Name: Preparación Cortar, cultivo de tejidos organotípicos y grabación de la actividad luciferasa de reloj de genes en el núcleo supraquiasmático (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-15T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Aprende a preparar cortes del núcleo supraquiasmático de ratones transgénicos y cultivar tejido organotípico para registrar la expresión de genes reloj mediante luciferasa. Este método permite monitorear oscilaciones circadianas continuamente con alta resolución temporal.

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Este trabajo fue financiado por el Consejo Sueco de Investigación Médica (K2009-75SX-21.028-01-3, K2008-61X-20700-01-3); FONCICYT 000000000091984, los cimientos de Jeansson, Söderström Königska sjukhemmet, Lundqvist Marta y Sigurd och Elsa Goljes Minne, y la Sociedad Sueca de Medicina SLS-95151. Profesor Gene D. Block, UCLA, se agradece por sus valiosos comentarios sobre el manuscrito. Se agradece al Dr. Michael Andang y la Dra. Helena Johard para el bloqueador del canal de HCN, y el Prof. Abdel El Manira para proporcionar video microscopio. Consideraciones éticas: Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por el Instituto Karolinska y &quot;Estocolmo Norra Djurförsöksetiska Nämnd&quot;. Todos los experimentos con animales se llevan a cabo con la intención de reducir al mínimo cualquier posible estrés o incomodidad para el animal.

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Ventajas y desventajas de la tecnología de luciferasa En contraste con los métodos ex vivo, tales como RT-PCR, hibridación in situ y Western blot que requieren muestras de tejido en muchos diferentes puntos de tiempo (dando un tiempo de resolución de baja normalmente 2-4 horas dependiendo de la frecuencia de muestreo) para estudiar diurna variaciones en la expresión de genes y proteínas, la tecnología de luciferasa permite alta resolución (1-10 min) los estudios de las oscilaciones circadiano durante muchos días en la misma preparación. Estudios por lo tanto, el número de animales utilizados se reduce al mínimo y detallado de los efectos de la fase y el período del ritmo son factibles, que normalmente no es posible utilizando técnicas convencionales de muestreo con el tiempo de resolución de baja. Sin embargo, a pesar de las mediciones relativas amplitud del ritmo es posible, hay que destacar que la tecnología de periodista no es cuantitativo y no puede ser utilizado para medir las cantidades de los genes transcritos o traducidos proteínas. Las grabaciones de los tejidos se pueden iniciar y analizadas inmediatamente después de un cultivo, una gran ventaja para estudiar directamente los efectos moleculares de estrés en vivo, en vivo los cambios de fase inducido por la luz, etc La cultura SCN organotípicos permite a largo plazo (semanas) la manipulación farmacológica del cerebro adulto tejido que contiene una intacta red madura sináptica y la tecnología permite grabaciones de luciferasa estable durante varias semanas. Por lo tanto, el tejido no tiene por qué ser postnatal neonatal o principios con el fin de obtener cultivos sanos, y en contraste con el agudo corte tratamientos farmacológicos crónicos se puede realizar. En contraste con transfections plásmido reportero en cultivos de células, que no hacer lugar a la incorporación de ADN en el genoma, la luciferasa transgénicos modelos animales (así como transfecciones lenti-virus) son favorables si las alteraciones epigenéticas son objeto de estudio. Se debe en este contexto también se mencionó que las imágenes de luminiscencia es hoy en día es posible con cámaras CCD de alta sensibilidad 11, lo que permite grabaciones, incluso en las neuronas SCN sola (~ 6.10 m) y otros tipos de células, utilizada por los principales laboratorios estudian los ritmos circadianos. Finalmente, varios investigadores circadiano comúnmente seguimiento del uso de la expresión molecular mediante la prensa, como la proteína verde fluorescente, con el fin de estudiar genes reloj / oscilaciones de proteínas 16-19. Los aspectos de grosor de corte Los espesores aquí se recomienda el corte de SCN (200-300 micras) podrían reducirse o aumentarse si así lo desea. Sin embargo, aunque el tejido se aplana en la membrana después de unos días en la cultura, no se recomienda para más de 500 micras de espesor de la rebanada cortada inicialmente con el fin de preservar la viabilidad de los tejidos 7. Una rebanada de menos de 100 m es de razones mecánicas y prácticos difíciles de manejar. Debido a que el tejido SCN es heterogéneo el grosor del corte puede afectar a la fase de la señal de salida de la luciferasa, ya que las diferentes regiones del SNC (por ejemplo, el &quot;núcleo&quot; versus la &quot;cáscara&quot;, y en comparación con las regiones dorsal ventral) oscilan con las diferentes fases 20 y diferencialmente volver a sincronizar los cambios después de la fase 21. El grosor de la rebanada también afecta a la línea de base del recuento de fotones, ya que más tejido emite un mayor número de fotones. La amplitud de las oscilaciones moleculares pueden de esta manera indirectamente verse afectada por el tamaño de los explantes. Por estas razones, el control y cultivos tratados deben ser siempre del mismo tamaño, grosor, y que contiene la misma región del SCN, para oscilar en la misma fase y con la misma amplitud. Los dos núcleos unilateral, por su parte, oscilan en fase con los demás y con amplitudes similares, siempre y cuando el corte es horizontal y no vibratome y en ángulo (que a su vez depende de que el corte de separación entre el cerebelo y los dos hemisferios es perpendicular a la superficie de la mesa). Un investigador que realiza el cultivo de SCN pueden experimentar las culturas SCN no oscilan en fase con la otra. La práctica y la estandarización de la técnica de corte, es decir, los cortes siempre se cortan en el mismo rostro-caudal a nivel del SNC, mejorará el resultado. Los pasos críticos <ol><li> Suministro de oxígeno es crítico. Dado que el cerebro requiere una gran cantidad de oxígeno 22, el procedimiento de corte tiene que ser rápido (cuanto más cerca 3,1-3,10 es ~ 6.5 minutos, el mejor es el fin de mantener el tejido sano). </li><li> El SCN es sensible a los cambios de temperatura y el intercambio de mediano plazo. El SCN es sensible a la temperatura y los cambios de temperatura grandes pueden desplazamiento de fase del marcapasos y causar artefactos experimentales 23. Si el medio o las soluciones que se intercambian o añadidos durante un experimento en curso, por ejemplo, al aplicar un fármaco después de un par de días en la cultura, el medio o solution tiene que ser pre-calentado a 36-37 ° C (la misma temperatura en la cámara) antes de la adición. En experimentos farmacológicos que implican intercambios medio, es importante trabajar siempre con pre-condicionada medio de cultivo celular. Además / lavado con agua dulce, medio condicionado potencialmente cambio de fase del ritmo molecular SCN 24, así como otros cultivos de células de tipo 25. </li><li> Composición del medio. Es importante a la cultura del tejido en el pH y la osmolalidad correcta. El medio de aire buffer contiene una gran cantidad de HEPES, que tiene una capacidad de amortiguación óptima en el rango de pH 6.8 a 8.2 y también es apropiado para amortiguar los cambios de pH que pueden ocurrir como resultado de la respiración celular. HEPES, por el contrario, es más sensible a los cambios de temperatura en comparación con bicarbonato de sodio, que se incluye en pequeñas cantidades en el medio de cultivo. El bicarbonato de sodio tiene una mayor capacidad de amortiguación en el pH bajo (5,1-7,1) entre 26 y, por lo tanto apropiado en una atmósfera de CO 2. Sin embargo, el aumento de cantidades de bicarbonato de sodio en el medio del aire-buffering (DMEM 2902) aumenta la osmolaridad de manera significativa y no se puede añadir al mismo tiempo, sin diluir el medio, lo que a su vez se traduce en la composición incorrecta de aminoácidos, vitaminas e iones. Consejos para preparar el medio: <ol><li> Sea preciso y cuidado al mezclar el medio. </li><li> Utilice las soluciones madre sólo fresco o descongelado recientemente. </li><li> En el caso de osmolalidad muy alta que no vale la pena diluyendo. Más de 6.5% diluido en medio no lo más probable es el trabajo. El uso de D-glucosa para aumentar la osmolaridad si es demasiado baja. </li></ol></li><li> Cambios de fase debido al tiempo de preparación El tiempo de preparación rebanada es fundamental. Efecto nulo o mínimo en la fase se obtiene si el procedimiento de corte se realiza entre 6 a 12 dic. ZT. Todas las disecciones corte debe realizarse en la misma fase del ciclo diurno o circadiano con el fin de minimizar el error debido a la fase de variación entre los preparativos. </li></ol> Posibles modificaciones <ol><li> De electrofisiología SCN aguda, el corte debe realizarse con un timbre (líquido cerebro espinal artificial; ACSF) de amortiguación, saturada de oxígeno (95% O 2, 5% CO 2) antes de que comience la corte. Además, el oxígeno es necesario agregar continuamente al búfer durante todo el procedimiento corte, como la actividad eléctrica y sináptica depende directamente del suministro de oxígeno 22. </li><li> Cortes horizontales y sagitales también puede ser preparado con éxito y culto de la SCN. Los autores tienen experiencia con las grabaciones de la luciferasa en cortes horizontales, que de acuerdo a nuestra experiencia dan oscilaciones circadiano de menor amplitud, en comparación con el corte coronal. </li><li> El SCN es de aproximadamente 1 mm de longitud rostro-caudal y el método de los cortes se describe aquí se dirige hacia la adquisición de una sección de SCN en la región central. Sin embargo, más de una sección SCN se pueden obtener de ratón y los cerebros de ratas, lo que permite la investigación de la circadiano de genes / proteínas de expresión en los niveles más rostrales versus caudal del núcleo SCN. </li><li> Culturas sector a partir de los animales más jóvenes, las crías después del parto o de embriones, también se pueden preparar. Tenga en cuenta que el cerebro y el cráneo en cachorros muy jóvenes son muy suaves y sensibles. Además, el nervio óptico es delgado y no ha desarrollado plenamente. Tenga cuidado cuando la disección del cerebro de las crías para que la región SCN no está dañado. Por ejemplo, micro herramientas gubia no puede ser utilizada para abrir el cráneo de crías de ratón, ya que son demasiado grandes. Tijeras finas son suficientes para cortar los tejidos blandos de los cachorros. </li><li> La técnica del cristal de la cubierta cultura basada descritos aquí también se puede utilizar para la luminiscencia de la imagen utilizando una cámara CCD / EM-CCD, también en las neuronas SCN sola. </li><li> Otras regiones del sistema nervioso central y los tejidos periféricos de órganos de transgénicos PER2:: Los LUC se puede obtener fácilmente, cultivadas y analizadas en términos de las oscilaciones moleculares, como el PER2:: expresión LUC sigue oscilando durante muchos días, también en una serie de otros tejidos y tipos de células 10. La mayoría de estos tejidos periféricos, por ejemplo, el hígado, no requieren de una membrana para la supervivencia, sino que son cultivadas directamente bañada por el medio 11. Tenga en cuenta que el desplazamiento de fase debido a la corte, el cultivo y el intercambio de medio no puede seguir los mismos principios que para el SCN. </li></ol> Significado En ratones transgénicos y las cepas de ratas (mPER2:: LUC; mPer1-Luc 8, 10, 27), actividad de la enzima luciferasa refleja las proteínas o los ritmos de la expresión génica y pueden evaluarse mediante el registro de la bioluminiscencia. La bioluminiscencia luciferasa generado da una señal débil, pero la luminiscencia de fondo es cercano a cero, por lo que este método ventajoso. Por otra parte, porque la molécula de luciferasa es inestable y se degrada rápidamente que no hay phototoxicidad, que puede aparecer durante la iluminación de larga duración de excitación 28. En conjunto, estas propiedades permiten a los experimentos de larga duración haciendo que la tecnología de luciferasa muy ventajosa en la investigación circadiano.

<table><tbody><tr><td>Suplemento B27 50x</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Cubrebocados</td><td>Menzel-Glaser</td><td>40#1</td><td>&amp;#8776; 40 mm</td></tr><tr><td>Membranas de cultivo</td><td>EMD Millipore</td><td>PICMORG50</td><td>0.4 &amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>DMEM bajo en glucosa sin rojo de fenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2902</td><td>Polvo para 1 L</td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1003 055</td><td>&amp;#8776; 55 mm</td></tr><tr><td>Juego de filtración</td><td>Corning</td><td>431097</td><td>Tamaño de poro 0.22 &amp;#x03BC;m, poliéter sulfona</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Allgaier Instrumente</td><td>0203-7-PS</td><td>Dumont #7</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>Invitrogen</td><td>14065-049</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>NaOCH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 7.5%</td><td>Invitrogen</td><td>25080-060</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Luciferina</td><td>Promega Corp.</td><td>E1602</td><td>Luciferina de luciérnaga, sal potásica</td></tr><tr><td>Herramienta micro rongeur</td><td>Allgaier Instrumente</td><td>332-097-140</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep 10,000 U/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>&amp;#8776; 35 mm</td></tr><tr><td>PMT</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>H9319-11MOD</td><td></td></tr><tr><td>Cúteres desechables</td><td>Paragon</td><td>P503</td><td>Tamaño 11</td></tr><tr><td>Filtro al vacío</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-5</td><td></td></tr><tr><td>Grasa para vacío</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>50 g</td></tr><tr><td>Vibrátomo</td><td>Campden Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparación cortar, cultivo de tejidos organotípicos y grabación de la actividad luciferasa de reloj de genes en el núcleo supraquiasmático

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

Un centro circadiano (~ 24 h) la coordinación de los ritmos diarios del reloj en la fisiología y el comportamiento reside en el núcleo supraquiasmático (NSQ), ubicado en el hipotálamo anterior. El reloj se sincroniza directamente con la luz a través de la retina y el nervio óptico. Oscilaciones circadiano son generados por la interacción bucles de retroalimentación negativa de un número de los llamados &quot;genes reloj&quot; y sus productos proteicos, incluyendo el período de (por) los genes. El reloj de núcleo también depende de la despolarización de la membrana, el calcio y el campamento 1. El SCN presenta oscilaciones diarias en la expresión de genes reloj, la actividad metabólica y la actividad eléctrica espontánea. Cabe destacar que esta actividad cíclica endógena persiste en cortes de tejido adulto de la SCN 2-4. De esta manera, el reloj biológico puede ser estudiada in vitro, lo que permite las investigaciones moleculares, electrofisiológicas y metabólicas del funcionamiento del marcapasos. El SCN es una pequeña y bien definida estructura bilateral situada justo por encima del quiasma óptico 5. En la rata que contiene ~ 8.000 neuronas en cada núcleo y tiene unas dimensiones de aproximadamente 947 m (largo, eje rostrocaudal) x 424 m (ancho) x 390 m (altura) 6. Para diseccionar el SCN, es necesario cortar una rodaja del cerebro en el nivel específico del cerebro donde se encuentra el SCN identificadas. Aquí se describe el procedimiento de disección y el corte de la SCN, que es similar para el ratón y el cerebro de las ratas. Además, nos muestran cómo la cultura de los tejidos disecados organotypically en una membrana de 7, una técnica desarrollada para el cultivo de tejidos SCN por Yamazaki et al. 8. Por último, demostrar cómo el tejido transgénico puede ser utilizado para medir la expresión de los genes del reloj / proteínas de uso de la tecnología dinámica de luciferasa, un método que fue utilizado originalmente para la medición circadiano por Geusz et al. 9. Estamos aquí, usar pañuelos SCN de los transgénicos knock-in período2:: ratones luciferasa producida por Yoo et al 10.. Los ratones que contienen una proteína de fusión del período (PER) 2 y la enzima luciferasa de luciérnaga. Cuando PER2 se traduce en la presencia del sustrato para la luciferasa, luciferina, es decir, la expresión PER2 se puede controlar con bioluminiscencia cuando luciferasa cataliza la oxidación de la luciferina. El número de fotones emitidos se correlaciona positivamente con la cantidad de proteína producida PER2, y los ritmos de la bioluminiscencia coincidir con el ritmo de proteínas PER2 in vivo 10. De esta manera, la variación cíclica en la expresión PER2 puede ser de un seguimiento continuo en tiempo real durante muchos días. El protocolo que siguen para el cultivo de tejidos y la grabación en tiempo real bioluminiscencia ha sido completamente descrito por Yamazaki y Takahashi 11.

El procedimiento de preparación de cortes que contiene el ratón adulto núcleo supraquiasmático del hipotálamo (NSQ), y de una manera rápida a la cultura del tejido SCN en condiciones de cultivo organotípico, se informó. Además, la medición de la expresión de la proteína del gen del reloj oscilatorio utilizando la tecnología dinámica de luciferasa se describe.

Preparación Cortar, cultivo de tejidos organotípicos y grabación de la actividad luciferasa de reloj de genes en el núcleo supraquiasmático

Un reloj circadiano central (~24 h) que coordina los ritmos diarios de la fisiología y el comportamiento reside en el núcleo supraquiasmático (SCN), ubicado en el...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo seccionar y diseccionar el núcleo supraquiasmático de ratones transgénicos y cultivar el tejido esquemático para registrar la expresión de un gen reloj o de una proteína mediante luciferasa inducida por luminiscencia. Esto se logra primero mediante la disección del cerebro de un ratón transgénico que contiene un reportero de luciferasa para un gen reloj o proteína, y luego realizando un corte cerebral que contenga el núcleo supraquiasmático. El segundo paso del procedimiento consiste en diseccionar los pequeños núcleos esquemáticos bilaterales a partir del corte.El tercer paso del procedimiento consiste en cultivar el núcleo esquemático explan en una membrana dentro de una placa de Petri que contiene cultivo, medio y luciferina. El paso final del procedimiento es registrar la actividad de luciferasa midiendo la bioluminiscencia con tubos fotomultiplicadores en una cámara hermética a la luz y calentada. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren la oscilación circadiana del gen reloj o de la proteína.Mi nombre es Sergey IV y trabajo en Gabrielle Re Club. Mi nombre es SoFi Johansson y trabajo en el equipo de Gabriella. Mi nombre es Gabriel Quist.Soy investigador principal en el Departamento de Neurociencia, y mi nombre es Ka LaShon, y soy estudiante de doctorado en el Centro de Neurociencia Médica Sueco, y colaboro con Gabriella. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la transferencia Western, la R-T-P-C-R y la hibridación en dos híbridos es que la expresión de un gen o proteína reloj puede seguirse continuamente durante muchos días en el mismo tejido con una resolución muy alta de aproximadamente un minuto, lo que permite un análisis detallado del período, la amplitud y la fase del ritmo circadiano. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de corte y disección del SEN son difíciles de aprender.El SEN es muy pequeño y puede ser difícil de identificar. La doctora Sge Velia, investigadora postdoctoral de mi equipo de investigación, demostrará el procedimiento. Después de preparar las soluciones necesarias, prepare las placas de Petri que se utilizarán en el experimento usando una jeringa de cinco mililitros precargada con grasa al vacío para autoclave.Aplique la grasa sobre la superficie del anillo superior de una placa de Petri de 35 milímetros. Prepare una placa de Petri separada para cada sección. Cultivo. Llene un tubo Falcon con 10 mililitros de medio de cultivo tamponado y aire.Esto producirá suficiente medio para ocho cultivos. Añada 10 microlitros de luciferina recién descongelada. La luciferina es sensible a la luz, por lo tanto proteja el medio con luciferina de la luz almacenando el tubo Falcon en una cámara de calentamiento oscura a 37 grados Celsius.A continuación, esterilice todos los instrumentos, cubra los portaobjetos y demás materiales que se utilizarán en el procedimiento. Rocíe con etanol al 70% todos los equipos no estériles. Exponga los instrumentos y las placas de Petri engrasadas a la luz UV en una cabina estéril durante al menos 30 minutos.Otro paso preparatorio consiste en configurar el vibrátomo y colocar una cuchilla de afeitar estéril. Ahora el equipo está listo para el procedimiento quirúrgico. Después de anestesiar y decapitar un ratón, retire los ojos de la cabeza con un par de tijeras.Esto evita estimular o excitar los nervios ópticos, lo cual ayuda a prevenir daños en el núcleo supraquiasmático o SCN. Utilice un par de tijeras finas para retirar la última vértebra cervical y eliminar la piel. Realice dos cortes en el hueso del cráneo a ambos lados del cráneo, creando así una tapa removible.Abra el cráneo con una herramienta micro Ron Jre. Utilice el RJ con un movimiento ascendente, sin presionar nunca hacia abajo sobre el cerebro con la herramienta. Para prevenir daños en el SCN, retire todo el hueso hasta que puedan verse los bulbos olfatorios.Utilice unas tijeras de disección microscópicas de muelle finas para cortar cuidadosamente el nervio óptico entre los hemisferios y los bulbos olfatorios. Coloque una placa de Petri con 50 a 100 mililitros de HBSS frío debajo de la cabeza del ratón. Gire la cabeza boca abajo y permita que el cerebro intacto comience a salir.Corte otros nervios craneales según sea necesario en el lado opuesto al nervio óptico. Una vez separado, el cerebro cae dentro de la placa de Petri, lo que enfría rápidamente el cerebro. Utilice una cuchara para transferir el cerebro frío con hielo a una superficie de corte estéril, como la tapa de una placa de Petri de vidrio colocada boca abajo.Retire el cerebelo realizando un corte perpendicular con hojas de bisturí estériles entre los hemisferios y el cerebelo. Aplique pegamento rápido sobre la plataforma seca del viome. Introduzca una pinza curva afilada en la parte rostral del cerebro y levante el cerebro sosteniéndolo con la pinza.Seque cuidadosamente el HBSS sobre papel de filtro estéril. Fije los hemisferios sobre el pegamento de la plataforma con la punta rostral hacia arriba y la superficie ventral más cercana a la cuchilla de corte. Coloque la plataforma en el soporte del vibrátomo e inmediatamente llénelo con HBSS frío.Si el corte perpendicular se realiza correctamente, los hemisferios deben permanecer erguidos. El objetivo consiste en cortar secciones coronales que contengan la región media del SCN bilateral, utilizando la velocidad máxima del vibrátomo. Comience a cortar secciones de 500 a 800 micrómetros de grosor de los hemisferios hasta alcanzar la comisura. Observe.A medida que el quiasma óptico se ensancha, acompañado por la reducción de las secciones a un grosor de 100 micrómetros, continúe cortando en dirección caudal, disminuyendo la velocidad del movimiento manual horizontal de la hoja hasta que comiencen a aparecer los dos núcleos SCN. Utilice una lupa si es necesario para visualizar los núcleos cuando se haya alcanzado el nivel del SCN. Corte una sección del SCN de 250 micrómetros.Llene con HBSS frío la tapa de una placa de Petri de tamaño medio utilizando un pincel suave. Levante y transfiera la sección cerebral del SCN a la placa de Petri. Coloque la placa de Petri bajo un microscopio estereoscópico.El siguiente paso consiste en diseccionar el SCN fuera del corte. Utilice el microscopio para verificar que el SCN bilateral sea claramente visible al menos en un lado de la sección. Use un par de escalpelos estériles para disecar un cuadrado de tejido, de aproximadamente 1,5 milímetros por cada lado, que contenga ambos SCN.Corte lo más cerca posible del SCN. Sin retirar el tejido del SCN, debe quedar un pequeño fragmento del nervio óptico unido al explante, pero no se deben incluir otros núcleos. Corte el tejido que contiene el SCN bilateral por la mitad para obtener dos SCN unilaterales.Se puede utilizar un SCN unilateral como control en una campana estéril. Con la luz apagada, agregue 1200 microlitros del medio Lucifer a una placa de Petri de 35 milímetros de diámetro y luego coloque una membrana de cultivo sobre la superficie del líquido. Asegúrese de que no haya burbujas de aire debajo de la membrana.Los implantes son pequeños y difíciles de manipular. Por lo tanto, utilice una pipeta de 1000 microlitros con punta para aspirar el explante SEN dentro de la punta y expulsarlo sobre la membrana de cultivo. Descarte el exceso de HBSS y, para la grabación de luciferasa, coloque solo un SEN por placa de Petri.Selle la placa de Petri con grasa utilizando un cubreobjetos de 40 milímetros de diámetro. Añada más grasa si el sello no es hermético. Transfiera las placas de Petri al aparato de ciclo aluma colocado en una cámara de calentamiento opaca a la luz, a una temperatura de 36 a 37 grados Celsius.Para comenzar el cultivo, observe las placas de cultivo y los conjuntos de detectores de tubos fotomultiplicadores montados dentro de la cámara de ciclo lumínico. Coloque las placas de cultivo debajo de los tubos fotomultiplicadores a una distancia aproximada de uno a dos centímetros. Los tubos fotomultiplicadores detectan y amplifican la luciferasa inducida por la luminiscencia.La herramienta de software Luma Cycle se utiliza para la adquisición de datos. Las cuentas de fotones se integran en intervalos de uno a diez minutos para obtener una alta resolución de la expresión del gen y la proteína. La expresión circadiana del gen y la proteína se analiza para determinar la fase, el período y la amplitud del ritmo.Esta figura muestra grabaciones de bioluminiscencia de cultivos de tejido SCN sanos y no sanos. Estos ratones se mantuvieron en 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad antes de la extracción de su tejido SCN. La línea negra muestra el ritmo circadiano de las grabaciones de bioluminiscencia de la expresión de luciferasa del periodo dos.En un corte de SEN sano, la proteína oscila con la variación circadiana en la que la expresión máxima de la proteína ocurre en el tiempo de zeitgeber, 12 a 13, o al comienzo de la oscuridad. Por lo tanto, la fase del ritmo génico depende del ciclo luz-oscuridad en el que se mantuvo al animal antes del sacrificio. La línea azul muestra grabaciones de bioluminiscencia de un SE y un cultivo que se secaron después de que la placa de cultivo se abrió al cuarto día, indicado por la flecha, y no se volvió a sellar adecuadamente.La línea roja muestra las grabaciones de bioluminiscencia de una cultura de SCN no saludable. Esta figura utiliza la cultura de SCN en un experimento farmacológico. La figura muestra un rastro de una cultura que fue tratada con un bloqueador del canal iónico HCN en el momento indicado por la primera flecha.En el transcurso de dos o tres días, el bloqueador del canal iónico redujo y luego detuvo la oscilación circadiana en la segunda flecha. El fármaco se eliminó mediante lavado y se reemplazó por medio de control enriquecido. Es importante recordar trabajar con rapidez pero con cuidado para mantener el tejido SEN viable.También es importante estandarizar el corte de la sección vibram para obtener cada vez el mismo nivel del SEN. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo seccionar y diseccionar la cultura del SEN, el órgano SCN, típicamente sobre una membrana, y monitorear la expresión del gen reloj o de la proteína mediante luciferasa inducida por luminiscencia en las culturas.

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Investigación

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Neurociencia

Este es un protocolo para preparar y mantener una rebanada preparación neocortical en la cultura organotípicos con el propósito de realizar grabaciones eléctricas de las neuronas piramidales.

Grabación de células enteras de una rebanada preparación organotípicos del neocórtex

Los relojes circadianos funcionar dentro de las células individuales, es decir, son células autónomas. A continuación, se describen los métodos para la generación de células autónomas modelos de reloj de forma no invasiva, luciferasa tiempo real basado en la tecnología de bioluminiscencia. Células Reporter proporcionar sistemas manejables, modelo funcional para el estudio de la biología circadiana.

Monitoreo de células autónomas Ritmos reloj circadiano de expresión génica utilizando luciferase reporteros Bioluminiscencia

Fuente: Sabado, V. , et al., Nagoshi, E. Imágenes en vivo de fluorescencia de resolución de una sola célula de Drosophila Relojes circadianos en el cerebro de las larvas Cultura. J. Vis. Exp. (2018).  Este video muestra el procedimiento para incrustar el cerebro de Drosophila en una matriz de fibrina, seguido de imágenes de fluorescencia de lapso de tiempo de las neuronas del reloj circadiano para analizar la actividad rítmica sincronizada con los ciclos de luz/oscuridad.

Incrustación del cerebro de Drosophila en una matriz para obtener imágenes de lapso de tiempo de las neuronas del reloj circadiano

Se describen procedimientos para realizar registros simultáneos del potencial o corriente de membrana y los cambios en la concentración de calcio intracelular. Las neuronas del núcleo supraquiasmático se llenan con el indicador de calcio bis-fura-2 mediante un electrodo de pinza de parche en la configuración de pinza de parche de toda la célula.

Registro electrofisiológico simultáneo e imágenes de calcio de neuronas del núcleo supraquiasmático

El reloj circadiano regula alrededor de un tercio del transcriptoma de Arabidopsis, pero el porcentaje de genes que se alimentan de nuevo en la hora normal permanece desconocida. Aquí visualizamos un método para evaluar rápidamente los fenotipos circadianos en cualquier línea mutante de Arabidopsis utilizando imágenes luminiscentes de un reportero circadiano transitoriamente expresada en protoplastos.

Análisis rápido de los fenotipos circadianos en Arabidopsis protoplastos transfectadas con un reloj luminiscentes Reportero

Aquí, describimos los ajustes para monitorear en paralelo la bioluminiscencia circadiana y la actividad secretora de las células de los islotes humanos y los miotubos primarios. Para ello, empleamos la administración de genes lentivirales de un indicador de reloj central de luciferasa, seguido de sincronización in vitro y recolección del medio de salida por perifusión celular continua.

La medición paralela de la expresión de genes circadianos del reloj y Hormona en cultivos celulares primarios humanos

Esta nueva tecnología basada en la fluorescencia permite la monitorización a largo plazo de la transcripción de los genes del reloj circadiano en el núcleo supraquiasmático (SCN) de mover libremente ratones en tiempo real y con una alta resolución temporal.

En Vivo Control de la expresión de genes del reloj circadiano en el núcleo supraquiasmático de ratón usando fluorescencia Reporteros

El objetivo del presente Protocolo es establecer ex vivo Drosophila larvas cerebro cultura optimizada para controlar ritmos circadianos moleculares con imágenes de Time-lapse de fluorescencia a largo plazo. También se discute la aplicación de este método a los ensayos farmacológicos.

Sola célula resolución fluorescencia vivo la proyección de imagen de relojes circadianos de Drosophila en cerebro larvas cultura

Células neurales del tallo/progenitor exhiben varias dinámicas de expresión de los componentes de señalización de la muesca que conducen a diferentes resultados de los eventos celulares. Dicha expresión dinámica puede revelarse mediante monitoreo en tiempo real, no mediante análisis estáticos, utilizando un sistema de imágenes de bioluminiscencia altamente sensible que permite la visualización de cambios rápidos en expresiones génicas.

Imágenes de bioluminiscencia en tiempo real de la dinámica de señalización de muesca durante la neurogénesis de la murino

Los ritmos circadianos, que existen en la mayoría de los organismos, regulan la organización temporal de los procesos biológicos. Los organoides 3D han surgido recientemente como un modelo in vitro fisiológicamente relevante. Este protocolo describe el uso de reporteros bioluminiscentes para observar los ritmos circadianos en organoides, lo que permite investigaciones in vitro de los ritmos circadianos en sistemas multicelulares.

Monitorización de las oscilaciones circadianas con un indicador de bioluminiscencia en organoides

Este informe describe un método que involucra un script R en el software de código abierto RStudio para analizar conjuntos de datos a gran escala obtenidos de experimentos de series temporales.

Un análisis R potente y fácil de usar de conjuntos de datos a gran escala

Aprende a preparar cortes del núcleo supraquiasmático de ratones transgénicos y cultivar tejido organotípico para registrar la expresión de genes reloj mediante luciferasa. Este método permite monitorear oscilaciones circadianas continuamente con alta resolución temporal.

Preparación Cortar, cultivo de tejidos organotípicos y grabación de la actividad luciferasa de reloj de genes en el núcleo supraquiasmático (Video) | JoVE Journal

Preparación Cortar, cultivo de tejidos organotípicos y grabación de la actividad luciferasa de reloj de genes en el núcleo supraquiasmático

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