Grabaciones postsinápticos en las dendritas aferentes cocleares ponerse en contacto con las células ciliadas internas: Comunicado de Vigilancia multivesiculares en una sinapsis cinta

El objetivo general de este procedimiento es registrar la actividad postsináptica en las sinapsis aferentes internas de las células ciliadas. Esto se logra exponiendo primero el epitelio sensorial de una cóclea recientemente extraída de una rata decapitada. El segundo paso del procedimiento consiste en colocar la apical extirpada, encender un cubreobjetos modificado y transferirlo a la cámara de registro.

El tercer paso del procedimiento es localizar y acceder a un bastón aferente con un electrodo de registro. El paso final del procedimiento es formar un sello hermético y luego romper la membrana de fibra aferente, estableciendo la configuración celular completa de la técnica de pinza de parche. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la ocurrencia postsináptica o los potenciales de una sola sinapsis de cinta a través de la electrofisiología de la pinza de parche de célula completa.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que la disección y la preparación del tejido coclear son difíciles de aprender y las pequeñas fibras aferentes son difíciles de reconocer y acceder. Antes de comenzar la disección, prepare una cubierta modificada que mantendrá la preparación en su lugar durante las grabaciones. Usando un cubreobjetos de vidrio circular de ocho a 12 milímetros, aplique una gota de protector de sila medio curado hacia el borde del cubreobjetos.

Coloque el extremo grueso de un alfiler fino para insectos en el cubreobjetos. Sostenga el alfiler de insecto firmemente contra el vidrio. Con pinzas, caliente el protector del umbral contra una bobina calentada para que se asiente.

Prepare de 10 a 20 microelectrodos como se describe en el texto adjunto. Después del pulido al fuego con una micro forja, el microelectrodo debe tener un diámetro de punta exterior de aproximadamente una micra. El grosor final de la pared de la pipeta es de aproximadamente un tercio de micrómetro después de la anestesia y decapitación de una rata de tres semanas de edad.

Comience la disección retirando la piel, diseccionando la cabeza y extirpando el cerebro Para exponer el hueso temporal, retire ambos huesos temporales. Coloque cada hueso temporal en una placa de disección limpia que contenga solución extracelular estándar. El siguiente paso es extraer el hueso, encapsulando el hueso temporal, para exponer la cóclea.

Sostenga el hueso temporal firmemente en la base con un par de pinzas. Identifica la ventana redonda y ovalada y la cóclea. Oriente la cóclea de modo que la ventana ovalada y el lado en espiral de la cóclea miren hacia arriba.

Retire el exceso de hueso alrededor de la cóclea. Use un segundo par de pinzas finas para cortar el hueso directamente de la cóclea, comenzando con el área que es más transparente que el resto del hueso. Aquí el hueso es más delgado y más fácil de extraer.

Continúe retirando el hueso alrededor de la bobina apical. Use tijeras de disección micros para cortar el modis debajo del giro apical. A continuación, desconecte la vuelta apical de las vueltas inferiores de la cóclea.

Tenga cuidado de proteger la bobina apical. No se debe tirar ni estirar. Por último, retira el giro apical de la cóclea sin desgarrar demasiado el tejido.

Use pinzas finas para extraer el resto del hueso. El siguiente paso es eliminar el STR de los óculos y la membrana tial. Retire con cuidado el STR de óculos, la tira brillante de tejido situada fuera de la región de las células ciliadas.

Asegúrese de evitar eliminar las células ciliadas sensoriales, que pueden desprenderse fácilmente junto con el STR de los óculos. A continuación, utilice pinzas finas para separar la membrana tial. La membrana semitransparente brillante que se encuentra sobre las células ciliadas sensoriales ahora recorta el exceso de tejido y hueso y aplana la preparación con las pinzas.

Esto es necesario para que el tejido pueda colocarse uniformemente debajo de un alfiler. La disección ya ha terminado. Coloque la preparación debajo del alfiler en el cubreobjetos preparado, teniendo cuidado de colocar el alfiler lejos de las células ciliadas una vez que se complete la disección.

Utilice fórceps para transferir la preparación a la cámara de registro mientras mantiene una gota de líquido extracelular en el cubreobjetos que sostiene el tejido coclear inmediatamente y comience la profusión con la solución extracelular. Para garantizar una mejor supervivencia de la preparación, utilice el objetivo de 10 x del microscopio o el objetivo DIC de inmersión en agua de 40 x. Para localizar la preparación, oriente la preparación de modo que los electrodos de registro puedan acercarse a las células ciliadas internas en ángulo recto con sus paredes laterales.

Si la visibilidad de la región basal de las células ciliadas internas es limitada porque la preparación está curvada, use un electrodo de registro para empujar el borde exterior de la preparación hacia abajo contra el deslizamiento de la cubierta de vidrio. Tenga cuidado de evitar presionar las células ciliadas internas. En esta preparación, el electrodo superior sostiene el borde exterior de la preparación hacia abajo, el electrodo inferior marca donde se encuentran los bastones aferentes.

Como referencia, la cámara NC 70 Nuv Con muestra la imagen ampliada de Forex en el monitor para evaluar si el tejido en la región interna de las células ciliadas está sano. Busca los mechones de pelo como punto de referencia y enfócate para encontrar los núcleos. Enfoca más abajo, hacia la base de las células ciliadas internas con sus terminaciones aferentes y retrocede hasta alcanzar el nivel de los núcleos en el monitor.

Ahora ubique los bastones aferentes alrededor de la base de las células ciliadas internas. Los bastones son esféricos o elipsoidales, de aproximadamente una micra de diámetro y son de color claro con un aspecto brillante. Los encontrarás enfocándote hacia arriba y hacia abajo.

El siguiente paso es despejar el camino hacia las fibras aferentes utilizando un electrodo de registro con una punta de una micra llena de solución intracelular. Aplique presión positiva y use el micromanipulador para maniobrar el electrodo a la preparación. Utilice este electrodo para hacer una incisión en la preparación a nivel de la base de la célula ciliada interna.

Empuje el electrodo entre la capa delgada de células de soporte y las células ciliadas internas usando presión positiva para forjar una ruta de acceso al área en la base de las células ciliadas internas. Retire con cuidado el electrodo y reemplácelo con un electrodo nuevo con una punta de una micra de diámetro llena de solución intracelular. Usando presión positiva para mantener limpia la punta del electrodo, mueva el electrodo de registro a través del orificio de acceso alrededor de las celdas de soporte adyacentes hacia el bastón aferente.

Asegúrese de que la punta del electrodo esté directamente delante de los bastones aferentes que ofrecen más resistencia al movimiento de la pipeta que las células de soporte y la membrana interna de las células ciliadas. Esta diferencia se puede sentir a medida que se mueve la pipeta, mueva la pipeta hacia arriba y hacia abajo y empuje para asegurarse de que el bhuton se mueva. Esto indica que la punta de la pipeta y el bhuton están en el mismo plano de enfoque con el electrodo presionado contra el bhuton aferente Libere simultáneamente presión positiva y aplique succión para formar un sello de giga ohmios.

Aplique ráfagas suaves de succión para romper la membrana dentro del electrodo y obtener un registro de toda la célula. Si la célula parcheada es un bastón aferente, se observan pequeños transitorios capacitivos en el modo de grabación de toda la célula. Esta figura muestra los transitorios típicos registrados a partir de una fibra aferente.

Comienza a registrar la actividad sináptica. Si la fibra aferente no exhibe actividad espontánea, despolarizar la célula ciliada aplicando una solución extracelular con una mayor concentración de potasio. Esta figura muestra las relaciones típicas de voltaje de corriente para las fibras AFF a la izquierda y las células ciliadas internas a la derecha.

Las relaciones de voltaje de corriente se registraron con un potencial de retención de menos 84 milivoltios con pasos de voltaje de menos 124 milivoltios a 36 milivoltios positivos en incrementos de 10 milivoltios. Los voltajes se muestran a la derecha de algunas trazas centrándose en las relaciones de voltaje actual de una fibra aferente. Obsérvese que la ocurrencia postsináptica excitatoria o EPCs está presente durante la mayoría de los pasos de voltaje.

Los EPC invirtieron un positivo a unos seis milivoltios positivos. Este registro se llevó a cabo en presencia de tetra a toxina para bloquear las corrientes de sodio dependientes de voltaje sin el bloqueador Las corrientes internas de sodio de activación rápida también habrían aparecido en el registro e identificado el registro como un registro de fibra aferente. Tenga en cuenta la corriente interna que se activa lentamente a voltajes hiperpolarizantes.

Esta corriente no está presente en las células ciliadas internas ni en las células de soporte y proporciona una buena indicación de que la grabación proviene de una fibra aferente. Estas grabaciones muestran las relaciones de voltaje de corriente para una célula ciliada interna. La flecha apunta a las corrientes de potasio de salida que se activan rápidamente a potenciales positivos.

A estas les siguen las corrientes de potasio rectificadoras retardadas debido a un diámetro de pipeta estrecho y una alta resistencia de acceso. Las corrientes internas de las células ciliadas que se muestran aquí son más pequeñas de lo esperado para obtener registros precisos de las corrientes internas de las células ciliadas. Se deben utilizar pipetas con resistencias de acceso más bajas.

Sin embargo, las grabaciones presentadas aquí demuestran que las relaciones de voltaje de corriente de las células ciliadas internas y las fibras aferentes se pueden distinguir claramente. Esta figura muestra las corrientes sinápticas registradas desde una fibra aferente. Tenga en cuenta el tamaño y la forma variables de los EPC.

Las grabaciones se realizaron a temperatura ambiente con tetra toin aplicado para bloquear las corrientes de sodio dependientes de voltaje. Esta figura muestra grabaciones simultáneas de una célula ciliada interna y una batuta aferente de contacto. Se utilizó un paso de voltaje para despolarizar la célula ciliada interna y, en respuesta, se registraron corrientes de calcio hacia adentro desde la célula ciliada interna, la entrada de calcio da como resultado la liberación de neurotransmisores y EPC activados en el bastón aferente.

Tenga en cuenta la depresión sináptica que aparece durante una despolarización interna de células ciliadas de 50 milisegundos mientras se intenta este procedimiento. Es importante recordar que se debe tener cuidado con la disección y la preparación del tejido coclear y que hay que ser paciente y optimista cuando se intenta registrar desde terminales aferentes.