Name: La medición cuantitativa de la translocación de GLUT4 a la membrana plasmática por citometría de flujo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: Aprende a cuantificar la translocación de GLUT4 a la membrana plasmática en mioblastos mediante citometría de flujo. Este protocolo permite estudiar la respuesta a insulina y trastornos metabólicos.

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Este trabajo fue apoyado por becas de la señora Graham Clifford pastor White Dotado Fondo de Investigación y el NIH (AR059838) a CB, de los NIH (AR052791, AR044387-ARRA, y NS063298) de LTT, y por el Colegio Baylor de Medicina de Citometría y clasificación de células básicas con financiamiento de los NIH (CNRR S10RR024574, NIAID AI036211, y NCI P30CA125123). El contenido es responsabilidad exclusiva de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los NIH.

1. La tinción de células <ol><li> Prepare las células. Las células deben ser utilizados al mismo tiempo en activo crecimiento (60 - 80% de confluencia). Suero de comer a las células durante la noche, las células de la placa de ellas de 0,1 millones de dólares y en 0,5 ml de medio libre de suero en una placa de 24 pozos y colocar en la incubadora (37 ° C, 5% de CO 2) durante 30 minutos - 2 horas para recuperarse de tripsina. </li><li> Mezclar los anticuerpos primarios y secundarios. Mix (5 L de primaria de anticuerpos anti-GLUT4 con 1 l de pollo secundario de cabra anti-IgG conjugado con AlexaFluor 488) x número de pozos. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente, en la oscuridad. </li><li> Prepare una acción 2X de trabajo de la insulina mediante la dilución en medio. </li><li> Comprobar si las células se han adherido o no. </li><li> Suavemente agregar la mezcla de anticuerpos l 6 y 0,5 ml de 2X sus acciones de trabajo de la insulina para los pozos que contienen las células. Evitar cualquier turbulencia del medio. Incubar (37 ° C, 5% CO 2) durante 30 minutos, en la oscuridad. </li><li> Fijar las células mediante la adición de 0,5 ml de PBS + 1% PFA en cada pocillo, sin agitar las células. Incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente, en la oscuridad. </li><li> Si las células se han adherido a los pozos, suavemente levantar con una grúa móvil. Transferencia de las células (1 ml en total) en los tubos que caben en el citómetro de flujo y se centrifuga para sedimentar las células. </li><li> Lavar el precipitado dos veces con 1 ml de PBS y se resuspenden en 0,4 ml de PBS + 1% PFA. En este punto, las células pueden ser envueltos en papel de aluminio y se almacena en el refrigerador (4-8 ° C) o llevado al citómetro de flujo para la adquisición de datos inmediata. </li></ol> 2. Adquisición de Datos <ol><li> Establecer una puerta amplia en torno a las células vivas en la dispersión lateral (SSC) en comparación con el panel delantero de dispersión (FCS). Use un tubo negativo (células no tratadas con insulina o las células "manchado" con un control de isotipo) para establecer el parámetro FL1. Asegúrese de que su pico está completamente en el panel, no se cortan en la parte inferior. </li><li> Adquisición de datos de al menos 10.000 células por tubo. </li></ol> 3. Análisis de Datos <ol><li> Dibuja una puerta alrededor de las células vivas en la cooperación Sur-Sur vs FSC panel (fig. 1A). Parcela los histogramas de 488 AlexaFluor intensidad de fluorescencia en función del número de células dentro de la puerta de células vivas (fig. 1B). Se puede superponer diferentes histogramas para visualizar las diferencias, sino para cuantificar, determinar la intensidad de fluorescencia media y la mediana para cada población de células y utilizar estos números para su comparación (fig. 1C). </li><li> Normalizar los datos con el valor obtenido en ausencia de insulina, como se muestra en las figuras 1C y 1D. </li></ol> 4. Resultados representante En mioblastos aislados de un individuo sano (sin resistencia a la insulina), la insulina provoca una translocación dependiente de la dosis de GLUT4 desde el citoplasma a la membrana plasmática (Figura 1, izquierda). Por el contrario, la insulina no induce la translocación de GLUT4 a la membrana plasmática de mioblastos aislados de pacientes con resistencia a la insulina (Figura 1, derecha). <img src="/files/ftp_upload/2429/2429fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Ejemplo de un experimento de tinción. Mioblastos fueron aisladas de un donante sin resistencia a la insulina (izquierda) y de un paciente con resistencia a la insulina (derecha). A, SSC (dispersión lateral) frente a FCS (forward scatter) parcela con una verja alrededor de las células vivas. B, células cerradas en A, teñidas con el anticuerpo contra un epítopo externo de GLUT4, y dejó sin estimular (rojo) o estimuladas con insulina 1 nm (azul), 10 nM (naranja), o 100 nm (verde). Para mayor claridad, la figura, sólo se muestran los datos con y sin insulina 100 nM para las células con resistencia a la insulina. C, media de intensidad de fluorescencia (MFI) de los histogramas se muestra en la B se normalizaron a la IMF de las células sin estimular la izquierda (no insulina). D, Parcelas de la normalización de datos de las IFM de los histogramas se muestra en la B.

<ol><li>Zhao, F. Q., Keating, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+and+genomics+of+glucose+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Functional properties and genomics of glucose transporters.</a> Curr. Genomics. 8, 113-128 (2007).</li>
<li>Karnieli, E., Armoni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+the+insulin-responsive+glucose+transporter+GLUT4+gene%3A+from+physiology+to+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of the insulin-responsive glucose transporter GLUT4 gene: from physiology to pathology.</a> Am. J. Endocrinol. Metab. 295, 38-45 (2008).</li>
<li>Graham, T. E., Kahn, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+alterations+of+glucose+transport+and+molecular+mechanisms+of+intertissue+communication+in+obesity+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Horm.+Metab.+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific alterations of glucose transport and molecular mechanisms of intertissue communication in obesity and type 2 diabetes.</a> Horm. Metab. Res. 39, 717-721 (2007).</li>
<li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J. Immunol. Methods. 294, 15-22 (2004).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutellingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labeled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V.</a> J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).</li>
<li>Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+analysis+in+flow+cytometry%3A+the+future+just+started%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Data analysis in flow cytometry: the future just started.</a> Cytometry A. 77, 705-713 (2010).</li>
</ol>

Hemos demostrado una técnica rápida para la cuantificación de la translocación de GLUT4 desde el citoplasma a la membrana plasmática de las células por citometría de flujo. GLUT4 es sólo transitoriamente expresado en la membrana plasmática de las células y la endocitosis es. Dado que los anticuerpos unidos permanecen unidos a la GLUT4, incluso durante la endocitosis, la señal de fluorescencia proporciona la cantidad total de GLUT4 que fue expuesto en la membrana plasmática durante la duración elegida de incubación en presencia de insulina. Esta técnica también se puede aplicar al estudio de la translocación de otras proteínas a partir de un compartimento intracelular a la membrana plasmática, a condición de un anticuerpo bien dirigido a un epítopo externa de la proteína de interés está disponible. Por ejemplo, un ensayo similar se utiliza hoy día para evaluar la tasa de la degranulación de los linfocitos T citotóxicos y los linfocitos citolíticos naturales mediante la medición de la translocación de CD107a de su membrana plasmática 4,5. La translocación de fosfatidilserina en la cara interna de la membrana plasmática en la parte externa de la apoptosis o necrosis celular también puede ser detectada mediante citometría de flujo, utilizando fluoróforo marcado con Anexina V 6. Además de la rapidez de la prueba, la citometría de flujo presenta la ventaja de permitir el estudio de la translocación de proteínas en la membrana plasmática en las poblaciones de células mixtas. De hecho, se puede combinar la tinción de los marcadores subconjunto de células y la proteína de interés, seguida por la adquisición de datos en un citómetro de flujo multi-láser 7. Las cantidades de anticuerpos indicados en el párrafo 1.2 del protocolo son un punto de partida, le recomendamos que se valora su anticuerpos con las células de interés para determinar la concentración de anticuerpos mínima que le da una señal máxima. Una buena gama de partida para la primaria de anticuerpos anti-humanos GLUT4 se ha utilizado en este caso sería l 1.10 por tubo (es decir, anticuerpos 0,2-2 mg por tubo), cada tubo que contiene no más de 1 millón de células. Para otros anticuerpos primarios, consulte las instrucciones del proveedor. Normalización de los datos es necesario que la autofluorescencia de las células puede variar de un donante a otro y de experimento a experimento.

<table><tbody><tr><td>Anticuerpos anti-humanos GLUT4</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-1606</td><td>Contra un epítopo externo de GLUT4</td></tr><tr><td>Anticuerpo de pollo anti-IgG de cabra conjugado con AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21467</td><td></td></tr><tr><td>Insulina humana recombinante</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>Elevadores de células</td><td>VWR international</td><td>29942-118</td><td>Cortados para ajustarse a los pocillos</td></tr><tr><td>Tubos de 5 ml para FACS</td><td>VWR international</td><td>60819-138</td><td>Adecuados para todas las máquinas BD</td></tr></tbody></table>

la medición cuantitativa de la translocación de glut4 a la membrana plasmática por citometría de flujo

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

La glucosa es la principal fuente de energía para el cuerpo, lo que requiere la regulación constante de su concentración en la sangre. La liberación de insulina por el páncreas produce insulina, la captación de glucosa por los tejidos sensibles, especialmente el cerebro, músculo esquelético, y los adipocitos. Los pacientes que sufren de diabetes tipo 2 y / o la obesidad a menudo desarrollan resistencia a la insulina y son incapaces de controlar su homeostasis de la glucosa. Nuevos conocimientos sobre los mecanismos de resistencia a la insulina puede proporcionar nuevas estrategias de tratamiento para la diabetes tipo 2. La familia de transportadores de glucosa GLUT se compone de trece miembros distribuidos en los diferentes tejidos en todo el cuerpo 1. Tipo de transportador de glucosa 4 (GLUT4) es el principal transportador que la absorción media de glucosa por los tejidos sensibles a la insulina, como el músculo esquelético. Tras la unión de la insulina a su receptor, vesículas que contienen GLUT4 translocación desde el citoplasma a la membrana plasmática, induciendo la captación de glucosa. Reducción de la translocación de GLUT4 es una de las causas de la resistencia a la insulina en la diabetes tipo 2 2,3. La translocación de GLUT4 desde el citoplasma a la membrana plasmática se puede visualizar mediante inmunocitoquímica, utilizando fluoróforos conjugados GLUT4 anticuerpos específicos. Aquí se describe una técnica para cuantificar la cantidad total de la translocación de GLUT4 a la membrana plasmática de las células durante un período elegido, por citometría de flujo. Este protocolo es rápida (menos de 4 horas, incluyendo la incubación con insulina) y permite el análisis de tan sólo 3.000 celdas o hasta 1 millón de células por condición en un solo experimento. Se basa en anticuerpos anti-GLUT4 dirigido a un epítopo externo del transportador que se unen a él tan pronto como se expone al medio extracelular después de la translocación a la membrana plasmática.

Este protocolo describe una técnica rápida para cuantificar la translocación de GLUT4 desde el citoplasma a la membrana plasmática de las células por citometría de flujo.

La medición cuantitativa de la translocación de GLUT4 a la membrana plasmática por citometría de flujo

La glucosa es la principal fuente de energía para el organismo, lo que requiere una regulación constante de su concentración en sangre. La liberación de insulina por parte del páncreas induce...

El objetivo general de este procedimiento es detectar la translocación de GLUT4 hacia la membrana plasmática de células de mamífero en respuesta a la exposición a insulina. Primero, se siembran mioblastos privados de suero, que poseen únicamente la proteína GLUT4 intravesicular, en una placa de cultivo de 24 pocillos con un anticuerpo contra un epítopo externo de GLUT4. Luego, se añade un anticuerpo secundario marcado con un fluoróforo, previamente incubado, a las células, seguido de insulina.La activación de los receptores de insulina en la superficie de las células provoca la translocación de glute cuatro hacia la superficie de la membrana plasmática. Luego, glute cuatro es reconocido por los anticuerpos presentes en el medio. En este momento, las células pueden fijarse y la intensidad de la tinción fluorescente puede medirse mediante citometría de flujo.Este método puede utilizarse para estudiar la translocación de GLUT4 y el metabolismo de la glucosa, pero también puede aplicarse a otros sistemas, como la desgranulación de células NK mediante la exposición de CD107a en la membrana. Para este procedimiento, es importante utilizar células que estén en crecimiento activo o que tengan una confluencia del 60 al 80 % y que hayan sido privadas de suero durante la noche. Después de recolectar las células mediante tripsinización, lávese y resuspéndanse en medio de crecimiento habitual a una concentración de 200 000 células por mililitro; plaque las células en una placa de 24 pocillos a 0,1 millones por 500 microlitros por pocillo. A continuación, incúbese las células durante una hora a 37 °C para permitir que se recuperen de la tripsina.Mientras tanto, mezcle el anticuerpo primario anti glute cuatro y el anticuerpo secundario de pollo anti IgG conjugado con Alexa Fluor 4 8 8 en una proporción de cinco a uno, calcule el volumen final necesario, teniendo en cuenta que se utilizarán 10 microlitros de la mezcla de anticuerpos para cada pozo. Incube la mezcla de anticuerpos durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad mientras se prepara la mezcla. Prepare un stock de trabajo dos veces concentrado de insulina diluyéndola a la concentración deseada en medio de crecimiento.Una vez que las células hayan incubado durante una hora, retírelas del incubador. Añada suavemente 10 microlitros de solución de anticuerpo a cada pocillo que contenga células. Asegúrese de dejar al menos un pocillo sin teñir.Esta muestra negativa se utilizará posteriormente para configurar el citómetro de flujo. A continuación, agregue 500 microlitros del stock de insulina al doble a cada pocillo para inducir la translocación de glute cuatro hacia la superficie celular e incube la placa durante 30 minutos a 37 grados Celsius en la oscuridad. Después de retirar las células del incubador, fíjelas agregando un mililitro de PBS con 1 %PFA a cada pocillo e incube la placa durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad; utilizando un levantador de células, desprenda suavemente las células fijadas del fondo de los pocillos y transfiéralas desde cada pocillo a un tubo individual para citometría.Centrifugar los tubos para hacer un pellet de las células, luego vortexear y resuspenderlas en un mililitro de PBS para lavar y centrifugar las células nuevamente; repetir el lavado. Paso dos veces. Desechar el sobrenadante entre cada lavado.Finalmente, resuspenda las células lavadas en 400 microlitros de PBS con 1% de PFA. Ahora las células pueden analizarse para determinar la expresión superficial de glute cuatro en el citómetro de flujo. Una vez que haya llegado al citómetro de flujo con sus muestras, comience a adquirir datos a partir del control sin teñir.Defina una puerta amplia para células vivas utilizando los parámetros de dispersión frontal y lateral. Luego, ajuste la configuración de voltaje para el canal FL1 de modo que el pico negativo sea visible dentro de los márgenes del histograma. Una vez establecidos estos parámetros, analice cada muestra experimental registrando al menos 10.000 eventos viables por tubo.Este histograma muestra la sobreexpresión de la tinción de glutamato en la superficie o de los mioblastos expuestos a 0, 1, 10 o 100 nanomolares de insulina. En contraste, los mioblastos de individuos resistentes a la insulina no logran sobreexpresar glu cuatro en respuesta a 100 nanomolares de insulina. Si las intensidades fluorescentes medias de las células estimuladas se normalizan respecto a las de las células no estimuladas, es posible comparar directamente las IMF de mioblastos sanos y resistentes a la insulina.Mediante este procedimiento, las células pueden ser marcadas con marcadores adicionales de superficie o intracelulares para identificar diferentes subpoblaciones celulares en poblaciones mixtas.

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Investigación

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Biología

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