fin de sobrevivir a una. Los esfuerzos para recrear o simular la microestructura del hígado con motivos up approach utilizando ingeniería de tejidos y técnicas de microfabricación no han tenido éxito hasta ahora debido a este reto de diseño. Además, los biomateriales sintéticos usados ​​para crear los andamios para aplicaciones de ingeniería de los tejidos del hígado se han limitado en la inducción de la regeneración y reparación de tejidos en gran parte debido a la falta de motivos de células específicas de unión que podría inducir a las funciones de las células adecuadas 2. Descelularizada tejidos nativos como los vasos sanguíneos y la piel 3 4 en el otro lado se han encontrado muchas aplicaciones en la ingeniería de tejidos, y han proporcionado una solución práctica a algunos de los desafíos. La ventaja de la matriz descelularizada nativos es que conserva, en cierta medida, la composición original, y la microestructura, por lo tanto, la mejora de la adhesión celular y la reorganización 5. En este trabajo se describen los métodos para realizar la perfusión-descelularización del hígado, de tal manera que un hígado intacto bioscaffold que conserva la estructura de los vasos sanguíneos principales se obtiene. Además, se describen los métodos para recellularize estas matrices biodegradables para adultos con hepatocitos primarios, la creación de un injerto de hígado que es funcional in vitro, y tiene el acceso de los buques necesarios para el trasplante de vivo.

Descelularización perfusión es una técnica novedosa para producir andamios todo hepática que conserva la composición del órgano de la matriz extracelular y la microarquitectura. Aquí, el método de preparación de andamios todo órgano con descelularización perfusión y posterior repoblación con hepatocitos se describe. Los injertos de hígado funcionales y trasplantables se pueden generar con esta técnica.

Descelularización y recelularización de hígados enteros

El hígado es un órgano complejo que requiere una perfusión constante para el suministro de nutrientes y oxígeno, así como la eliminación de desechos, a fin de sobrevivir1. Los esfuerzos para ...

El objetivo general de este procedimiento es preparar injertos hepáticos recellularizados mediante el uso de matriz hepática descelularizada. Esto se logra primero canulando un hígado donante. Luego, el órgano se descelulariza mediante perfusión con una serie de soluciones detergentes.La revascularización de la matriz hepática descelularizada se lleva a cabo entonces introduciendo hepatocitos primarios adultos mediante perfusión. Finalmente, se utiliza un sistema de perfusión in vitro para cultivar el injerto hepático celularizado. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la función hepática de los injertos redimensionados in vitro mediante la medición de la secreción de albúmina, urea y ácidos biliares totales en el medio de perfusión.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la fabricación de andamios mediante biomateriales sintéticos y técnicas tradicionales de ingeniería de tejidos, es que, en mi opinión, se debe a la presencia de una composición de matriz extracelular específica del tejido. El andamio descelularizado por perfusión también posee la microarquitectura específica del tejido, como la estructura vascular. La presencia de la estructura vascular nos permite reintroducir las células en el andamio de manera más uniforme.Además, nos permite perfundirlo de manera uniforme con nutrientes para mejorar la supervivencia celular. La parte de desaceleración del protocolo será demostrada por Nima junto con el becario posdoctoral en nuestro laboratorio. La parte de reorganización será demostrada por Gabriel Price, quien también es becario posdoctoral.Su trabajo se centra en la industrialización de estos injertos. Para realizar la descelularización por perfusión, comience por extraer un hígado de rata mediante la canulación de la vena porta. Utilizando un catéter de calibre 18, deje abiertas la vena cava inferior y la vena cava superior. Mantenga el órgano hidratado en solución salina tamponada con fosfatos o PBS en una placa de Petri de 10 centímetros.A continuación, prepare un sistema de perfusión que conste de un depósito de ocho litros, una bomba peristáltica y un trampa de burbujas. Llene el sistema de perfusión con solución salina tamponada con fosfato o PBS y manténgalo en funcionamiento durante 10 minutos. Luego, llene una placa de Petri de 10 centímetros con PBS y reduzca la velocidad de flujo del tampón a 1,2 mililitros por minuto.Transfiera cuidadosamente el hígado recolectado al recipiente de Petri con PBS y deje que se perfunda durante la noche. Al día siguiente, perfunda el hígado con sulfato de sodio ESAL al 0,01 % o SDS en agua destilada durante cinco minutos.Luego, cambie nuevamente a PBS durante una hora. Repita los pasos de perfusión con SDS y PBS otras tres veces, aumentando el tiempo de perfusión con SDS a 10, 15 y finalmente 20 minutos. A continuación, realice la perfusión del hígado con la siguiente serie: 0,01 % SDS durante 24 horas.0.1% SDS durante 24 horas. 0.2% SDS durante tres horas, 0.5% SDS durante tres horas. Agua destilada durante 15 minutos, 1% Triton X-100 en agua destilada durante 30 minutos, lo que eliminará cualquier ácido nucleico unido.Y finalmente, PBS durante dos horas, lo que lavará la matriz hepática descelularizada o DLM después de que la perfusión haya finalizado si se desea; reseque todos los lóbulos excepto el lóbulo medio. Almacene la DLM en una placa de Petri limpia y sellada en PBS a cuatro grados Celsius hasta que esté lista para su uso para esterilizar la DLM. Lávela con PBS estéril que contenga ácido peracético al 0,1% y etanol al 4% e incúbele durante tres horas a cuatro grados Celsius.A continuación, lave el MHD dos veces con PBS estéril. Luego, con PBS que contenga 2 % de penicilina-estreptomicina, 10 microgramos por mililitro de gentamicina y 2,5 microgramos por mililitro de anfotericina B. Almacene el hígado descelularizado en la misma solución a cuatro grados Celsius hasta que esté listo para su uso en experimentos de recelularización.Dos, cellularizar una matriz hepática descelularizada bajo una campana de cultivo de tejidos. Comience con un sistema de perfusión similar al utilizado para descelularizar el hígado. Llene el sistema de perfusión con 200 mililitros de medio de cultivo, como DMEM con alta glucosa, 10% de suero bovino fetal, 100 unidades por mililitro de penicilina y 100 microgramos por mililitro de estreptomicina.Coloque el DLM en la cámara de perfusión y conéctelo al sistema de perfusión a través de la cánula de la vena porta mientras la bomba funciona a cinco mililitros por minuto. Para evitar la formación de burbujas de aire, permita que el medio perfunda el DLM durante 30 minutos. A continuación, detenga el flujo en el sistema de perfusión e inyecte lentamente 50 millones de hepatocitos aislados de una rata adulta en el sistema de perfusión a través del trampa de burbujas.Reanude el flujo a 10 mililitros por minuto y recircule el medio durante 10 minutos. Detenga nuevamente el flujo del medio. Inyecte 50 millones adicionales de hepatocitos.Luego, reinicie el flujo nuevamente a 10 mililitros por minuto. Repita este procedimiento hasta que se hayan introducido un total de 200 millones de hepatocitos en el DLM. Una vez que todas las células hayan sido inyectadas en el DLM, recoja el efluente en tubos cónicos de 50 mililitros y centrifugue a 800 RPM durante cinco minutos.Deseche los sobrenadantes y combine los sedimentos en un solo tubo. Determine el número de células y su viabilidad mediante exclusión con azul de tripano. Para establecer la eficiencia de siembra en cultivo.Un injerto hepático celularizado. Configure un sistema de perfusión estéril que incluya un oxigenador. Llene el sistema de perfusión con 50 mililitros de medio de cultivo, como Williams E con 5% PBS, 0,5 unidades por mililitro de insulina.20 nanogramos por mililitro de EGF, 14 nanogramos por mililitro de glucagón, 7,5 microgramos por mililitro de hidrocortisona, 100 unidades por mililitro de penicilina y 100 microgramos por mililitro de estreptomicina. Coloque el injerto hepático celularizado en la cámara de perfusión y conéctelo al sistema de perfusión a través de la cánula de la vena porta mientras la bomba funciona a cinco mililitros por minuto.Para evitar la formación de burbujas de aire, cierre asépticamente la cámara de perfusión y séllela herméticamente para evitar cualquier fuga durante el cultivo. Incube el sistema de perfusión a 37 grados Celsius con 10% dióxido de carbono y aumente la velocidad de flujo de perfusión a 15 mililitros por minuto. Conecte el oxigenador a un tanque con una mezcla de gases de 95% oxígeno y 5% dióxido de carbono, y ajuste la velocidad de flujo de gas a 0,5 litros por minuto.Esto debería lograr una presión parcial de oxígeno de aproximadamente 400 milímetros de mercurio. Continúe el cultivo hasta por 10 días con cambios diarios del medio de cultivo. Muestree el medio diariamente para la secreción de albúmina, urea y ácidos biliares totales con el fin de monitorear las funciones hepáticas del injerto al final del período de cultivo.Tome una muestra del injerto hepático celularizado para análisis molecular e histológico. La descelularización completa de un hígado de rata lleva aproximadamente 72 horas, utilizando el protocolo descrito.La matriz resultante retiene el 100 % del colágeno fibrilar, el 50 % de los glucosaminoglicanos y solo el 5 % del ADN del hígado nativo. La estructura vascular de la matriz se conserva, como lo demuestran el análisis mediante moldes de corrosión y microscopía electrónica de barrido. La presencia de la microarquitectura vascular dentro de la MHD facilita su repoblación con células con una eficiencia del 96 % y su posterior perfusión.Para el cultivo in vitro, el injerto hepático puede cultivarse hasta 10 días in vitro y muestra funciones hepáticas adecuadas, confirmadas mediante la secreción de albúmina, urea y ácidos biliares totales. Entonces, después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo descelularizar y recelularizar todo el hígado.

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Investigación

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