Descelularización y recelularización de hígados enteros

El objetivo general de este procedimiento es preparar injertos hepáticos recellularizados mediante el uso de matriz hepática descelularizada. Esto se logra primero canulando un hígado donante. Luego, el órgano se descelulariza mediante perfusión con una serie de soluciones detergentes.

La revascularización de la matriz hepática descelularizada se lleva a cabo entonces introduciendo hepatocitos primarios adultos mediante perfusión. Finalmente, se utiliza un sistema de perfusión in vitro para cultivar el injerto hepático celularizado. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la función hepática de los injertos redimensionados in vitro mediante la medición de la secreción de albúmina, urea y ácidos biliares totales en el medio de perfusión.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la fabricación de andamios mediante biomateriales sintéticos y técnicas tradicionales de ingeniería de tejidos, es que, en mi opinión, se debe a la presencia de una composición de matriz extracelular específica del tejido. El andamio descelularizado por perfusión también posee la microarquitectura específica del tejido, como la estructura vascular. La presencia de la estructura vascular nos permite reintroducir las células en el andamio de manera más uniforme.

Además, nos permite perfundirlo de manera uniforme con nutrientes para mejorar la supervivencia celular. La parte de desaceleración del protocolo será demostrada por Nima junto con el becario posdoctoral en nuestro laboratorio. La parte de reorganización será demostrada por Gabriel Price, quien también es becario posdoctoral.

Su trabajo se centra en la industrialización de estos injertos. Para realizar la descelularización por perfusión, comience por extraer un hígado de rata mediante la canulación de la vena porta. Utilizando un catéter de calibre 18, deje abiertas la vena cava inferior y la vena cava superior. Mantenga el órgano hidratado en solución salina tamponada con fosfatos o PBS en una placa de Petri de 10 centímetros.

A continuación, prepare un sistema de perfusión que conste de un depósito de ocho litros, una bomba peristáltica y un trampa de burbujas. Llene el sistema de perfusión con solución salina tamponada con fosfato o PBS y manténgalo en funcionamiento durante 10 minutos. Luego, llene una placa de Petri de 10 centímetros con PBS y reduzca la velocidad de flujo del tampón a 1,2 mililitros por minuto.

Transfiera cuidadosamente el hígado recolectado al recipiente de Petri con PBS y deje que se perfunda durante la noche. Al día siguiente, perfunda el hígado con sulfato de sodio ESAL al 0,01 % o SDS en agua destilada durante cinco minutos.

Luego, cambie nuevamente a PBS durante una hora. Repita los pasos de perfusión con SDS y PBS otras tres veces, aumentando el tiempo de perfusión con SDS a 10, 15 y finalmente 20 minutos. A continuación, realice la perfusión del hígado con la siguiente serie: 0,01 % SDS durante 24 horas.

0.1% SDS durante 24 horas. 0.2% SDS durante tres horas, 0.5% SDS durante tres horas. Agua destilada durante 15 minutos, 1% Triton X-100 en agua destilada durante 30 minutos, lo que eliminará cualquier ácido nucleico unido.

Y finalmente, PBS durante dos horas, lo que lavará la matriz hepática descelularizada o DLM después de que la perfusión haya finalizado si se desea; reseque todos los lóbulos excepto el lóbulo medio. Almacene la DLM en una placa de Petri limpia y sellada en PBS a cuatro grados Celsius hasta que esté lista para su uso para esterilizar la DLM. Lávela con PBS estéril que contenga ácido peracético al 0,1% y etanol al 4% e incúbele durante tres horas a cuatro grados Celsius.

A continuación, lave el MHD dos veces con PBS estéril. Luego, con PBS que contenga 2 % de penicilina-estreptomicina, 10 microgramos por mililitro de gentamicina y 2,5 microgramos por mililitro de anfotericina B. Almacene el hígado descelularizado en la misma solución a cuatro grados Celsius hasta que esté listo para su uso en experimentos de recelularización.

Dos, cellularizar una matriz hepática descelularizada bajo una campana de cultivo de tejidos. Comience con un sistema de perfusión similar al utilizado para descelularizar el hígado. Llene el sistema de perfusión con 200 mililitros de medio de cultivo, como DMEM con alta glucosa, 10% de suero bovino fetal, 100 unidades por mililitro de penicilina y 100 microgramos por mililitro de estreptomicina.

Coloque el DLM en la cámara de perfusión y conéctelo al sistema de perfusión a través de la cánula de la vena porta mientras la bomba funciona a cinco mililitros por minuto. Para evitar la formación de burbujas de aire, permita que el medio perfunda el DLM durante 30 minutos. A continuación, detenga el flujo en el sistema de perfusión e inyecte lentamente 50 millones de hepatocitos aislados de una rata adulta en el sistema de perfusión a través del trampa de burbujas.

Reanude el flujo a 10 mililitros por minuto y recircule el medio durante 10 minutos. Detenga nuevamente el flujo del medio. Inyecte 50 millones adicionales de hepatocitos.

Luego, reinicie el flujo nuevamente a 10 mililitros por minuto. Repita este procedimiento hasta que se hayan introducido un total de 200 millones de hepatocitos en el DLM. Una vez que todas las células hayan sido inyectadas en el DLM, recoja el efluente en tubos cónicos de 50 mililitros y centrifugue a 800 RPM durante cinco minutos.

Deseche los sobrenadantes y combine los sedimentos en un solo tubo. Determine el número de células y su viabilidad mediante exclusión con azul de tripano. Para establecer la eficiencia de siembra en cultivo.

Un injerto hepático celularizado. Configure un sistema de perfusión estéril que incluya un oxigenador. Llene el sistema de perfusión con 50 mililitros de medio de cultivo, como Williams E con 5% PBS, 0,5 unidades por mililitro de insulina.

20 nanogramos por mililitro de EGF, 14 nanogramos por mililitro de glucagón, 7,5 microgramos por mililitro de hidrocortisona, 100 unidades por mililitro de penicilina y 100 microgramos por mililitro de estreptomicina. Coloque el injerto hepático celularizado en la cámara de perfusión y conéctelo al sistema de perfusión a través de la cánula de la vena porta mientras la bomba funciona a cinco mililitros por minuto.

Para evitar la formación de burbujas de aire, cierre asépticamente la cámara de perfusión y séllela herméticamente para evitar cualquier fuga durante el cultivo. Incube el sistema de perfusión a 37 grados Celsius con 10% dióxido de carbono y aumente la velocidad de flujo de perfusión a 15 mililitros por minuto. Conecte el oxigenador a un tanque con una mezcla de gases de 95% oxígeno y 5% dióxido de carbono, y ajuste la velocidad de flujo de gas a 0,5 litros por minuto.

Esto debería lograr una presión parcial de oxígeno de aproximadamente 400 milímetros de mercurio. Continúe el cultivo hasta por 10 días con cambios diarios del medio de cultivo. Muestree el medio diariamente para la secreción de albúmina, urea y ácidos biliares totales con el fin de monitorear las funciones hepáticas del injerto al final del período de cultivo.

Tome una muestra del injerto hepático celularizado para análisis molecular e histológico. La descelularización completa de un hígado de rata lleva aproximadamente 72 horas, utilizando el protocolo descrito.

La matriz resultante retiene el 100 % del colágeno fibrilar, el 50 % de los glucosaminoglicanos y solo el 5 % del ADN del hígado nativo. La estructura vascular de la matriz se conserva, como lo demuestran el análisis mediante moldes de corrosión y microscopía electrónica de barrido. La presencia de la microarquitectura vascular dentro de la MHD facilita su repoblación con células con una eficiencia del 96 % y su posterior perfusión.

Para el cultivo in vitro, el injerto hepático puede cultivarse hasta 10 días in vitro y muestra funciones hepáticas adecuadas, confirmadas mediante la secreción de albúmina, urea y ácidos biliares totales. Entonces, después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo descelularizar y recelularizar todo el hígado.